CN116024311A - 一种检测副溶血弧菌的双靶标引物组、试剂盒和检测体系及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了细菌一种检测副溶血弧菌的双靶标引物组、试剂盒和检测体系及方法，涉及细菌可视化检测技术领域。本发明分别以TDH和TRH基因为靶点，基于CRISPR/Cas12a，开发了一种针对副溶血性弧菌的新型检测方法，该方法灵敏度高，特异性强，耗时短，且结果可在蓝光下肉眼判读，适于现场快速筛查或检测。

Description

一种检测副溶血弧菌的双靶标引物组、试剂盒和检测体系及方法

技术领域

本发明属于细菌可视化检测技术领域，具体涉及一种检测副溶血弧菌的双靶标引物组、试剂盒和检测体系及方法。

背景技术

近年来，副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)已被列为导致食源性疾病最主要的细菌之一，其广泛存在于海水，淤泥以及鱼、虾、蟹、贝类等海产品中。误食携带副溶血性弧菌的海产品容易引发食源性中毒。此外，副溶血性弧菌的暴发可在短时间内导致大量养殖海产死亡，造成巨额经济损失。自1950年被首次发现于日本以来，在世界各地均出现了副溶血性弧菌的散发或暴发流行，其已经成为全球性的公共卫生问题，对人类身体健康及生命财产安全都构成了严重威胁。

传统的副溶血弧菌的检测方法主要有分离鉴定法、免疫检测法和核酸检测法。但分离鉴定法因其检测周期长、工作量大、对工作人员实验技能要求高等弊端限制了其应用范围；免疫检测法特异性强，但对试剂的选择性高且灵敏度较低；传统的PCR扩增技术由于要设置不同的温度阶段实现扩增，对实验设备要求较高，因此，其更多的被用于实验室研究，而面对现场快速筛选或检测，则没有对应的市售产品。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测副溶血弧菌的双靶标引物组、试剂盒和检测体系及方法，开发一种针对副溶血性弧菌的新型可视化检测方法，该方法灵敏度高，特异性强，耗时短，适于现场快速筛查或检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测副溶血弧菌的双靶标引物组，以副溶血弧菌的TDH基因和TRH基因为靶标，根据所述靶标的靶点序列设计RPA引物。

优选的，所述TDH基因的靶点序列如SEQ ID NO.1所示，所述TRH基因的靶点序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，针对TDH的靶点序列设计的RPA引物组选自F1和R1的组合，或F2和R2的组合；

针对TRH的靶点序列设计的RPA引物组选自F3和R3的组合，或F4和R4的组合，或F5和R5的组合；

所述F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述F4的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述R4的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述F5的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述R5的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明提供了一种检测副溶血弧菌的体系，包括利用上述双靶标引物组扩增得到的产物，Cas12a蛋白和针对所述靶标的靶点序列设计的CrRNA。

优选的，所述针对TDH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.13所示，针对TRH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.14所示。

优选的，每个靶标配制一个体系。

本发明还提供了一种双靶标检测副溶血弧菌的可视化试剂盒，包括上述双靶标引物组、针对所述靶标的靶点序列设计的CrRNA和Cas12a蛋白。

优选的，针对TDH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.13所示，针对TRH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明还提供了一种双靶标检测副溶血弧菌的可视化方法，包括以下步骤：提取食物的表面DNA，分别利用上述可视化试剂盒中的双靶标引物组进行扩增，得到扩增产物；

分别利用所述扩增产物与对应靶标的CrRNA和Cas12a蛋白配制可视化反应体系；

待反应结束后，在蓝光下测试荧光，根据是否产生荧光判定检测样本中是否含有副溶血弧菌。

优选的，两个可视化反应体系中的任意一个，在反应结束后，在蓝光下有荧光产生，则判定为样本中含有副溶血弧菌。

有益效果：本发明以副溶血弧菌中2个重要的毒力因子：耐热直接溶血素(TDH)和相对耐热直接溶血素(TRH)的编码基因共同作为检测靶点，基于CRISPR/Cas12a，开发了一种针对副溶血性弧菌的新型检测方法，该方法灵敏度高，特异性强，耗时短，且结果可在蓝光下肉眼判读，适于现场快速筛查或检测。

附图说明

图1为针对TDH基因的引物对F1/R1和F2/R2的扩增产物电泳图；图中M：DL2000 DNAMarker；1：以1μM质粒为模板的F1/R1阳性结果；2：以超纯水为模板的F1/R1阴性对照；3：以1μM质粒为模板的F2/R2阳性结果；4：以超纯水为模板的F2/R2阴性对照；

