JP2006246888A - プライマー−プローブセットを設計する方法、それによって設計されたプライマー−プローブセット、該セットを含むキット、該方法をコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、および該セットを利用した標的配列の同定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】多数の標的配列を迅速かつ正確に同定できるプライマー−プローブセットの設計方法の提供。
【解決手段】ａ）複数の標的配列を一定基準に従って、１塩基対ずつずらして分解し、下位配列を含む配列セットを製造、ｂ）複数の前記下位配列セットを比較し、一定水準以上の相同性を有する下位配列の数が最も多い２個のセットを選択、ｃ）前記２個の下位配列セットに含まれる相同性配列から構成される配列群を共通下位配列セットとして選択し、前記配列以外の配列をプローブとして選択、ｄ）前記２個の下位配列セットを除外した複数の配列セット、および前記共通下位配列セットを対象に、下位配列セット間に一定水準以上の相同性を有する下位配列が存在しなくなるまで、ステップｂ）およびステップｃ）を反復、ｅ）一定レベル以上の相同性下位配列が存在しない、共通配列セットの下位配列をプライマーとして選択、という各ステップを含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、標的配列の同定に使われうるプライマー−プローブセットを設計する方法、それによって設計されたプライマー−プローブセット、前記プライマー−プローブセットを含むキット、前記方法をコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、および前記プライマー−プローブセットを利用した標的配列の同定方法に関する。

マイクロアレイとは、基板上に一定の領域にポリヌクレオチドが固定化されているものである。かかるマイクロアレイは、当業界に公知である。マイクロアレイについては、例えば、特許文献１および特許文献２に開示されている。

また、前記マイクロアレイの製造方法としては、一般的に、フォトリソグラフィを利用する方法が知られている。フォトリソグラフィを利用する場合、除去可能な基で保護された単量体が塗布された基板表面上の一定領域をエネルギー源に曝露させて保護基を除去し、前記保護基が除去されたモノマーと除去可能な基で保護された別の単量体とをカップリングさせるステップを反復することにより、ポリヌクレオチドのマイクロアレイを製造できる。この場合、マイクロアレイ上に固定化されるポリヌクレオチドは、単量体を一つずつ延長させる方式で合成される。また、スポッティング法による場合、マイクロアレイは、すでに合成されたポリヌクレオチドを一定の位置に固定化させることによって製造されうる。かかるマイクロアレイの製造方法は、例えば、前述の特許文献２、特許文献３および特許文献４に開示されている。

前記マイクロアレイを利用して標的配列の遺伝子型を検索または同定する一般的な方法は、所定のプライマーを利用して標的配列を増幅させるステップ、増幅された前記標的配列を前記マイクロアレイにアプライさせるステップ、増幅された前記標的配列を前記マイクロアレイに固定化されているポリヌクレオチド（「プローブ」または「プローブ核酸」または「プローブポリヌクレオチド」ともいう）とハイブリダイゼーション反応させるステップ、非特異的反応を除去するために洗浄するステップ、および標的配列−プローブのハイブリッド形成による蛍光シグナルを検出するステップからなる。前記標的配列の同定方法において、前記プライマーおよびプローブをいかように設計するかにより、前記方法の結果は、全く異なる。従って、標的配列の同定方法に使われるプライマーおよびプローブを効率的に設計する方法が切実に要求されている。

前記プライマーおよびプローブを設計する従来の方法は、多重配列整列法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）に基づく。多重配列整列法とは、一致する塩基配列の数が最大になるように、置換、挿入または欠失という変異を含む３つ以上の配列を整列させることをいう。図１は、従来の多重配列整列法を概略的に示した図面である。図１を参照すれば、一致する塩基配列の数が最大になるように、標的配列を整列させた後、共通的な領域（ａ／ｃおよびｅ／ｇ）を、プライマーとして選択し、特異的な領域（ｂ，ｄ，ｈ，ｆ，ｉ）を、プローブとして選択してプライマーおよびプローブセットを設計する。
米国特許第５，４４５，９３４号明細書 米国特許第５，７４４，３０５号明細書 米国特許第５，１４３，８５４号明細書 米国特許第５，４２４，１８６号明細書

