KR101138864B1 - 프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법, 그에 의하여 설계된 프라이머 및 프로브 세트, 상기 세트를 포함하는 키트, 상기 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을기록한 컴퓨터 판독가능한 매체 및 상기 세트를 이용한 표적 서열의 동정 방법 - Google Patents

프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법, 그에 의하여 설계된 프라이머 및 프로브 세트, 상기 세트를 포함하는 키트, 상기 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을기록한 컴퓨터 판독가능한 매체 및 상기 세트를 이용한 표적 서열의 동정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증폭 및 혼성화에 의한 표적 서열의 동정에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 설계된 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체 및 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 표적 서열의 동정 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 많은 수의 표적 서열들을 신속하고 정확하게 동정할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 용이하게 설계할 수 있다.
프라이머, 프로브, 설계, 표적 서열 동정, 마이크로어레이

Description

프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법, 그에 의하여 설계된 프라이머 및 프로브 세트, 상기 세트를 포함하는 키트, 상기 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체 및 상기 세트를 이용한 표적 서열의 동정 방법{Method for designing primer and probe set, primer and probe set designed by the method, kit comprising the set, computer readable medium recorded thereon a program to execute the method, and method for identifying target sequence using the set}
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 종래의 다중 서열 정렬법(multiple sequence alignment)을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법의 하위서열 세트 제조 단계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법의 일 예를 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 수행된 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법을 개략적으로 도시한 것이다(하위서열 세트 비교시의 상동성: 100%).
도 6은 본 발명의 다른 실시예에서 수행된 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법을 개략적으로 도시한 것이다(하위서열 세트 비교시의 상동성: 90% 이상).
본 발명은 표적 서열의 동정에 사용될 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법, 그에 의하여 설계된 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체 및 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 표적 서열의 동정 방법에 관한 것이다.
마이크로어레이란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있다. 또한, 상기 마이크로어레이의 제조방법에는 일반적으로 포토리소그래피를 이용하는 방법이 알려져 있다. 포토리소그래피를 이용하는 경우, 제거가능한 기로 보호된 단량체가 도포된 기판 표면 상의 일정한 영역을 에너지 원에 노출시켜 보호기를 제거하고, 제거가능한 기로 보호된 단량체를 커플링시키는 단계를 반복함으로써, 폴리뉴클레오티드의 마이크로어레이를 제조할 수 있다. 이 경우, 마이크로어레이 상에 고정화되는 폴리뉴클레오티드는 단량체를 하나 씩 연장시키는 방식으로 합성된다. 또한, 스팟팅(spotting) 법에 의하는 경우, 마이크로어레이는 이미 합성된 폴리뉴클레오티드를 일정한 위치에 고정화시킴으로써 고정화된다. 이러한 마이크로어레이의 제조방법은 예를 들면, 미국특허 제5,744,305호, 제5,143,854호 및 제5,424,186호에 개시되어 있다. 마이크로어레이 및 그의 제조방법에 관한 상기 문헌은 원용에 의하여 본 명세서에 그 전체로서 포함되어진다.
상기 마이크로어레이를 이용하여 표적 서열의 유전자형을 검색 또는 동정하는 통상적인 방법은 소정의 프라이머를 이용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계, 상기 증폭된 표적 서열을 상기 마이크로어레이에 적용시키는 단계, 상기 증폭된 표적 서열을 상기 마이크로어레이에 고정화되어 있는 폴리뉴클레오티드("프로브" 또는 "프로브 핵산" 또는 "프로브 폴리뉴클레오티드"라고도 한다)와 혼성화 반응 시키는 단계, 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계, 및 표적 서열-프로브의 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계로 이루어진다. 상기 표적 서열의 동정 방법에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브를 어떻게 설계하냐에 따라서 상기 방법의 결과는 전혀 상이해진다. 따라서, 표적 서열의 동정 방법에 사용되는 프라이머 및 프로브를 효율적으로 설계하는 방법이 절실히 요구되고 있다.
상기 프라이머 및 프로브를 설계하는 종래 방법은 다중 서열 정렬법(multiple sequence alignment)에 기초한다. 다중 서열 정렬법이란 치환, 삽입 또는 결실이라는 변이를 포함하는 3개 이상의 서열에 대하여 일치하는 염기 배열의 수가 최대가 되도록 정렬하는 것을 말한다. 도 2는 종래의 다중 서열 정렬법을 개 략적으로 도시한 것이다. 도 2를 참조하면, 표적 서열들을 일치하는 염기 배열의 수가 최대가 되도록 정렬한 다음, 공통적인 영역(a/c 및 e/g)은 프라이머로 선택하고, 유니크한 영역(b, d, h, f, i)은 프로브로 선택하여 프라이머 및 프로브 세트를 설계한다.
그러나, 종래 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법에 있어서, 각 표적 서열에 대하여 혼성화하면서 다른 서열에는 교차 혼성화하지 않는 특이적 서열만을 프로브로서 선택하였기 때문에 표적 서열간의 서열 상동성이 높거나 동정하고자 하는 표적 서열의 수가 많아지는 경우 특이적 프로브를 설계할 수 없고, 범용 프라이머(univeral primer)를 설계할 수 없을 때 하위 그룹에 대한 최적 프라이머를 바로 제시해 줄 수 없고 별도의 설계 방법을 필요로 한다는 문제점이 있다. 또한, 프라이머 및 프로브의 설계가 가능한 경우에도 설계를 위해 추가적인 정보가 필요하며, 수행 속도가 낮아진다는 문제점이 있다.