图2为针对TRH基因的引物对F3/R3、F4/R4和F5/R5的扩增产物电泳图；图中M：DL2000 DNA Marker；1：以1μM质粒为模板的F3/R3阳性结果；2：以超纯水为模板的F3/R3阴性对照；3：以1μM质粒为模板的F4/R4阳性结果；4：以超纯水为模板的F4/R4阴性对照；5：以1μM质粒为模板的F5/R5阳性结果；6：以超纯水为模板的F5/R5阴性对照；

图3为Cas12a核心切割体系针对不同浓度靶标质粒的灵敏度测试；

图4为RPA-CRISPR蓝光法针对TDH基因的灵敏度测试(F1/R1)；图中A：孵育时间5～30min的肉眼观测结果；B：孵育时间5min的数据量化结果；

图5为RPA-CRISPR蓝光法针对tdh基因的灵敏度测试(F2/R2)；图中A：孵育时间5～30min的肉眼观测结果；B：孵育时间10min的数据量化结果；

图6为RPA-CRISPR荧光定量PCR仪法针对TDH基因的灵敏度测试；

图7为RPA-CRISPR蓝光法针对TRH基因的灵敏度测试(左F3/R3、右F4/R4)；

图8为RPA-CRISPR蓝光法针对TRH基因的灵敏度测试(F5/R5)；图中A：孵育时间5～30min的肉眼观测结果；B：孵育时间10min的数据量化结果；

图9为RPA-CRISPR荧光定量PCR仪法针对TRH基因的灵敏度测试；

图10为RPA-CRISPR方法的特异性测试；

图11为定量PCR方法检测细菌样本；图中A：TDH基因；B：TRH基因；

图12为RPA-CRISPR蓝光法检测细菌样本；图中A：TDH基因；B：TRH基因；

图13为RPA-CRISPR荧光定量PCR仪法检测细菌样本；图中A：TDH基因；B：TRH基因；

图14为RPA-CRISPR法针对细菌培养液的灵敏度测试；

图15为RPA-CRISPR蓝光法检测加标食品样本；图中S2-S10为5中检出的7份阳性菌样。

具体实施方式

本发明提供了一种检测副溶血弧菌的双靶标引物组，以副溶血弧菌的TDH基因和TRH基因为靶标，根据所述靶标的靶点序列设计RPA引物。

本发明所述靶标优选通过筛选得到，包括在NCBI数据库中分别搜索并下载20份来自不同菌株的TDH和TRH基因的FASTA序列，使用序列比对软件MEGA 7.0分别对上述序列进行比对分析以筛选出两种基因的共有保守序列，其中TDH基因的保守序列如SEQ ID NO.15所示(TATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTTTAATACCCAAGCTCCGGTCAATGTAAAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACGAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGTTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGAGCGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAACTTCAACATTCCTATAATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGGTTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGT)，TRH基因的保守序列如SEQ ID NO.16所示(ATGAAACTAAAACTCTACTTTGCTTTCAGTTTGCTATTGGTTTCAATGTTTTCAGTATCTAAATCATTCGCGATTGATCTGCCATCAATACCTTTTCCTTCTCCAGGTTCGGCTGAACTGTTATTTGTTGTTAGAAATACAACAATCAAAACTGAATCCCCGGTTAAGGCAATTGTGGAGGACTATTGGACAAACCGAAACATAAAAAGAAAACCATACAAAGATGTATACGGTCAATCGGTTTTCACAACAGCAGGTTCAAAGTGGTTAAGCGCCTATATGACAGTAAACATCAATGGTCATAACTATACGATGGCAGCTCTTTCTGGTTATAAAGATGGTATTTCTACGGTCTTCACAAAATCAGAGAAAACAAGCCTAAAGCAAGACTATTCCTCGGTAAAGTCTTTTGTTGATGACAGCGAAGAATCAATACCAAGTATAACTTATTTAGATGAAACATCAGAATACTTTGTTACTGTCGAGGCATATGAGAGCGGCAATGGACATATGTTTGTTATGTGCATTTCCAACAAATTATCATTTGGTGAATGTAAATCACAAATTTAA)。