しかし、従来、プライマーおよびプローブセットの設計方法において、各標的配列についてハイブリダイズし、他の配列には交差ハイブリダイズしない特異的配列のみがプローブとして選択されていたので、標的配列間の配列相同性が高い、または同定しようとする標的配列の数が多くなる場合、特異的プローブを設計できないことがあった。さらに、汎用プライマー（ｕｎｉｖｅｒａｌ ｐｒｉｍｅｒ）を設計できないとき、下位グループに対する最適プライマーをすぐに提示できず、別途の設計方法を必要とするという問題点がある。また、プライマーおよびプローブの設計が可能である場合にも、設計のために追加的な情報が必要であり、迅速性の点で問題となる。

例えば、試料内に存在するバクテリアがいかなる種であるかを同定するため、複数のバクテリアの保存配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の一つである１６Ｓ ｒＲＮＡ部位を利用し、多重配列整列法に基づいてプライマーおよびプローブは設計されてきた。すなわち、多重配列法に従って、前記１６Ｓ ｒＲＮＡ部位を整列させた後、前記種に共通的な配列は、プライマーとして用いられ、各種に特異的な配列は、プローブとして用いられる。前記方法は、何種かのバクテリアを同定するのに使われうるが、１６Ｓ ｒＲＮＡ部位は、高度に保存されているため、多種のバクテリアの同定に使われ難い。

本発明者らは、前記のような従来の問題点を解決するために、鋭意研究した結果、標的配列の下位配列セットを製造し、高い相同性を有する下位配列の数が最も多い２個の下位配列セットを選択する過程を反復すれば、多数の標的配列を迅速、かつ正確に同定できるプライマーおよびプローブセットを容易に設計できることを確認し、本発明を完成した。

本発明の目的は、増幅およびハイブリダイゼーションによる標的配列の同定に使われるプライマー−プローブセットを設計する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、前記方法によって設計されたプライマー−プローブセットを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記プライマー−プローブセットを含む標的配列同定用キットを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記方法をコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記プライマー−プローブセットを利用して標的配列を同定する方法を提供することである。

本発明の目的を達成するために、本発明は、ａ）複数の標的配列を一定基準に従って、１塩基対ずつずらして分解することによって作製される下位配列を含む、前記標的配列のそれぞれに対応する下位配列セットを製造するステップと、ｂ）複数の前記下位配列セットを比較し、一定水準以上の相同性を有する下位配列の数が最も多い２個の下位配列セットを選択するステップと、ｃ）前記２個の下位配列セットに含まれる、前記一定水準以上の相同性を有する下位配列から構成される配列群を共通下位配列セットとして選択し、前記一定水準以上の相同性を有する下位配列以外の下位配列をプローブとして選択するステップと、ｄ）前記２個の下位配列セットを除外した前記複数の下位配列セットおよび前記共通下位配列セットを対象に、下位配列セット間に前記一定水準以上の相同性を有する下位配列が存在しなくなるまで、前記ステップｂ）およびステップｃ）を反復するステップと、ｅ）前記一定レベル以上の相同性を有する下位配列が存在しない共通下位配列セットの下位配列をプライマーとして選択するステップと、を含む増幅およびハイブリダイゼーションによる標的配列の同定に使われるプライマー−プローブセットを設計する方法を提供する。

本発明によるプライマーおよびプローブセットの設計方法において、前記ステップａ）の基準は、塩基長、ハイブリダイゼーション融点（Ｔｍ）、ＧＣ含有量、自己整列、変異位置、反復配列程度および３’末端の塩基構成からなる群から選択される一つ以上でありうる。