예컨대, 특정 박테리아 군을 구성하는 복수의 박테리아들 중 시료 내에 존재하는 박테리아가 어떤 종인지를 동정하기 위해서 종래에는 상기 복수의 박테리아의 보존 서열(consensus sequence) 중 하나인 16S rRNA 부위를 이용하여 다중 서열 정렬법에 기초하여 프라이머 및 프로브를 설계하였다. 즉, 상기 16S rRNA 부위를 다중 정렬시킨 후에 상기 종들에 공통적인 서열은 프라이머로서 사용하고, 각 종들에 유니크한 서열은 프로브로서 사용하였다. 상기 방법은 몇 종의 박테리아를 동정하는데 사용될 수 있지만, 16S rRNA 부위는 고도로 보존되어 있어 많은 종의 박테리아의 동정에 사용되기에는 어려움이 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 연구를 계속 하던 중, 표적 서열들의 하위서열 세트를 제조하고 높은 상동성을 갖는 하위서열의 수가 가장 많은 2개의 하위서열 세트를 선택하는 과정을 반복하면 많은 수의 표적 서열들을 신속하고 정확하게 동정할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 용이하게 설계할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 증폭 및 혼성화에 의한 표적 서열의 동정에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 설계된 프라이머 및 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 표적 서열 동정용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 표적 서열을 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 a) 복수의 표적 서열들을 일정한 기준으로 모든 가능한 하위서열을 포함하도록 1 bp씩 슬라이딩시키면서 분해하여 각각의 하위서열 세트(subsequence set)를 제조하는 단계; b) 상기 복수의 하 위서열 세트를 비교하여 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 가장 많은 2개의 하위서열 세트를 선택하는 단계; c) 상기 2개의 하위서열 세트의 서열 중 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들을 공통 하위서열 세트로 선택하고, 그 이외의 하위서열들을 프로브로 선택하는 단계; d) 상기 2개의 하위서열 세트를 제외한 상기 복수의 하위서열 세트 및 상기 공통 하위서열 세트를 대상으로 하위서열 세트 간에 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열이 존재하지 않을 때까지 상기 b) 단계 및 c) 단계를 반복하는 단계; 및 e) 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들이 존재하지 않는 공통 하위서열 세트들의 하위서열들을 프라이머로 선택하는 단계를 포함하는 증폭 및 혼성화에 의한 표적 서열의 동정에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법에 있어서, 상기 a) 단계의 기준은 염기 길이, 혼성화 융점(Tm), GC 함량, 자기 정렬(self-alignment), 변이 위치, 반복서열 정도 및 3' 말단의 염기 구성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법에 있어서, 상기 b) 단계의 2개의 하위서열 세트의 선택은 열역학적 특성 및 위치 정보를 고려하여 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법에 따라 설계된 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프로브 세트가 기판 상에 고정화 되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 표적 서열 동정용 키트를 제공한다.
상기 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것일 수 있다.
또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 표적 서열을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 표적 서열 동정 방법은 a) 상기 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; b) 상기 증폭된 표적 서열을 상기 프로브 세트와 혼성화시키는 단계; c) 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계; 및 d) 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
이하 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일면은 증폭 및 혼성화에 의한 표적 서열의 동정에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법을 나타내는 흐름도이다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법은 a) 복수의 표적 서열들을 일정한 기준으로 모든 가능한 하위서열을 포함하도록 1 bp씩 슬라이딩시키면서 분해하여 각각의 하위서열 세트(subsequence set)를 제조하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 있어서 "표적 서열(target sequence)"이란 프로브와의 결합에 의하여 동정하기 위해 선택되는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 표적 서열은 게놈 DNA, 제한 효소에 의하여 절단된 DNA 단편, 및 PCR 산물 등을 포함한다. 일반적으로는 특정 프라이머를 이용하여 게놈 DNA의 특정 영역을 PCR에 의하여 증폭함으로써 얻어지는 게놈 DNA 단편이 많이 사용된다. 본 발명의 방법은 표적 서열이 복수 개인 경우에 적용할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법이다.
상기 "일정 기준"은 프라이머 또는 프로브를 선택하는 종래의 통상적인 기준일 수 있다. 즉, 상기 기준은 염기 길이, 혼성화 융점(Tm), GC 함량, 자기 정렬(self-alignment), 변이 위치, 반복서열 정도 및 3' 말단의 염기 구성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 일정 기준은 본 방법에 의해 설계된 프라이머 또는 프로브를 이용하여 실험을 하고자 하는 조건에 따라 용이하게 설정될 수 있다. 예를 들어 혼성화를 수행하고자 하는 온도가 72~76℃ 되면 그에 따라 18~25 bp 정도의 염기 서열이 설정될 수 있다. 선택된 프라이머/프로브가 보다 잘 작동하게 하기 위해서 GC 함량을 30~70% 정도로 선정하고, 3' 말단 염기로 G 또는 C가 오는 프라이머/프로브를 선정하는 단계가 추가적으로 포함될 수 있다.
