CN101153341B - 诺如病毒gⅱ型检测用引物、检测方法、检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。一种诺如病毒GII型检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为诺如病毒GII型的衣壳蛋白---GenBank登陆号：X86557，所述引物与所述靶基因的5095位---5319位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对诺如病毒GII型特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在诺如病毒GII型特定基因片段，进而确定标本中是否存在诺如病毒GII型。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalampl ification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩增法检测诺如病毒G II型的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌以及E.coli O157:H7，轮状病毒以及诺如病毒G II型引起的食物中毒，其发病率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。
目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌PR72H序列的特异性，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术(国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩增法检测诺如病毒GII型的检测方法和检测试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的引物。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种诺如病毒G II型检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为诺如病毒G II型的衣壳蛋白---GenBank登陆号：X86557，所述引物与所述靶基因的5095位---5319位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
本发明的另一个目的在于，提供一种对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的引物组。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种诺如病毒G II型检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物F3-G II CGTCGAATGACGCCAACC
反向外引物B3-G II CGCTCCACAGTATCTCACCT
正向内引物FIP-G IICGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG反向内引物BIP-G II
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA
可以扩增诺如病毒G II型的衣壳蛋白(X86557)基因序列的5095位---5319位的核酸序列的一部分或其互补链。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述引物组还可以包括：
正向环引物LF-G II TTATTGACCTCTGGGACGAGG
反向环引物LB-G II GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增法检测诺如病毒G II型的检测方法。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种诺如病毒G II型的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在诺如病毒G II型，其特征在于，以诺如病毒G II型的衣壳蛋白(X86557)基因序列的5095位---5319位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。
具体检测方法为：
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于细胞培养上清液、粪便、呕吐物等病毒待检标本；取粪便、腹泻物用适量生理盐水稀释，离心取上清液用于RNA抽提(QIAamp Viral RNAMini Kit)；
2)诺如病毒G II型的环介导等温扩增(LAMP)
取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul～100ul的反应体系，混匀点离后在约65℃条件下恒温保温约60--90分钟，然后置于80℃的环境下2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积20ul～100ul)：
3)LAMP反应产物的检测：
A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，
B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I(invitrogen)1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，
C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在180bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述扩增反应液还可以包括：
正向环引物LF-G II 0.6-1.0uM
反向环引物LB-G II 0.6-1.0uM
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增法检测诺如病毒G II型的检测试剂盒。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种诺如病毒G II型检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上述引物或引物组的扩增反应液、酶。
所述扩增反应液中包括如下试剂：
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
所述酶为包括，每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单位的AMV反转录酶。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述扩增反应液还可以包括：
正向环引物LF-G II 0.6-1.0uM
反向环引物LB-G II 0.6-1.0uM
所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为诺如病毒G II型基因组cDNA(1～100nM)。
本发明通过提供一种对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在诺如病毒G II型特定基因片段，进而确定标本中是否存在诺如病毒G II型。本发明检测试剂和检测方法具有敏感性高、特异性强、方便快捷、不需特殊仪器、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，与现有的PCR方法相比具有特异性强、敏感性比PCR高或相当、比PCR省时约2小时、不需特殊仪器(扩增反应在水浴锅中即可完成)等优点。
附图说明
图1本发明所述引物组合进行环介导等温扩增(LAMP)后通过肉眼观察的结果。图例：1、阳性扩增结果；2、阴性扩增结果。
图2本发明所述引物组合进行环介导等温扩增(LAMP)后加入染料观察的结果。图例：1、阴性扩增结果；2，3、阳性扩增结果。
图3本发明所述引物组合进行环介导等温扩增(LAMP)结果的电泳图；
图例：1：100bp marker；3-6：分别为诺如病毒G II病毒标本；7-8：分别为轮状病毒A组G 1和G 3型毒株(标准毒株)对照。