本発明によるプライマーおよびプローブセットの設計方法において、前記ステップｂ）における２個の下位配列セットの選択は、熱力学的特性および位置情報を考慮して行われることが望ましい。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記プライマー−プローブセットの設計方法によって設計されたプライマー−プローブセットを提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記プライマー−プローブセット中のプローブセットが基板上に固定化されてなるマイクロアレイおよび前記プライマー−プローブセット中のプライマーセットを含む標的配列同定用キットを提供する。

前記基板は、その表面にアミノシラン、ポリ−Ｌ−リジンおよびアルデヒドからなる群から選択される活性基がコーティングされているものでありうる。

また、前記基板を構成する材料は、シリコンウェーハ、ガラス、石英、金属およびプラスチックからなる群から選択されうる。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記プライマー−プローブセットの設計方法をコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記プライマー−プローブセットを利用して標的配列を同定する方法を提供する。

本発明による標的配列同定方法は、ａ）前記プライマー−プローブセット中のプライマーセットを利用して標的配列を増幅させるステップと、ｂ）増幅された前記標的配列を前記プライマー−プローブセット中のプローブセットとハイブリダイゼーションさせるステップと、ｃ）非特異的反応を除去するために洗浄するステップと、ｄ）ハイブリッド形成による蛍光シグナルを検出するステップと、を含むことが望ましい。

本発明によれば、多数の標的配列を迅速、かつ正確に同定できるプライマーおよびプローブセットを容易に設計できる。

以下、図面を参照しつつ、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の一形態は、増幅およびハイブリダイゼーションによる標的配列の同定に使われるプライマー−プローブセットを設計する方法に関する。

図２は、本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法を表すフローチャートである。

本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法は、ａ）複数の標的配列を一定基準に従って、１塩基対ずつずらして分解することによって作製される下位配列を含む、前記標的配列のそれぞれに対応する下位配列セットを製造するステップを含む。

本明細書において、「標的配列」とは、プローブとの結合によって配列を同定するために選択される、ポリヌクレオチドを意味する。前記標的配列は、ゲノムＤＮＡ、制限酵素によって切断されたＤＮＡ断片、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物などを含む。一般的には、特定プライマーを利用し、ゲノムＤＮＡの特定領域をＰＣＲによって増幅することによって得られるゲノムＤＮＡ断片が使用される。本発明の方法は、標的配列が複数個である場合に適用されるプライマー−プローブセットを設計する方法である。

前記「一定基準」は、プライマーまたはプローブを選択する従来の一般的な基準でありうる。すなわち、前記基準は、塩基長、ハイブリダイゼーション融点（Ｔｍ）、ＧＣ含有量、自己整列、変異位置、反復配列程度および３’末端の塩基構成からなる群から選択される一つ以上でありうる。前記一定基準は、本方法により設計されたプライマーまたはプローブを利用して実験を行う条件によって容易に設定されうる。例えば、ハイブリダイゼーションを実行しようとする温度が７２〜７６℃であれば、それにより、１８〜２５ｂｐ程度の塩基配列が設定されうる。選択されたプライマー／プローブをさらによく作動させるために、ＧＣ含有量を３０〜７０％ほどに選定し、３’末端塩基としてＧまたはＣが入るプライマー／プローブを選定するステップが追加的に含まれうる。

図３は、本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法の下位配列セット製造ステップを概略的に示した図面である。

図３を参照すれば、一定基準に従って、１塩基対ずつずらして分解することによって作製される多数の下位配列を含む下位配列セットを製造する。本発明の実施例では、前記各下位配列が２０ｂｐの塩基長を有するように基準を設定して１塩基対ずつずらして分解することによって作製される多数の下位配列を含む下位配列セットを製造した。

複数の下位配列セットを製造した後、本発明によるプライマーおよびプローブセットの設計方法は、ｂ）複数の前記下位配列セットを比較し、一定水準以上の相同性を有する下位配列の数が最も多い２個の下位配列セットを選択するステップを実行する。