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법의 하위서열 세트 제조 단계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3을 참조하면, 각 표적 서열을 1 bp씩 슬라이딩시키면서 분해하여 다수의 하위서열을 포함하는 하위서열 세트를 제조한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 각 하위서열이 20 bp의 염기 길이를 갖도록 기준을 설정하여 1 bp씩 슬라이딩시키면서 분해하여 다수의 하위서열을 포함하는 하위서열 세트를 제조하였다.
복수의 하위서열 세트를 제조한 다음, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법은 b) 상기 복수의 하위서열 세트를 비교하여 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 가장 많은 2개의 하위서열 세트를 선택하는 단계를 수행한다.
상동성의 검색은 당업자에게 알려져 있는 방법, 예컨대 상동성 검색 프로그램을 이용하는 방법에 의해 수행될 수 있을 것이다. 본 명세서에 있어서, 일정 수준 이상의 상동성은 각 실험의 조건에 따라 당업자에 의해 용이하게 설정될 수 있으므로 그의 특정 수치에 한정되지는 않는다. 단순하게 문자열의 상동성을 비교하는 경우에 문자의 불일치를 어느 정도까지 포함할 것인지에 따라 상동성의 기준이 달라질 수 있는데, 혼성화를 감안했을 때 80% 정도 이상의 혼성화를 감안하여 상동성을 판단할 수 있다. 문자열 자체에 대한 상동성 이외에 혼성화 정도를 nearest-neighbor 모델과 같은 열역학적 모델을 이용하여 혼성화가 이루어 질 때의 자유 에너지(free energy)로 상동성을 판단할 수도 있다.
상기 b) 단계의 2개의 하위서열 세트의 선택은 열역학적 특성 및 위치 정보를 고려하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 열역학적 특성을 고려한다는 것은 혼성화 특성을 예측하여 어떠한 온도에서 혼성화가 이루어질 것인지, 어떠한 온도에서 그렇지 않을 것인지를 판단하는 과정이다. 본 발명의 실시예서와 같이 일정한 길이로 올리오뉴클레오티드 집합을 구성하였을 경우, 길이만 가지고 정확한 혼성화 특성을 예측할 수 없기 때문에 이 과정이 반드시 필요하다. 반면, 열역학적 특성을 가지고 서로 다른 길이로 올리고뉴클레오티드 집합을 구성하는 경우(예컨대, Tm을 65℃로 맞추고 이에 유사한 올리고뉴클레오티드 집합을 구성하게 된다면 GC 함량이 높은 부분은 길이가 짧아지고, 그렇지 않은 부분은 길이가 길어진다), 이 과정이 반드시 필요한 것은 아니다.
상기 위치 정보를 고려한다는 것은 프라이머 사이에 프로브가 위치하도록 고려한다는 것이다. 즉, 서열 세트 간의 관계를 모두 확인한 다음에 실제 프라이머 및 프로브를 선정하는 단계에서 상기 위치에 대한 고려를 할 필요가 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 설계 방법은 c) 상기 2개의 하위서열 세트의 서열 중 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들을 공통 하위서열 세트로 선택하고, 그 이외의 하위서열들을 프로브로 선택하는 단계를 수행한다.
본 발명에 있어서, '공통 하위서열 세트'란 선택된 2개의 하위서열 세트(본 단계가 반복되는 경우, 1개의 하위서열 세트와 1개의 공통 하위서열 세트, 또는 2개의 공통 하위서열 세트)의 하위서열 중 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들로 구성된 폴리뉴클레오티드 집합을 의미한다. 예컨대, 본 단계는 상기 2개의 하위서열 세트가 각각 1,000개의 하위서열로 구성되고 그 중 900쌍의 하위서열들이 서로 90% 이상의 상동성을 갖는 경우 상기 900개의 하위서열들을 공통 하위서열 세트로 선택하고(90% 이상의 상동성 기준), 90% 미만의 상동성을 갖는 각 100개의 하위서열들을 프로브로 선택할 수 있다. 또한, 상기 1,000쌍의 하위서열 중 100%의 상동성을 갖는 것이 700쌍인 경우, 상기 700개의 하위서열들을 공통 하위서열 세트로 선택하고(100%의 상동성 기준), 100% 미만의 상동성을 갖는 각 300개의 하위서열들을 프로브로 선택할 수 있다.
상기 프로브를 그대로 사용할 수도 있지만, 그 중 일부를 선택하여 사용할 수도 있다. 본 발명에 있어서, 프로브의 선택은 종래 알려진 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 보다 상세하게, 상기 표적 서열 분해 기준과 같은 프로브 DNA를 선택하기 위한 기준을 설정하고, 상기 기준에 맞는 DNA 서열을 선택하고, 선택된 DNA 서열에 대하여 상기 기준 및 다른 요건을 검정한 다음 가장 바람직한 서열을 프로브 DNA로서 선택하게 된다. 즉, 상기에서 선택된 프로브 중에서 가장 바람직한 것을 프로브 서열로서 선택하게 된다. 상기 프로브 DNA는 표적 DNA에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 것이면 하나의 표적 DNA에 대하여 2 이상의 프로브 DNA가 선택될 수도 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법은 d) 상기 2개의 하위서열 세트를 제외한 상기 복수의 하위서열 세트 및 상기 공통 하위서열 세트를 대상으로 하위서열 세트 간에 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열이 존재하지 않을 때까지 상기 b) 단계 및 c) 단계를 반복하는 단계를 수행한다.