根据Cas12a可以识别富含T的PAM序列的特性，本发明分别在SEQ ID NO.15和SEQID NO.16的序列中选取长度为20bp，并且符合条件的序列，作为检测靶点，其中所述TDH基因的靶点序列如SEQ ID NO.1所示(TGGTCAATCAGTATTCACAA)，所述TRH基因的靶点序列如SEQ ID NO.2所示(TGGTTATAAAGATGGTATTT)。

本发明优选针对TDH的靶点序列设计了两组RPA引物组，分别为F1和R1的组合(简称F1/R1)，和F2/R2，更优选为F1/R1；同时针对TRH的靶点序列，设计了三组RPA引物组，分别为F3/R3、F4/R4和F5/R5，更优选为F5/R5。本发明将上述5组RPA引物组列于表1中。

表1RPA引物序列

本发明提供了一种检测副溶血弧菌的体系，包括利用上述双靶标引物组扩增得到的产物，Cas12a蛋白和针对所述靶标的靶点序列设计的CrRNA。

本发明所述CrRNA的设计规则包括：Cas12a的scaffold序列(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU)+20bp靶序列，尽量选择二级结构较少的靶序列进行设计，且crRNA序列本身也应避免产生发卡结构以增加其与靶序列的结合能力，基于此原则，本发明针对TDH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.13所示(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGUCAAUCAGUAUUCACAA)，针对TRH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.14所示(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGUUAUAAAGAUGGUAUUU)。

在本发明中，利用所述体系检测副溶血弧菌时，优选一个靶标配制一个体系，且所述体系相同。本发明所述体系中包括双靶标引物组扩增得到的产物，所述扩增的体系优选按照TwistAmp Basic kit的说明进行，具体包括：每个反应配制复水混合液如下：上下游引物(10μM)各2.4μL，Primer Free Rehydration buffer 29.5μL，模板与无酶水共13.2μL。将47.5μL的上述溶液转移至脱水试剂中，混匀后加入280mM magnesium acetate(MgOAc)2.5μL以启动反应。置于PCR仪中于39℃孵育20min。扩增后产物需经纯化，根据天根普通DNA产物纯化试剂盒的说明进行即可。

本发明所述体系中还包括Cas12蛋白，所述Cas12蛋白的获得方法并没有特殊限定，优选购自NEB公司。

本发明所述检测副溶血弧菌的体系，优选包括：50nM LbCas12a、50nM crRNA、100nM ssDNA reporter、2μL NEBuffer 2.1和2μL DNA模板，总体积20μL。本发明在配制完成所述体系后，优选于37℃条件下进行反应，每5min在蓝光条件下观察一次，直到荧光出现。在本发明中，Cas12a可以在crRNA的介导下靶向结合目标DNA，进而激活非特异的单链DNA反式切割活性。

本发明所述ssDNA reporter(单链DNA报告系统)，优选包括：5'-6FAM-TTATTT-BHQ1-3'、5'-6FAM-TTATTT-TRAMA-3'或5'-HEX-TTATTT-IABkFQ-3'。

本发明还提供了一种双靶标检测副溶血弧菌的可视化试剂盒，包括上述双靶标引物组、针对所述靶标的靶点序列设计的CrRNA和Cas12a蛋白。

本发明所述可视化试剂盒中优选还包括上述ssDNA reporter，且优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了一种双靶标检测副溶血弧菌的可视化方法，包括以下步骤：提取食物的表面DNA，分别利用上述可视化试剂盒中的双靶标引物组进行扩增，得到扩增产物；

分别利用所述扩增产物与对应靶标的CrRNA和Cas12a蛋白配制可视化反应体系；

待反应结束后，在蓝光下测试荧光，根据是否产生荧光判定检测样本中是否含有副溶血弧菌感染。

本发明对所述DNA的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规CTAB法或试剂盒法进行提取即可。本发明以提取得到的DNA为模板，分别与上述RPA引物对进行扩增，其扩增程度和体系优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明分别利用上述扩增得到的产物配制可视化反应体系，且所述反应体系优选与上述相同，在此不再赘述。

在本发明中两个可视化反应体系中的任意一个，在反应结束后，在蓝光下出现荧光，则判定为含有副溶血弧菌。

下面结合实施例对本发明提供的一种检测副溶血弧菌的双靶标引物组、试剂盒和检测体系及方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、五对RPA引物验证