相同性の検索は、当業者に知られている方法、例えば相同性検索プログラムを利用する方法により行われうる。本明細書において、一定水準以上の相同性は、各実験の条件によって当業者により容易に設定されうるので、特定数値に限定されるものではない。単純に文字列の相同性を比較する場合に、文字の不一致をどの程度まで含むかによって相同性の基準が変わりうるが、約８０％以上の相同性を有していれば、一定水準以上の相同性を有すると判断できる。文字列自体に対する相同性以外に、ハイブリダイゼーションが最近接（ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ）モデルのような熱力学的モデルを利用して行われる場合、自由エネルギーによって相同性を判断することもできる。

前記ステップｂ）における２個の下位配列セットの選択は、熱力学的特性および位置情報を考慮して行われることが望ましい。

前記熱力学的特性を考慮するということは、ハイブリダイゼーション特性を予測し、いかなる温度でハイブリダイゼーションがなされるかを判断する過程である。本発明の実施例でのように、一定長のオリゴヌクレオチドの集合（すなわち下位配列）を構成させる場合、長さだけをもって正確なハイブリダイゼーション特性を予測できないために、好ましくはこの過程が必要である。一方、熱力学的特性でもって相異なる長さのオリゴヌクレオチドの集合を構成させる場合（例えば、Ｔｍを６５℃に合わせ、類似したオリゴヌクレオチドの集合を構成させるとき、ＧＣ含有量の多い部分は長さが短くなり、ＧＣ含有量が低い部分は長さが長くなる）、この過程が必ずしも必要なものではない。

前記位置情報を考慮するということは、プライマーの間にプローブが位置するように考慮するということである。すなわち、配列セット間の全ての関係を確認した後、実際にプライマーおよびプローブを決定するときに、前記位置情報を考慮をする必要がある。

次に、本発明によるプライマー−プローブ設計方法は、ｃ）前記２個の下位配列セットに含まれる、前記一定水準以上の相同性を有する下位配列から構成される配列群を共通下位配列セットとして選択し、前記一定水準以上の相同性を有する下位配列以外の下位配列をプローブとして選択するステップを実行する。

本発明において、「共通下位配列セット」とは、選択された２個の下位配列セット（本ステップが反復される場合、１個の下位配列セットと１個の共通下位配列セット、または２個の共通下位配列セット）の下位配列のうち、一定水準以上の相同性を有する下位配列から構成されたポリヌクレオチドの集合を意味する。例えば、本ステップは、前記２個の下位配列セットがそれぞれ１，０００個の下位配列から構成され、そのうち９００個の下位配列が互いに９０％以上の相同性を有する場合、前記９００個の下位配列を共通下位配列セットとして選択し（９０％以上の相同性基準）、９０％未満の相同性を有する各１００個の下位配列をプローブとして選択できる。また、前記１，０００個の下位配列のうち１００％の相同性を有するものが７００個である場合、前記７００個の下位配列を共通下位配列セットとして選択し（１００％の相同性基準）、１００％未満の相同性を有する各３００個の下位配列をプローブとして選択できる。

前記プローブをそのまま使用することができるが、そのうち一部を選択して使用することもできる。本発明において、プローブの選択は、従来公知の方法を利用して決定してもよい。前記標的配列分解基準と同じ方法でプローブＤＮＡを選択するための基準を設定し、前記基準に合うＤＮＡ配列を選択し、選択されたＤＮＡ配列について前記基準および他の要件を検定した後、最も望ましい配列をプローブＤＮＡとして選択する。すなわち、前記から選択されたプローブのうち、最も望ましいものをプローブ配列として選択する。前記プローブＤＮＡは、標的ＤＮＡに対して特異的に結合できるものであるならば、１つの標的ＤＮＡに対して２以上のプローブＤＮＡが選択されてもよい。

次に、本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法は、ｄ）前記２個の下位配列セットを除外した前記複数の下位配列セットおよび前記共通下位配列セットを対象に、下位配列セット間に一定レベル以上の相同性を有する下位配列が存在しなくなるまで、前記ステップｂ）およびステップｃ）を反復するステップを実行する。