즉, 상기에서 선택된 2개의 하위서열 세트 대신에 그들의 공통 하위서열 세트가 포함된 것을 특징으로 하는 복수의 하위서열 세트를 다시 비교하여 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 가장 많은 2개의 (공통) 하위서열 세트를 선택하고, 상기 2개의 (공통) 하위서열 세트의 서열 중 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들을 다시 공통 하위서열 세트로 선택하고, 그 이외의 하위서열들을 프로브로 선택한다. 상기 과정을 복수의 (공통) 하위서열 세트간에 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들이 존재하지 않을 때까지 반복한다.
다음으로, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법은 e) 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들이 존재하지 않는 공통 하위서열 세트들의 하위서열들을 프라이머로 선택하는 단계를 수행한다. 상기 단계들을 수행한 결과, 하나의 공통 하위서열 세트만이 남게 된 경우 상기 공통 하위서열 세트의 하위서열들을 프라이머로 선택하면 된다. 또한, 둘 이상의 공통 하위서열 세트들이 남는 경우에도 각 공통 하위서열 세트의 하위서열들을 프라이머로 선택하면 된다. 상기 프라이머를 그대로 사용할 수도 있지만, 그 중 일부를 선택하여 사용할 수도 있다.
도 4는 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법의 일 예를 개략적으로 도시한 것이다.
이해를 돕기 위하여 본 예에서는 5개의 표적 서열을 사용하였지만, 그의 수에 제한되는 것은 아니며, 오히려 그의 수가 증가할 수록 본 발명은 보다 강력함을 당업자는 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
도 4를 참조하면, 5개의 표적 서열들을 일정한 기준으로 모든 가능한 하위서열을 포함하도록 1 bp씩 슬라이딩시키면서 분해하여 각각의 하위서열 세트를 제조한다. 본 발명을 보다 단순화시켜 설명하기 위해 각 하위서열 세트는 4개의 하위서열로 구성되어 있는 것으로 도시하였지만, 실제의 하위서열은 그보다 훨씬 많을 것이다.
상기에서 제조된 각 4개의 하위서열들로 구성되는 5개의 하위서열 세트를 서로 비교하여 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 가장 많은(하위서열 a, 하위서열 f 및 하위서열 d의 3개) 하위서열 세트 2 및 하위서열 세트 3을 선택한다. 다음으로, 상기 3개의 하위서열을 공통 하위서열 세트 1로 선택하고, 하위서열 e 및 하위서열 g를 프로브로 선택한다.
다음으로, 상기 2개의 하위서열 세트를 상기 1개의 공통 하위서열 세트로 대체한 복수의 하위서열 세트, 즉 하위서열 세트 1, 공통 하위서열 세트 1, 하위서열 세트 4 및 하위서열 세트 5를 다시 비교하여 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 가장 많은 2개의 (공통) 하위서열 세트를 선택한다. 도 4에서는 상기 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 하위서열 세트 1 및 공통 하위서열 세트 1에 대해 2개(하위서열 a 및 하위서열 d), 하위서열 세트 4 및 하위서열 세트 5에 대해 2개(하위서열 h 및 하위서열 j)로 동일하였다. 따라서, 하위서열 세트 1 및 공통 하위서열 세트 1의 경우, 하위서열 a 및 하위서열 d를 공통 하위서열 세트 2로 선택하고, 하위서열 b, 하위서열 c 및 하위서열 f를 프로브로 선택하였다. 또한, 하위서열 세트 4 및 하위서열 세트 5의 경우, 하위서열 h 및 하위서열 j를 공통 하위 서열 세트 3으로 선택하고, 하위서열 e, 하위서열 i, 하위서열 k 및 하위서열 l을 프로브로 선택하였다.
다음으로, 상기 공통 하위서열 세트 2 및 공통 하위서열 세트 3에 대해 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 가장 많은 2개의 공통 하위서열 세트를 선택하고자 그 하위서열들을 비교하였으나, 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열이 존재하지 않았다. 따라서, 상기 공통 하위서열 세트 2 및 공통 하위서열 세트 3의 하위서열 a, 하위서열 d, 하위서열 h 및 하위서열 j를 프라이머로 선택하였다.
본 발명의 다른 일면은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법에 따라 설계된 프라이머 및 프로브 세트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일면은 상기 프로브 세트가 기판 상에 고정화 되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 표적 서열 동정용 키트에 관한 것이다.
상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 프로브 세트를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 즉, 상기 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 프로브 세트를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태 의 스팟터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 표적 서열을 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 표적 서열 동정 방법은 a) 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; b) 상기 증폭된 표적 서열을 본 발명에 따른 프로브와 혼성화시키는 단계; c) 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계; 및 d) 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 일면은 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체에 관한 것이다.