委托上海生工生物工程有限公司构建副溶血性弧菌质粒标准品作为模板，同时合成表1所示引物，建立标准RPA扩增体系以对五对RPA引物进行验证。

针对TDH基因，以1μM质粒标准品为模板，分别利用F1/R1(预期产物213bp)，F2/R2(预期产物247bp)进行RPA扩增反应；针对TRH基因，以同样浓度的质粒标准品为模板，分别利用F3/R3(预期产物215bp)，F4/R4(预期产物228bp)和F5/R5(预期产物233bp)进行RPA扩增反应。扩增流程按照TwistAmp Basic kit的说明进行即可。扩增后产物需经根据天根普通DNA产物纯化试剂盒纯化。将扩增产物纯化后，配制1.5％琼脂糖凝胶，电压＝100V，电流I＝80mA，时间T＝30min，电泳检测，通过凝胶成像仪观察结果并测序。

结果如图1和图2所示，针对TDH基因的两对引物均成功地扩增出符合预期的条带；针对TRH基因的三对引物均成功地扩增出符合预期的条带。

2、Cas12a核心切割体系的建立及灵敏度测试

Cas12a可以在crRNA的介导下靶向结合dsDNA，进而激活非特异的ssDNA反式切割活性。将TDH，TRH基因的质粒标准品分别稀释至浓度为1000nM、100nM、10nM和1nM后，构建针对副溶血性弧菌的核心切割体系：50nM Cas12a，62.5nM crRNA，50nM ssDNAreporter以及模板，总体积为20μL，核心切割反应需在特定的反应缓冲液中进行(20mM Tris-HCl，pH7.5，100mM KCl，5mM MgCl₂，1mM DTT，1％glycerol)。将体系配制好后置于荧光定量PCR仪中，FAM通道检测荧光信号，条件设置为37℃进行15s，37℃进行45s(收集荧光)，共120个循环，每个浓度设置三个复孔。

结果如图3所示：两种基因的荧光信号显示出相同的趋势，1000nM、100nM、10nM样本的荧光信号均与阴性对照有极其显著的统计学差异(P<0.001)，而1nM样本的荧光信号与阴性对照无统计学差异，这说明Cas12a切割体系检测限为10nM；而1000nM、100nM样本的荧光信号高于10nM样本，这说明随着样本浓度的降低，Cas12a与crRNA结合成的复合物对靶标的捕捉也更为困难，更少的Cas12a反式切割活性激活，导致荧光信号较低。

3、RPA-CRISPR方法的建立与灵敏度测试

将TDH基因的质粒标准品稀释至浓度为10^-12M、10^-13M、10^-14M、10^-15M、10^-16M、10^-17M和10^-18M，分别使用引物对F1/R1和F2/R2对不同稀释浓度的质粒样本进行扩增；

对TRH基因的质粒标准品进行同样的稀释操作，分别使用引物对F3/R3，F4/R5和F5/R5对不同稀释浓度的质粒样本进行扩增。

设置两种检测结果的可视化方案，分别为蓝光下肉眼观测法与荧光定量PCR仪法：荧光定量PCR仪法每个反应体系包含50nM Cas12a，62.5nM crRNA，50nM ssDNA reporter，10μL扩增产物，补充无酶水至20μL。将体系配制好后置于荧光定量PCR仪中，FAM通道检测荧光信号，条件设置为37℃进行15s，37℃进行45s(收集荧光)，共120个循环。

蓝光下肉眼观测法每个反应体系包含125nM Cas12a，156.25nM crRNA，625nMssDNA reporter，补充扩增产物至20μL。将体系配制好后置于PCR仪中，于37℃孵育30min后置于蓝光凝胶成像仪中进行观察并拍照。若结果为阳性，即可用肉眼观察到强烈的绿色荧光，也可以用ImageJ软件对荧光强度进行量化。

针对TDH基因，使用引物对F1/R1可检出浓度低至10^-18M的质粒模板，且对照片上的荧光强度进行量化后发现，将F1/R1的扩增产物加入体系孵育5min后，即可观察到区别于空白对照的绿色荧光；而使用引物对F2/R2同样可以检出相同浓度的质粒模板，但需要将其扩增产物加入体系孵育10min后，才能观察到与空白对照的区别。此外，荧光定量PCR仪法的结果显示，对于F1/R1，10^-18M样本的荧光信号明显高于空白对照，两者具有极其显著的统计学差异(P<0.001)；而对于F2/R2，10^-17M样本的荧光信号略高于空白对照，两者有统计学差异(P<0.05)，但10^-18M样本的荧光信号与空白对照相比，无统计学差异。结合两种方法的结果，F1/R1有着比F2/R2更加优异的性能，在接下来的实验中，本发明将使用F1/R1对样本中的TDH基因进行检测(图4，图5，图6)。