すなわち、ステップｂ）において比較された下位配列セットとして、共通下位配列セットを含む複数の下位配列セットを比較し、さらに前記ステップｃ）に進んで、一定水準以上の相同性を有する下位配列の数が最も多い２個の（共通）下位配列セットを選択し、前記２個の（共通）下位配列セットの配列のうち、前記一定レベル以上の相同性を有する下位配列をまた共通下位配列セットとして選択し、それ以外の下位配列をプローブとして選択する。前記過程を複数の（共通）下位配列セット間に、前記一定水準以上の相同性を有する下位配列が存在しなくなるまで反復する。

次に、本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法は、ｅ）前記一定レベル以上の相同性を有する下位配列が存在しない共通下位配列セットの下位配列をプライマーとして選択するステップを実行する。前記ステップを実行した結果、１つの共通下位配列セットだけが残る場合、この残った共通下位配列セットに含まれる下位配列をプライマーとして選択すればよい。また、二以上の共通下位配列セットが残る場合にも、各共通下位配列セットに含まれる下位配列をプライマーとして選択すればよい。前記プライマーをそのまま使用することもできるが、そのうち一部を選択して使用することもできる。

図４は、本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法の一例を概略的に示した図面である。

理解を助けるために、本例では、５個の標的配列を使用したが、その数に制限されるものではなく、むしろその数が増加するほど本発明は、さらに強力であるということが当業者であれば、容易に理解できるであろう。

図４は、５個の標的配列を一定基準に従って、１塩基対ずつずらして分解することによって作製される下位配列のセットを製造する様子を示す。本発明をより単純化させて説明するために、各下位配列セットは、４個の下位配列から構成されていると図示したが、実際の下位配列は、それよりはるかに多いであろう。

前記で製造された各４個の下位配列から構成される５個の下位配列セットを互いに比較し、一定レベル以上の相同性を有する下位配列の数が最も多い（下位配列ａ、下位配列ｆおよび下位配列ｄの３つ）下位配列セット２および下位配列セット３を選択する。次に、前記３個の下位配列を共通下位配列セット１として選択し、下位配列ｅおよび下位配列ｇをプローブとして選択する。

次に、下位配列セット１、共通下位配列セット１、下位配列セット４および下位配列セット５をさらに比較し、一定レベル以上の相同性を有する下位配列の数が最も多い２個の（共通）下位配列セットを選択する。図４では、前記相同性を有する下位配列の数が下位配列セット１および共通下位配列セット１について２つ（下位配列ａおよび下位配列ｄ）、下位配列セット４および下位配列セット５について２つ（下位配列ｈおよび下位配列ｊ）が同一であった。従って、下位配列セット１および共通下位配列セット１の場合、下位配列ａおよび下位配列ｄを共通下位配列セット２として選択し、下位配列ｂ、下位配列ｃおよび下位配列ｆをプローブとして選択した。また、下位配列セット４および下位配列セット５の場合、下位配列ｈおよび下位配列ｊを共通下位配列セット３として選択し、下位配列ｅ、下位配列ｉ、下位配列ｋおよび下位配列ｌをプローブとして選択した。

次に、前記共通下位配列セット２および共通下位配列セット３について一定水準以上の相同性を有する下位配列の数が最も多い２個の共通下位配列セットを選択するため、その下位配列を比較したが、一定水準以上の相同性を有する下位配列が存在していない。従って、前記共通下位配列セット２および共通下位配列セット３の下位配列ａ、下位配列ｄ、下位配列ｈおよび下位配列ｊをプライマーとして選択した。

本発明の他の一形態は、本発明のプライマー−プローブセットの設計方法によって設計されたプライマー−プローブセットについてのものである。

本発明のさらに他の一形態は、前記プライマー−プローブセット中のプローブセットが基板上に固定化されているマイクロアレイおよび前記プライマー−プローブセット中のプライマーセットを含む標的配列同定用キットについてのものである。