본 발명은 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록 매체에 컴퓨터(정보 처리 기능을 갖는 장치를 모두 포함한다)가 읽을 수 있는 코드로서 구현하는 것이 가능하다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록 매체는 컴퓨터 시스템에 의하여 읽혀질 수 있는 데이터가 저장되는 모든 종류의 기록 장치를 포함한다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록 장치의 예로는 ROM, RAM, CD-ROM, 자기 테이프, 플로피 디스크, 광데이터 저장장치 등이 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
10종의 박테리아 동정을 위한 프라이머 및 프로브 세트의 설계
본 실시예에서는 하기 표 1과 같은 패혈증 또는 균혈증(bacteremia) 유발과 관련된 박테리아 가운데 스트렙토코쿠스 종에 포함되는 10종의 16S rRNA 서열을 표적 서열로 하여 상기 박테리아들을 동정할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 설계하였다. 상기 10종에 대한 77개 서열의 서열 정보는 RDP2라는 rRNA 데이터베이스의 공개 정보를 이용하였다.
<표 1>
종(species) 16S rRNA 서열
스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae) 서열번호 1 내지 서열번호 4
스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis) 서열번호 5 내지 서열번호 19
스트렙토코쿠스 인터메디우스(Streptococcus intermedius) 서열번호 20
스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis) 서열번호 21 내지 서열번호 30
스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis) 서열번호 31 내지 서열번호 34
스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 서열번호 35 내지 서열번호 44
스트렙토코쿠스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 서열번호 45 내지 서열번호 69
스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivaruis) 서열번호 70
스트렙토코쿠스 산귀니스(Streptococcus sanguinis) 서열번호 71 내지 서열번호 76
스트렙토코쿠스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis) 서열번호 77
도 5는 본 실시예에서 수행된 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법을 개략적으로 도시한 것이다. 먼저, 상기 표 1에 기재되어 있는 서열 77개 서열의 16S rRNA을 1 bp씩 슬라이딩시키면서 20 bp 길이로 분해하여 각각 다수의 하위서열로 구성되는 하위서열 세트 77개를 제조하였다. 다음으로, 1종에 대해 다수의 서열이 존재하는 경우, 상기 다수 종에 공통인 하위서열만을 종 대표적 하위서열로 선택하여 10개의 하위서열 세트를 제조하였다.
상기에서 제조된 10종의 하위서열 세트들을 서로 비교하여 100%의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 1,480개로 가장 많은 스트렙토코쿠스 베스티불라리스 (Streptococcus vestibularis)의 하위서열 8 및 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivaruis)의 하위서열 9를 선택하고, 상기 1,480개의 하위서열을 공통 하위서열 세트 G0로 선택하고, 그 이외의 상동성을 갖지 않는 하위서열들을 프로브로 선택하였다. 다음으로, 하위서열 세트 1 내지 7, 공통 하위서열 세트 GO 및 하위서열 세트 10을 서로 비교하여 100%의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 1,106개로 가장 많은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 하위서열 1 및 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis)의 하위서열 2를 선택하고, 상기 1,106개의 하위서열을 공통 하위서열 세트 G1으로 선택하고, 그 이외의 상동성을 갖지 않는 하위서열들을 프로브로 선택하였다. 이후, 상기 공통 하위서열 세트 G1, 하위서열 세트 3 내지 7, 공통 하위서열 세트 G0 및 하위서열 세트 10에 대해서 상기 단계를 반복한다. 그 결과, 54개의 하위서열로 구성되는 공통 하위서열 세트 G8만이 남았다. 상기 G8의 하위서열 54개를 프라이머로 선택하였다.
실시예 2
10종의 박테리아 동정을 위한 프라이머 및 프로브 세트의 설계
본 실시예에서는 2개의 하위서열 세트 선택시의 상동성을 100% 대신에 90% 이상(20 bp 중 1 내지 2개의 불일치 허용)으로 하였다는 점을 제외하고는 실시예 1의 방법과 동일하게 수행하였다.
도 6은 본 실시예에서 수행된 프라이머 및 프로브 세트 설계 방법을 개략적으로 도시한 것이다. 제조된 10개의 하위서열 세트들을 서로 비교하여 90% 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 1,536개로 가장 많은 스트렙토코쿠스 베스티불라 리스(Streptococcus vestibularis)의 하위서열 3 및 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivaruis)의 하위서열 4를 선택하고, 상기 1,536개의 하위서열을 공통 하위서열 세트 G0로 선택하고, 90% 미만의 상동성을 갖는 하위서열들을 프로브로 선택하였다. 다음으로, 하위서열 세트 1 내지 2, 공통 하위서열 세트 GO 및 하위서열 세트 5 내지 10을 서로 비교하여 90% 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 1,117개로 가장 많은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 하위서열 1 및 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis)의 하위서열 2를 선택하고, 상기 1,117개의 하위서열을 공통 하위서열 세트 G1으로 선택하고, 90% 미만의 상동성을 갖는 하위서열들을 프로브로 선택하였다. 이후, 상기 공통 하위서열 세트 G0 내지 G1 및 하위서열 세트 5 내지 10에 대해서 상기 단계를 반복한다. 그 결과, 53개의 하위서열로 구성되는 공통 하위서열 세트 G8만이 남았다. 상기 G8의 하위서열 53개를 프라이머로 선택하였다.