具体实施方式
下面通过具体的诺如病毒G II型检测过程来对本发明进行说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例一对已知诺如病毒G II病毒标本衣壳蛋白基因的扩增
一)引物组的设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出诺如病毒G II型特异性衣壳蛋白基因的5095---5319bp核酸序列，针对该片段的六个位点(这六个位点分别：5095-5112bp、5113-5130bp、5158-5178bp、5207-5228bp、5267-5286bp、5300-5319bp)设计出LAMP引物并合成，得到如下的引物。引物设计通过LAMP专用引物设计软件结合分子生物学分析软件Advance Vector NTI完成。
序列编号1
正向外引物F3-G II CGTCGAATGACGCCAACC
序列编号2
反向外引物B3-G II CGCTCCACAGTATCTCACCT
序列编号3
正向内引物FIP-G II CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG
序列编号4
反向内引物BIP-G II
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA
所述6个位点的序列分别为：
5095-5112bp：cgtcgaatgacgccaacc
5113-5130bp catctgatgggtccgcag
5158-5178bp aggttatggctctggagcccg
5207-5228bp ggcgggccaacaaaacgtaatt
5267-5286bp tgga gagttcacagtgtccc
5300-5319bp aggtgagatactgtggagcg
其中，
所述正向外引物F3：扩增始于5095-5112bp(cgtcgaatgacgccaacc)；
所述正向内引物FIP：扩增始于5158-5178bp(aggttatggctctggagcccg)的互补序列和5113-5130bp(catctgatgggtccgcag)；
所述反向外引物B3：扩增始于5300-5319bp(aggtgagatactgtggagcg)的互补序列；
反向内引物BIP：扩增始于5207-5228bp(ggcgggccaacaaaacgtaatt)和5267-5286bp(tggagagttcacagtgtccc)的互补序列。
上述引物组中各引物的共性在于：与诺如病毒G II型特异性基因衣壳蛋白的5095---5319bp核酸序列互补。
二)本实施例实验的毒株与各毒株的扩增结果如下表一
表一(为了便于理解，本申请人将下列序号与图1中编号设置成一致)
| 序号 | 分子量标准品及扩增产物 | 结果 |
| 1 | 100bp marker | |
| 2 | 阳性扩增产物酶切鉴定 | 符合理论预测 |
| 3 | 诺如病毒G II型阳性标本(经荧光-PCR验证) | 阳 |
| 4 | 诺如病毒G II型阳性标本(经荧光-PCR验证) | 阳 |
| 5 | 诺如病毒G II型阳性标本(经荧光-PCR验证) | 阳 |
| 6 | 诺如病毒G II型阳性标本(经荧光-PCR验证) | 阳 |
| 7 | 轮状病毒A组G 1型(Wa标准株) | 阴 |
| 8 | 轮状病毒A组G 3型(W178标准株) | 阴 |
上述供试毒株部分为标准毒株，购自中国典型培养物保藏中心；部分为检测毒株标本(经深圳太太基因荧光PCR试剂盒验证)由本申请人保存。“阴”表示无扩增反应，“阳”表示有扩增反应。
三)上述各毒株基因RNA的提取
取细胞培养上清液、粪便、腹泻物用适量生理盐水稀释，离心取上清液用于RNA抽提(QIAamp Viral RNA Mini Kit)。
四)基于LAMP法的基因扩增
取扩增反应液14.6ul，加2.0ul待检模板，加1ul的聚合酶和0.5ul的反转录酶，再加6.9ul ddH2O，形成如下表总体积为25ul的反应体系，在温度为65℃的恒温水浴锅保温约90分钟，然后置于80℃、2分钟灭活酶。
反应体系为：(反应总体积为25ul)
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液：包含10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、3.6mM硫酸镁、1.6uM正向内引物FIP-G II、1.6uM反向内引物BIP-G II、0.2uM的正向外引物F3-G II、0.2uM的反向外引物B3-G II、1.4mM dNTP和1M甜菜碱(betaine)；
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
酶：每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单位的AMV反转录酶。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定的反应体积。
五)扩增产物的检测
随着扩增反应的进行，从dNTP析出的焦磷酸根离子和反应液中存在的镁离子将形成焦磷酸镁沉淀。因此，只有在发生核酸扩增的反应液中才会出现白色浑浊。这样可以通过如下方式进行判断。
A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；(参见图1)或，
B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I(invitrogen)1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；(参见图2)或，
C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在180bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。(参见图3)
经对扩增产物的检测，表明上述引物组只对诺如病毒G II型阳性标本出现LAMP扩增反应，对照毒株未出现扩增反应，显示了良好的特异性。
6)灵敏度比较：
以诺如病毒G II型阳性标本为检测毒株，将所提RNA反转录成cDNA后做一系列稀释：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别用LAMP方法和PCR方法(上下游引物分别为F3-G II、B3-G II)来检测，检测结果表明LAMP反应敏感性达10-4；PCR反应敏感性达10-3；结果显示LAMP反应敏感性比PCR反应敏感10倍。
实施例二
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增阶段，为了加快扩增反应速度，在所述扩增反应液还包括有：
序列编号5
正向环引物LF-G II TTATTGACCTCTGGGACGAGG
序列编号6
反向环引物LB-G II GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG
此时：
所述正向环引物LF-G II：扩增始于5135-5155bp(cctcgtcccagaggtcaataa)的互补序列；
所述反向环引物LB-G II：扩增始于5242-5265bp
(gaaacaattttgtacaagcccctg)
此时反应体系为：(反应总体积为25ul)
在加入上述正向环引物LF-G II和反向环引物LB-G II后只需在温度为65℃的恒温水浴锅保温约60分钟，然后置于80℃、2分钟灭活酶。
实施例三
本实施例与实施例二的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：
反应体系为：(反应总体积为25ul)
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液：包含10×BstDNAPolymerase Buffer反应缓冲液、2mM硫酸镁、1.0uM正向内引物FIP-G II、1.0uM反向内引物BIP-G II、0.15uM的正向外引物F3-G II、0.15uM的反向外引物B3-G II、1.0mM dNTP、0.6uM正向环引物LF-G II、0.6uM反向环引物LB-G II和0.8M甜菜碱(betaine)；其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM PH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