前記マイクロアレイは、本発明によるプライマー−プローブセット中のプローブセットを利用し、本分野の当業者に公知の一般的な方法により製造されうる。例えば、前記基板は、その表面がアミノシラン、ポリ−Ｌ−リジンおよびアルデヒドからなる群から選択される活性基がコーティングされうる。また、前記基板を構成する材料は、シリコンウェーハ、ガラス、石英、金属およびプラスチックからなる群から選択されうる。本発明によるプローブセットを基板に固定化させる方法としては、圧電（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ）方式を利用したマイクロピペッティング（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）法、ピン状のスパッタを利用した方法などを使用できる。

本発明のさらに他の一形態は、前記プライマー−プローブセットを利用して標的配列を同定する方法についてのものである。

本発明による標的配列同定方法は、ａ）本発明によるプライマー−プローブセット中のプライマーセットを利用して標的配列を増幅させるステップと、ｂ）増幅された前記標的配列を本発明によるプライマー−プローブセット中のプローブとハイブリダイズさせるステップと、ｃ）非特異的反応を除去するために洗浄するステップと、ｄ）ハイブリッド形成による蛍光シグナルを検出するステップとを含むことが望ましい。

本発明のさらに他の一形態は本発明によるプライマーおよびプローブセットの設計方法をコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体についてのものである。
本発明は、コンピュータ読み取り可能な記録媒体にコンピュータ（情報処理機能を有する装置をいずれも含む）読み取り可能なコードとして具現することが可能である。コンピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータシステムによって読み取り可能なデータが保存されるあらゆる種類の記録装置を含む。コンピュータ読み取り可能な記録媒体の例としては、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ−Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒｏｎｄａｍ−Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気テープ、フロッピーディスク、光データ保存装置などがある。

以下、本発明を実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲が下記の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
１０種のバクテリア同定のためのプライマー−プローブセットの設計
本実施例では、下記表１のような敗血症または菌血症（ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ）に関連したバクテリアのうち、ストレプトコッカス種に含まれる１０種の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を標的配列とし、その配列を分解して作製された７７の下位配列（表１中、配列番号１〜７７）を使用して、前記バクテリアを同定できるプライマーおよびプローブセットを設計した。前記１０種についての７７の下位配列情報はＲＤＰ２というｒＲＮＡデータベースの公開情報を利用した。

図５は、本実施例で行われたプライマー−プローブセットの設計方法を概略的に示した図面である。まず、前記表１に記載されている７７の配列の１６Ｓ ｒＲＮＡを１塩基対ずつずらして、２０ｂｐ長に分解し、多数の下位配列から構成される下位配列セット７７個を製造した。次に、１種に対して多数の配列が存在する場合、前記多数種に共通する下位配列だけを種代表的な下位配列として選択し、１０個の下位配列セットを製造した。

前記で製造された１０種の下位配列セットを互いに比較し、１００％の相同性を有する下位配列の数が１，４８０個と最も多いストレプトコッカス・ベスチブラリスの下位配列８およびストレプトコッカス・サリバリウスの下位配列９を選択し、前記１，４８０個の下位配列を共通下位配列セットＧ０として選択し、それ以外の相同性を有さない下位配列をプローブとして選択した。次に、下位配列セット１〜７、共通下位配列セットＧ０および下位配列セット１０を互いに比較し、１００％の相同性を有する下位配列の数が１，１０６個と最も多い肺炎球菌の下位配列１および微好気性連鎖球菌の下位配列２を選択し、前記１，１０６個の下位配列を共通下位配列セットＧ１として選択し、それ以外の相同性を有さない下位配列をプローブとして選択した。以後、前記共通下位配列セットＧ１、下位配列セット３〜７、共通下位配列セットＧ０および下位配列セット１０に対して前記ステップを反復した。その結果、５４個の下位配列から構成される共通下位配列セットＧ８だけ残った。前記Ｇ８の下位配列５４個をプライマーとして選択した。