실시예 3
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 설계 방법의 속도 측정
실시예 1 및 실시예 2에서 수행한 프라이머 및 프로브 설계 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램으로 작성하여, 표 1의 10종의 박테리아 대한 상기 프로그램의 프라이머 및 프로브 설계 속도를 종래의 다중 서열 정렬법(multiple sequence alignment)을 구현하고 있는 프로그램인 T-Coffee(C.Notredame, D. Higgins, J. Heringa, T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. Journal of Molecular Biology, Vol 302, pp205-217, 2000; http://igs-server.cnrs-mrs.fr/~cnotred/Projects_home_page/t_coffee_home_page.html), Clustalw(Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson JD., Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acids Res. 2003 Jul; 31(13), 3497-500; ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/unix/clustalw/) 및 Muscle(Edgar, Robert C. (2004), MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput, Nucleic Acids Research 32(5), 1792-97; http://www.drive5.com/muscle/)와 비교하였다. 상기 언급한 다중 서열 정렬법은 다중 서열 정렬 기반의 프라이머 및 프로브를 설계하기 위한 중간 단계로 이용되는 방법으로 프라이머 및 프로브 목록을 최종적으로 얻기 위해서는 추가적인 분석이 필요하다. 하지만 아직까지 그러한 기능을 포함하고 있는 프로그램이 없기에 본 발명의 방법과 상기 다중 서열 정렬법 자체를 비교하는 시도를 하였다.
상기 각 프로그램은 동일한 컴퓨터 사양(Intel Pentium III Xeon 700 MHz, 4GB memory, GNU/Debian Linux)에서 수행되었다.
그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, T-Coffee를 이용한 경우 31,641초에 서열 정렬을 마치기도 전에 메모리 부족으로 컴퓨터가 정지되었다. Clustalw 및 Muscle의 경우, 서열 정렬에 소요된 시간은 2,578초 및 60초였다. 한편,100%의 상동성을 설정한 실시예 1의 총 소요시간은 17.4초, 90% 이상의 상동성을 설정한 실시예 2의 총 소요시간은 71.8초로 종래의 방법보다 속도가 빠름을 알 수 있었다.
<표 2>
프로그램 시간(초) 비고
T-Coffee* 31,641 컴퓨터 메모리가 부족해 정지
Clustalw* 2,578
Muscle* 60
실시예 1 17.4 20bp, 100% 상동성
실시예 2 71.8 20bp, 90% 이상 상동성
* 는 서열들을 정렬(alignment)하는데 소요된 시간만을 나타냄.
본 발명에 따르면, 많은 수의 표적 서열들을 신속하고 정확하게 동정할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 용이하게 설계할 수 있다.
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Method for designing primer and probe set, primer and probe set designed by the method, kit comprising the set, computer readable medium recorded thereon a program to execute the method, and method for identifying target sequence using the set <130> PN060546 <160> 77 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1501 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtagaac gctgaggttt ggtgtttaca 60 ctagactgat gagttgcgaa cgggtgagta acgcgtaggt aacctgcctc atagcggggg 120 ataactattg gaaacgatag ctaataccgc ataagagtaa ttaacacatg ttagttattt 180 aaaaggagca attgcttcac tgtgagatgg acctgcgttg tattagctag ttggtgaggt 240 aaaggctcac caaggcgacg atacatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacgg 360 aagtctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420 ttagagaaga acgttggtag gagtggaaaa tctaccaagt gacggtaact aaccagaaag 480 ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 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tgagagggtg atcggccaca 240 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat 300 ggggggaacc ctgaccgagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaagct 360 ctgttgtaag agaagaacgg gtgtgagagt ggaaagttca cactgtgacg gtatcttacc 420 agaaagggac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtcc cgagcgttgt 480 ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggttagat aagtctgaag ttaaaggctg 540 tggcttaacc atagtatgct ttggaaactg tttaacttga gtgcagaagg ggagagtgga 600 attccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggagga acaccggtgg cgaaagcggc 660 tctctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 720 ccttgtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaggtgtta ggccctttcc ggggctcagt 780 gccgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa 840 aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 900 ggaaccttac caggtcttga catccctatg accgctctag agatagagtt tctcttcgga 960 gcagaggtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1020 tcccgcaacg agcgcaaccc ctattgttag ttgccatcat tcagttgggc actctagcga 1080 gactgccggt aataaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1140 acctgggcta cacacgtgct acaatggctg gtacaacgag tcgcaacgcg gtgacggcaa 1200 gctaatctct taaagccagt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagt 1260 cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320 acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta acacccga 1358 <210> 73 <211> 1460 <212> DNA <213> Streptococcus sanguis <400> 73 tgatcctggc tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagta gaacgctgaa 60 gagaggagct tgctcttctt ggatgagttg cgaacgggtg agtaacgcgt aggtaacctg 120 cctggtagcg ggggataact attggaaacg atagctaata ccgcataaaa ttgattattg 180 catgataatt aattgaaaga tgcaattgca tcactaccag atggacctgc gttgtattag 240 ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatacat agccgacctg agagggtgat 300 cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360 tcggcaatgg ggggaaccct gaccgagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc 420 gtaaagctct gttgtaagag aagaacgggt gtgagagtgg aaagttcaca ctgtgacggt 480 atcttaccag aaagggacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtcccg 540 agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttagataa gtctgaagtt 600 aaaggctgtg gcttaaccat agtatgcttt ggaaactgtt taacttgagt gcagaagggg 660 agagtggaat tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaggaac accggtggcg 720 aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agcgtgggga gcaaacagga 780 ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aggtgttagg ccctttccgg 840 ggcttagtgc cgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg 900 aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960 caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tccctctgac cgctctagag atagagtttt 1020 ccttcgggac agaggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080 gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct attgttagtt gccatcattc agttgggcac 1140 tctagcgaga ctgccggtaa taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 1200 cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggctggt acaacgagtc gcaagccggt 1260 gacggcaagc taatctctga aagccagtct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta 1320 catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg 1380 ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa 1440 ccgtaaggag ccagccgcct 1460 <210> 74 <211> 1430 <212> DNA <213> Streptococcus sanguis <400> 74 aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaaagtag aacgctgaag gaggagcttg 60 ctctttccgg atgagttgcg aacgggtgag taacgcgtag gtaacctgcc tggtagcggg 120 ggataactat tggaaacgat agctaatacc gcataacagt agatattgca tgatatctgc 180 ttgaaaggtg caattgcacc actaccagat ggacctgcgt tgtattagct agttggtgag 240 gtaacggctc accaaggcga cgatacatag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg 300 gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc ggcaatggac 360 ggaagtctga ccgagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt 420 tgtaagagaa gaacgagtgt gagagtggaa agttcacact gtgacggtat cttaccagaa 480 agggacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtcccgag cgttatccgg 540 atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttagataagt ctgaagttaa aggctgtggc 600 ttaaccatag tacgctttgg aaactgttta acttgagtgc aagaggggag agtggaattc 660 catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaggaacac cggtggcgaa agcggctctc 720 tggcttgtaa ctgacgctga ggctcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 780 gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctag gtgttgggtc ctttccggga ctcagtgccg 840 cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga 900 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 960 ccttaccagg tcttgacatc cctctgaccg ctctagagat agagctttcc ttcgggacag 1020 aggtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1080 gcaacgagcg caacccctat tgttagttgc catcattcag ttgggcactc tagcgagact 1140 gccggtaata aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1200 gggctacaca cgtgctacaa tggctggtac aacgagtcgc aagtcggtga cggcaagcta 1260 atctcttaaa gccagtctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagtcgga 1320 atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1380 cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc 1430 <210> 75 <211> 1428 <212> DNA <213> Streptococcus sanguis <400> 75 aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtaga acgctgaagg aggagcttgc 60 ttctctggat gagttgcgaa cgggtgagta acgcgtaggt aacctgcctg gtagcggggg 120 ataactattg gaaacgatag ctaataccgc ataatagtag atgttgcatg acatttgctt 180 aaaaggtgca attgcatcac taccagatgg acctgcgttg tattagctag ttggtgaggt 240 aacggctcac caaggcgacg atacatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacgg 360 aagtctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420 taagagaaga acgagtgtga gagtggaaag ttcacactgt gacggtatct taccagaaag 480 ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtcccgagcg ttgtccggat 540 ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt agataagtct gaagttaaag gctgtggctt 600 aaccatagta cgctttggaa actgtttaac ttgagtgcaa gaggggagag tggaattcca 660 tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aggaacaccg gtggcgaaag cggctctctg 720 gcttgtaact gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 780 agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaggt gttagaccct ttccggggtt tagtgccgca 840 gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat 900 tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960 ttaccaggtc ttgacatccc tctgaccgct ctagagatag agttttcctt cgggacagag 1020 gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080 aacgagcgca acccctattg ttagttgcca tcattcagtt gggcactcta gcgagactgc 1140 cggtaataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200 gctacacacg tgctacaatg gctggtacaa cgagtcgcaa gccggtgacg gcaagctaat 1260 ctcttaaagc cagtctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat 1320 cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380 cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacc 1428 <210> 76 <211> 1508 <212> DNA <213> Streptococcus sanguis <400> 76 agagtttgat cctggctcag acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtagaacg 60 ctgaagagag gagcttgctc ttcttggatg agttgcgaac gggtgagtaa cgcgtaggta 120 acctgcctgg tagcggggga taactattgg aaacgatagc taataccgca tgatattaat 180 tatcgcatga taatcaattg aaagatgcaa ttgcatcact accagatgga cctgcgttgt 240 attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tacatagccg acctgagagg 300 gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg 360 aatcttcggc aatgggggga accctgaccg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc 420 ggatcgtaaa gctctgttgt aagagaagaa cgggtgtgag agtggaaagt tcacactgtg 480 acggtatctt accagaaagg gacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540 tcccgagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggtta gataagtctg 600 aagttaaagg ctgtggctta accatagtat gctttggaaa ctgtttaact tgggtgcaga 660 aggggagagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga ggaacaccgg 