针对TRH基因，将F3/R3，F4/R4的扩增产物加入体系孵育30min后，也仅能检出10^{- 17}M的质粒模板；而F5/R5则可以成功检出10^-18M的质粒模板，数据量化后，发现需要将其产物加入体系孵育10min后，可以显示出与空白对照的区别。虽然荧光定量PCR仪法的结果显示，对于F4/R4，10^-18M样本的荧光信号高于空白对照，两者有统计学差异(P<0.01)；但是对于F5/R5，10^-18M样本的荧光信号与空白对照相比，具有更大的差值，两者有极其显著的统计学差异(P<0.0001)。综上所述，与F3/R3，F4/R4相比，F5/R5有着更高的扩增效率，所以在接下来的实验中，本发明将使用F5/R5对样本中的TRH基因进行检测(图7，图8，图9)。

4、RPA-CRISPR方法的特异性测试

使用副溶血性弧菌、霍乱弧菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌共七种致病微生物对该方法的特异性进行测试。将上述菌株接种至5mL LB培养基中，置于恒温培养箱中37℃摇匀过夜。取1～5mL菌液，按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒的说明进行核酸提取。

分别以其基因组DNA为模板，按照3所示方法对RPA-CRISPR方法的特异性进行验证。

使用RPA-CRISPR荧光定量PCR仪法对该方法进行特异性测试，结果如图10所示，副溶血性弧菌样本的荧光值显著高于其他菌种，而其他菌种的荧光信号为基底信号，与阴性对照相比，没有统计学差异。以上结果说明：该方法可以准确检出副溶血性弧菌样本，特异性良好，不会与其他种类细菌发生交叉反应。

定量PCR法将作为金标准，对RPA-CRISPR法检测菌样的结果进行验证，将Ct小于38作为判定检测结果为阳性的标准。结果如图11所示，针对TDH基因，2号、6号、7号、9号和10号样本的Ct值小于38，而其他样本的Ct值则大于38，这说明2号、6号、7号、9号和10号样本为TDH基因阳性，其他样本为阴性；针对TRH基因，5号、6号、7号、8号、9号和10号样本的Ct值小于38，而其他样本的Ct值则大于38，这说明5号、6号、7号、8号、9号和10号为TRH基因阳性，其他样本为阴性。

5、RPA-CRISPR方法检测细菌样本

以4中提及的10份疑似副溶血性弧菌样本的基因组DNA为模板，按照3所示方法，分别针对TDH和TRH基因进行检测。

蓝光下肉眼观测法的结果如图12所示，在对TDH基因的检测中，2号、6号、7号、9号和10号的样品管中出现强烈的绿色荧光，而其他样本则无荧光出现；在对TRH基因的检测中，5号、6号、7号、8号、9号和10号的样品管中出现强烈的绿色荧光，而其他样本则无荧光出现。

荧光定量PCR仪法的结果如图13所示，在对TDH基因的检测中，2号、6号、7号、9号和10号的荧光信号显著高于其他样本，其中2号、6号和9号样本与阴性对照相比，有极其显著的统计学差异(P<0.001)，而7号和10号与阴性对照相比，有显著的统计学差异(P<0.01)。其他五份样本的荧光值与阴性对照相比没有统计学差异。在对TRH基因的检测中，5号、6号、7号、8号、9号和10号的荧光信号显著高于其他样本，其中5号、7号和10号样本与阴性对照相比，有极其显著的统计学差异(P<0.001)，而6号、8号和9号与阴性对照相比，有显著的统计学差异(P<0.01)。其他四份样本的荧光值与阴性对照相比没有统计学差异。

以上结果说明两种可视化方案能够互相验证：在10份菌样中，检出阳性菌样7份，分别为：2号、5号、6号、7号、8号、9号和10号；阴性菌样3份，分别为：1号、3号和4号；其中TDH基因阳性菌样有5份，分别为：2号、6号、7号、9号和10号；TRH基因阳性菌样有6份，分别为：5号、6号、7号、8号、9号和10号。以上结果与定量PCR方法一致，说明检测结果可信。而导致这种结果的原因则可能是不同来源的菌株对于两种毒力基因的携带率差异较大。