（実施例２）
１０種のバクテリア同定のためのプライマー−プローブセットの設計
本実施例では、２個の下位配列セット選択時の相同性を１００％とする代わりに、９０％以上（２０ｂｐのうち、１個または２個の不一致許容）とした点を除いては、実施例１の方法と同一に実行した。

図６は、本実施例で行われたプライマーおよびプローブセットの設計方法を概略的に示した図面である。製造された１０個の下位配列セットを互いに比較して９０％以上の相同性を有する下位配列の数が１，５３６個と最も多いストレプトコッカス・ベスチブラリスの下位配列３およびストレプトコッカス・サリバリウスの下位配列４を選択し、前記１，５３６個の下位配列を共通下位配列セットＧ０として選択し、９０％未満の相同性を有する下位配列をプローブとして選択した。次に、下位配列セット１および２、共通下位配列セットＧ０および下位配列セット５〜１０を互いに比較して９０％以上の相同性を有する下位配列の数が１，１１７個と最も多い肺炎球菌の下位配列１および微好気性連鎖球菌の下位配列２を選択し、前記１，１１７個の下位配列を共通下位配列セットＧ１として選択し、９０％未満の相同性を有する下位配列をプローブとして選択した。以後、前記共通下位配列セットＧ０およびＧ１および下位配列セット５〜１０に対して前記ステップを反復した。その結果、５３個の下位配列から構成される共通下位配列セットＧ８だけ残った。前記Ｇ８の下位配列５３個をプライマーとして選択した。

（実施例３）
本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法の速度測定
実施例１および実施例２で実行したプライマー−プローブセットの設計方法をコンピュータに実行させるプログラムとして作成し、表１の１０種のバクテリアについての前記プログラムのプライマー−プローブセットの設計速度を従来の多重配列整列法を具現しているプログラムであるＴ−Ｃｏｆｆｅｅ（Ｃ．Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ，Ｄ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｈｅｒｉｎｇａ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ３０２，ｐｐ．２０５−２１７，２０００；ｈｔｔｐ：／／ｉｇｓ−ｓｅｒｖｅｒ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｃｎｏｔｒｅｄ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ＿ｈｏｍｅ＿ｐａｇｅ／ｔ＿ｃｏｆｆｅｅ＿ｈｏｍｅ＿ｐａｇｅ．ｈｔｍｌ）、Ｃｌｕｓｔａｌｗ（Ｃｈｅｎｎａ Ｒ，Ｓｕｇａｗａｒａ Ｈ，Ｋｏｉｋｅ Ｔ，Ｌｏｐｅｚ Ｒ，Ｇｉｂｓｏｎ ＴＪ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｌｕｓｔａｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，Ｊｕｌ，３１（１３），ｐｐ．３４９７−５００；ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｕｎｉｘ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）およびＭｕｓｃｌｅ（Ｅｄｇａｒ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．，ＭＵＳＣＬＥ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２（５），ｐｐ．１７９２−９７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／）と比較した。前記の多重配列整列法は、多重配列整列を基にしたプライマーおよびプローブを設計するための中間ステップとして利用される方法でプライマーおよびプローブ目録を最終的に得るためには、追加的な分析が必要である。しかし、今のところかかる機能を含んでいるプログラムがないので、本発明の方法と前記多重配列整列法自体とを比較する試みを行った。

前記各プログラムは、同じコンピュータスペック（Ｉｎｔｅｌ Ｐｅｎｔｉｕｍ ＩＩＩ Ｘｅｏｎ ７００ＭＨｚ，４ＧＢメモリ，ＧＮＵ／Ｄｅｂｉａｎ Ｌｉｎｕｘ）で行われた。