酶：每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单位的AMV反转录酶。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定的反应体积。
反应条件：在温度为60℃的恒温水浴锅保温约75分钟，然后升温至80℃、2分钟灭活酶。
实施例四
本实施例与实施例二的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：
反应体系为：(反应总体积为25ul)
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。扩增反应液A：包含10×Bst DNAPolymerase Buffer反应缓冲液、6mM硫酸镁、2.0uM正向内引物FIP-G II、2.0uM反向内引物BIP-G II、0.3uM的正向外引物F3-G II、0.3uM的反向外引物B3-G II、1.6mM dNTP、1.0uM正向环引物LF-G II、1.0uM反向环引物LB-G II和1.5M甜菜碱(betaine)。
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100。
酶：每微升含16个活性单位的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单位的AMV反转录酶。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定的反应体积。
反应条件：在温度为65℃的恒温水浴锅保温约60分钟，然后置于80℃、2分钟灭活酶。
实施例五从腹泻物中分离的毒株的检测
毒株基因DNA的提取及扩增、检测
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于细胞培养上清液、粪便、呕吐物等病毒待检标本；取粪便、腹泻物用适量生理盐水稀释，离心取上清液用于RNA抽提(QIAamp Viral RNAMini Kit)；
对上述提取的RNA与实施例一同样的通过LAMP法进行核酸扩增并对扩增产物的进行检测及酶切鉴定。扩增结果与阳性扩增产物的酶切鉴定结果之比较，如下表二。
| 序号 | LAMP检测 | 扩增产物的酶切鉴定 |
| 粪便样品1 | 阳性 | 符合理论预测 |
| 粪便样品2 | 阳性 | 符合理论预测 |
基于阳性扩增产物的酶切鉴定
将LAMP检测为阳性的扩增产物进行酶切鉴定：靶基因序列上含限制性内切酶Hae III位点，位于5211-5214bp，用Hae III来酶切LAMP阳性扩增产物，结果显示酶切片断有3个，分别为155bp、121bp、90bp大小，与理论预测值相符(参见电泳图3第2道)，因而确定阳性扩增为特异性扩增。
如表二所示，阳性扩增产物的酶切鉴定符合理论预测片段大小及片段数，只有检测标本的LAMP特异性扩增才观察到上述结果。
序列表
<110>珠海市疾病预防控制中心
<120>诺如病毒G II型检测用引物、检测方法、检测试剂盒
<160>7
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<5320>
<223>引物
<400>1
CGTCGAATGACGCCAACC 18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<5320>
<223>引物
<400>2
CGCTCCACAGTATCTCACCT 20
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<5320>
<223>引物
<400>3
CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG 39
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<5320>
<223>引物
<400>4
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA 42
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<5320>
<223>引物
<400>5
TTATTGACCTCTGGGACGAGG 21
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<5320>
<223>引物
<400>6
GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG 24
<210>7
<211>225
<212>RNA
<213>诺如病毒G II型
<400>7
5095 cgtcga
5101 atgacgccaa cccatctgat gggtccgcag ccaacctcgt cccagaggtc
aataatgagg
5161 ttatggctct ggagcccgtt gttggtgccg ctattgcggc acctgtggcg
ggccaacaaa
5221 acgtaattga cccctggatt agaaacaatt ttgtacaagc ccctggtgga
gagttcacag
5281 tgtcccctag aaacgctcca ggtgagatac tgtggagcg
Claims (6)
1.一种诺如病毒GII型检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物F3-GII CGTCGAATG ACGCCAACC
反向外引物B3-GII CGCTCCACA GTATCTCACCT
正向内引物FIP-GII CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG
反向内引物BIP-GII
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA。
2.根据权利要求1所述的一种诺如病毒G II型检测用引物组，其特征在于，所述引物组还包括：
正向环引物LF-GII TTATTGACCTCTGGGACGAGG
反向环引物LB-GII GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG。
3.一种诺如病毒GII型检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有权利要求1中所述的引物组的扩增反应液、酶；
所述扩增反应液中包括如下试剂：
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
所述酶包括每微升含8个活性单位、终浓度0.16-0.64U/ul的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单位、终浓度0.4U/ul的AMV反转录酶。
4.根据权利要求3所述的一种诺如病毒GII型检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液还包括：
正向环引物LF-GII 0.6-1.0uM
反向环引物LB-GII 0.6-1.0uM。
5.根据权利要求4所述的一种诺如病毒GII型检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液，包含1/10预定反应体积的10×Bst DNA PolymeraseBuffer反应缓冲液、3.6mM硫酸镁、1.6uM正向内引物FIP-GII、1.6uM反向内引物BIP-GII、0.2uM的正向外引物F3-GII、0.2uM的反向外引物B3-GII、0.8uM正向环引物LF-GII、0.8uM反向环引物LB-GII、1.4mMdNTP和1M甜菜碱；
所述酶：每微升含8个活性单位、终浓度0.32U/ul的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单位、终浓度0.4U/ul的AMV反转录酶。
6.根据权利要求4所述的一种诺如病毒GII型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为1～100nM诺如病毒GII型基因组cDNA。
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