720 tggcgaaagc ggctctctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcgt ggggagcaaa 780 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaggtg ttaggccctt 840 tccggggctt agtgccgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa 900 ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960 cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatccct ctgaccgctc tagagataga 1020 gttttccttc gggacagaga tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080 atgttgggtc aagtcccgca acgagcgcaa cccctattgt tagttgccat cattgagttg 1140 ggcactctag cgagactgcc ggtaataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1200 catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg ctggtacaac gagtcgcaag 1260 ccggtgacgg caagctaatc tctgaaagcc agtctcagtt cggattgtag gctgcaactc 1320 gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc 1380 ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga 1440 ggtaaccgta aggagccagc cgcctaaggt gggatagatg attggggtga agtcgtaaca 1500 aggtaacc 1508 <210> 77 <211> 1538 <212> DNA <213> Streptococcus vestibularis <400> 77 atgggagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt 60 agaacgctga agagaggagc ttgctcttct tggatgagtt gcgaacgggt gagtaacgcg 120 taggtaacct gccttgtagc gggggataac tattggaaac gatagctaat accgcataac 180 aataggtgac acatgtcatt tatttgaaag gggcaattgc tccactacaa gatggacctg 240 cgttgtatta gctagtaggt gaggtaacgg ctcacctagg cgacgataca tagccgacct 300 gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360 gtagggaatc ttcggcaatg ggggcaaccc tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag 420 gttttcggat cgtaaagctc tgttgtaagt caagaacgag tgtgagagtg gaaagttcac 480 actgtgacgg tagcttacca gaagggacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 540 gtaggtcccg agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttgataa 600 gtctgaagtt aaaggctgtg gctcaaccat agttcgcttt ggaaactgtc aaacttgagt 660 gcagaagggg agagtggaat tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaggaac 720 accggtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agcgtgggga 780 gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aggtgttgga 840 tcctttccgg gattcagtgc cgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac 900 cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 960 taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcccgatgct atttctagag 1020 atagaaagtt acttcggtac atcggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc 1080 gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct attgttagtt gccatcattc 1140 agttgggcac tctagcgaga ctgccggtaa taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1200 atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggttggt acaacgagtt 1260 gcgagtcggt gacggcaagc taatctctta aagccaatct cagttcggat tgtaggctgc 1320 aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata 1380 cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc 1440 ggtgaggtaa ccttttggag ccagccgcct aaggtgggat agatgattgg ggtgaagtcg 1500 taacaaggta gccgtatcgg aaggtgcggc tggatcac 1538

Claims (10)

  1. a) 복수의 표적 서열들을 일정한 기준으로 모든 가능한 하위서열을 포함하도록 1 bp씩 슬라이딩시키면서 분해하여 각각의 하위서열 세트(subsequence set)를 제조하는 단계로서, 상기 일정한 기준은 일정한 염기 길이, 일정한 혼성화 융점 (Tm), 일정한 GC 함량, 일정한 자기 정렬(self-alignment), 일정한 변이 위치, 일정한 반복서열 정도 및 일정한 3' 말단의 염기 구성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 단계;
    b) 상기 복수의 하위서열 세트를 비교하여 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 가장 많은 2개의 하위서열 세트를 선택하는 단계;
    c) 상기 2개의 하위서열 세트의 서열 중 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들을 공통 하위서열 세트로 선택하고, 그 이외의 하위서열들을 프로브로 선택하는 단계;
    d) 상기 2개의 하위서열 세트를 제외한 상기 복수의 하위서열 세트 및 상기 공통 하위서열 세트를 대상으로 하위서열 세트 간에 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열이 존재하지 않을 때까지 상기 b) 단계 및 c) 단계를 반복하는 단계; 및
    e) 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들이 존재하지 않는 공통 하위서열 세트들의 하위서열들을 프라이머로 선택하는 단계;를 포함하는 증폭 및 혼성화에 의한 표적 서열의 동정에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트를 설계하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 b) 단계의 2개의 하위서열 세트의 선택은 어떠한 온도에서 혼성화가 이루어질 것인지 및 프라이머 사이에 프로브가 위치하는 것을 고려하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 따른 방법을 컴퓨터가 수행할 수 있도록 하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독가능한 매체.
  9. a) 복수의 표적 서열들을 일정한 기준으로 모든 가능한 하위서열을 포함하도록 1 bp씩 슬라이딩시키면서 분해하여 각각의 하위서열 세트(subsequence set)를 제조하는 단계로서, 상기 일정한 기준은 일정한 염기 길이, 일정한 혼성화 융점 (Tm), 일정한 GC 함량, 일정한 자기 정렬(self-alignment), 일정한 변이 위치, 일정한 반복서열 정도 및 일정한 3' 말단의 염기 구성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 단계;
    b) 상기 복수의 하위서열 세트를 비교하여 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들의 수가 가장 많은 2개의 하위서열 세트를 선택하는 단계;
    c) 상기 2개의 하위서열 세트의 서열 중 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들을 공통 하위서열 세트로 선택하고, 그 이외의 하위서열들을 프로브로 선택하는 단계;
    d) 상기 2개의 하위서열 세트를 제외한 상기 복수의 하위서열 세트 및 상기 공통 하위서열 세트를 대상으로 하위서열 세트 간에 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열이 존재하지 않을 때까지 상기 b) 단계 및 c) 단계를 반복하는 단계;
    e) 상기 일정 수준 이상의 상동성을 갖는 하위서열들이 존재하지 않는 공통 하위서열 세트들의 하위서열들을 프라이머로 선택하는 단계; 및
    f) 선택된 프라이머 세트 및 선택된 프로브 세트를 이용하여 표적 서열을 동정하는 단계를 포함하는 표적 서열을 동정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법은
    a) 상기 선택된 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계;
    b) 상기 증폭된 표적 서열을 상기 선택된 프로브 세트와 혼성화시키는 단계;
    c) 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계; 및
    d) 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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