その結果を下記表２に表した。表２に表した通り、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅを利用した場合、３１，６４１秒経過後に、配列整列を終えないうちにメモリ不足でコンピュータが停止した。ＣｌｕｓｔａｌｗおよびＭｕｓｃｌｅの場合、配列整列にかかった時間はそれぞれ２，５７８秒および６０秒であった。一方、１００％の相同性を設定した実施例１の総所要時間は１７．４秒、９０％以上の相同性を設定した実施例２の総所要時間は７１．８秒と従来の方法より速度が速いということが分かった。

本発明のプライマー−プローブセットを設計する方法、それによって設計されたプライマー−プローブセット、該セットを含むキット、該方法をコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、および該セットを利用した標的配列の同定方法は、例えば、標的配列同定関連の技術分野に効果的に適用可能である。

従来の多重配列整列法を概略的に示した図面である。 本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法を表すフローチャートである。 本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法の下位配列セット製造ステップを概略的に示した図面である。 本発明によるプライマー−プローブセットの設計方法の一例を概略的に示した図面である。 本発明の一実施例で行われたプライマー−プローブセットの設計方法を概略的に示した図面である（下位配列セット比較時の相同性：１００％）。 本発明の他の実施例で行われたプライマー−プローブセットの設計方法を概略的に示した図面である（下位配列セット比較時の相同性：９０％以上）。

Claims (11)

1. ａ）複数の標的配列を一定基準に従って、１塩基対ずつずらして分解することによって作製される下位配列を含む、前記標的配列のそれぞれに対応する下位配列セットを製造するステップと、
   ｂ）複数の前記下位配列セットを比較し、一定水準以上の相同性を有する下位配列の数が最も多い２個の下位配列セットを選択するステップと、
   ｃ）前記２個の下位配列セットに含まれる、前記一定水準以上の相同性を有する下位配列から構成される配列群を共通下位配列セットとして選択し、前記一定水準以上の相同性を有する下位配列以外の下位配列をプローブとして選択するステップと、
   ｄ）前記２個の下位配列セットを除外した前記複数の下位配列セットおよび前記共通下位配列セットを対象に、下位配列セット間に前記一定水準以上の相同性を有する下位配列が存在しなくなるまで、前記ステップｂ）およびステップｃ）を反復するステップと、
   ｅ）前記一定レベル以上の相同性を有する下位配列が存在しない共通下位配列セットの下位配列をプライマーとして選択するステップと、
   を含む増幅およびハイブリダイゼーションによる標的配列の同定に使われるプライマー−プローブセットを設計する方法。
2. 前記ステップａ）の基準は、塩基長、ハイブリダイゼーション融点（Ｔｍ）、ＧＣ含有量、自己整列、変異位置、反復配列程度および３’末端の塩基構成からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記ステップｂ）における２個の下位配列セットの選択は、熱力学的特性および位置情報を考慮して行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 請求項１に記載の方法によって設計されたプライマー−プローブセット。
5. 請求項４に記載のプライマー−プローブセット中のプライマーセットを含む標的配列同定用キット。
6. 請求項４に記載のプライマー−プローブセット中のプローブセットが基板上に固定化されてなるマイクロアレイ。
7. 前記基板は、その表面にアミノシラン、ポリ−Ｌ−リジンおよびアルデヒドからなる群から選択される活性基がコーティングされていることを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ。
8. 前記基板を構成する材料は、シリコンウェーハ、ガラス、石英、金属およびプラスチックからなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ。
9. 請求項１に記載の方法をコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
10. 請求項４に記載のプライマー−プローブセットを利用して標的配列を同定する方法。
11. ａ）請求項４に記載のプライマー−プローブセット中のプライマーセットを利用して標的配列を増幅させるステップと、
    ｂ）増幅された前記標的配列を請求項４に記載のプライマー−プローブセット中のプローブセットとハイブリダイゼーションさせるステップと、
    ｃ）非特異的反応を除去するために洗浄するステップと、
    ｄ）ハイブリッド形成による蛍光シグナルを検出するステップと、
    を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。

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