6、RPA-CRISPR方法针对细菌培养液的灵敏度测试

为了测试该方法的实用能力，选取两种基因检测结果均为阳性的6号样本，将其培养液进行梯度稀释至浓度为10⁶CFU/g、10⁵CFU/g、10⁴CFU/g、10³CFU/g、10²CFU/g和10¹CFU/g。分别使用筛选出的引物对F1/R1和F5/R5，按照3所示方法，针对两种基因对不同浓度的菌液样本进行检测。

结果如图14所示，在对TDH基因的检测中，在浓度为10⁶CFU/g、10⁵CFU/g、10⁴CFU/g、10³CFU/g和10²CFU/g的样品管中，可以观测到区分于阴性对照的荧光信号，且随着浓度下降，荧光强度渐弱，而浓度为10¹CFU/g的样本管中则无明显荧光出现；用荧光定量PCR仪法也可以得到类似结果。这说明，对于TDH基因，该方法可以成功检出浓度低至10²CFU/g细菌悬液，对TRH基因的检测结果显示，该方法同样具有相似的灵敏度。

7、RPA-CRISPR方法检测加标食品样本

将购于天津当地超市的鲜虾进行去头处理，并在75％乙醇中浸泡2min去污，以排除其他微生物的干扰。用无菌水清洗后，将其放置在生物安全柜中，紫外照射30min。对处理过的虾进行取样和检测，以排除副溶血性弧菌预先污染的可能性。根据前期结果，选取2号、5号、6号、7号、8号、9号和10号样本，分别用PBS配制浓度为10²CFU/g的细菌悬液。随后，将无菌虾放置在菌液中室温孵育30min，然后将其转移至洁净的平板中，在生物安全柜中再放置30min，以促进细菌的附着。接着，用一次性棉签对虾的表面进行擦拭，采集样本。然后，将棉签放入1.5mL离心管中，加入200μL超纯水对副溶血性弧菌进行洗脱。采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取后，分别以其基因组DNA为模板，按照3所示方法，分别针对tdh，trh基因进行检测。由于蓝光下肉眼观测法操作便捷且耗时短，在这里选用该方法进行后续检测。

结果如图15所示，该方法对加标样本中两种基因的检测结果与直接对菌液检测没有差异。由此，RPA-CRISPR法可以用于对食品样本中的副溶血性弧菌进行检测，具有良好的实用性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测副溶血弧菌的双靶标引物组，其特征在于，以副溶血弧菌的TDH基因和TRH基因为靶标，根据所述靶标的靶点序列设计RPA引物。

2.根据权利要求1所述双靶标引物组，其特征在于，所述TDH基因的靶点序列如SEQ IDNO.1所示，所述TRH基因的靶点序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述双靶标引物组，其特征在于，针对TDH的靶点序列设计的RPA引物组选自F1和R1的组合，或F2和R2的组合；

针对TRH的靶点序列设计的RPA引物组选自F3和R3的组合，或F4和R4的组合，或F5和R5的组合；

所述F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述F4的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述R4的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述F5的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述R5的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.一种检测副溶血弧菌的体系，其特征在于，包括利用权利要求1～3任一项所述双靶标引物组扩增得到的产物，Cas12a蛋白和针对所述靶标的靶点序列设计的CrRNA。

5.根据权利要求4所述体系，其特征在于，所述针对TDH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.13所示，针对TRH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.14所示。

6.根据权利要求4或5所述体系，其特征在于，每个靶标配制一个体系。

7.一种双靶标检测副溶血弧菌的可视化试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述双靶标引物组、针对所述靶标的靶点序列设计的CrRNA和Cas12a蛋白。

8.根据权利要求7所述可视化试剂盒，其特征在于，针对TDH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.13所示，针对TRH的靶点序列设计的CrRNA序列如SEQ ID NO.14所示。

9.一种双靶标检测副溶血弧菌的可视化方法，其特征在于，包括以下步骤：提取食物的表面DNA，分别利用权利要求7或8所述可视化试剂盒中的双靶标引物组进行扩增，得到扩增产物；

分别利用所述扩增产物与对应靶标的CrRNA和Cas12a蛋白配制可视化反应体系；

待反应结束后，在蓝光下测试荧光，根据能否产生荧光判定检测样本中是否含有副溶血弧菌。

10.根据权利要求9所述可视化方法，其特征在于，两个可视化反应体系中的任意一个，在反应结束后，在蓝光下有荧光产生，则判定为检测样本中含有副溶血弧菌。

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