JP2009504153A - オリゴヌクレオチド設計および/または核酸検出の方法および/または装置 - Google Patents
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Abstract
Description
(I)増幅される少なくとも1つの標的核酸の少なくとも1つの領域を同定および/または選択するステップと、ここで、領域が平均増幅効率(AE)よりも高いAEを有し、
(II)選択された領域にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを設計するステップと
を任意の順序で含む、核酸検出のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを設計する方法を提供する。
(a)選択されたオリゴヌクレオチドは、40%〜60%のCG含有量を有する;
(b)隣接モデルに基づいて計算される、最も高い自由エネルギーを有することによってオリゴヌクレオチドが選択される;
(c)標的核酸vaおよびvbのオリゴヌクレオチドsaおよびオリゴヌクレオチドsbサブストリングを仮定すると、saと任意の長さmのサブストリングsbとの間のハミング距離に基づいて、ならびに/またはsaおよびオリゴヌクレオチドsbの最長の共通するサブストリングに基づいてsaが選択される;
(d)標的核酸vaに特異的な長さmの任意のオリゴヌクレオチドsaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、オリゴヌクレオチドsaが選択され、長さmのオリゴヌクレオチドsaが標的核酸と異なる核酸とのヒットを有する場合、最小の最大アライメント長および/または最少の数のヒットを有する長さmのオリゴヌクレオチドsaが選択される;ならびに
(e)piが、増幅された標的核酸の位置iにハイブリダイズすると予測される場合、標的核酸の位置iのオリゴヌクレオチドpiが選択される
の少なくとも1つに従って、選択および設計してもよい。
(i)少なくとも1つの生体試料を提供するステップと、
(ii)生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
(iii)生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも1つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、ここで本明細書に記載される本発明の任意の態様による方法を用いることによって、前記オリゴヌクレオチドが設計および/または調製され、
(iv)前記オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させる、および/または標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと
を含む、少なくとも1つの標的核酸を検出する方法を提供する。
次いで、プローブを、生体試料の核酸と接触させ、存在する場合、標的核酸とプローブがハイブリダイズし、標的核酸の存在が検出される。具体的には、検出ステップ(iv)において、vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値は、統計的に、vaに含まれないプローブの平均よりも高く、それによって、生体試料中のvaの存在が示される。
式中、Qa(j)は、瓶bjに見られるPaにおけるプローブのシグナル強度の累積分布関数であり、
(i)少なくとも1つの生体試料を提供するステップと、
(ii)生体試料中に含まれる少なくとも1つの核酸を増幅するステップと、
(iii)生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも1つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを提供するステップと、
(iv)前記オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させ、標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと、ここで、vaにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのシグナル強度の平均値が、vaに含まれないオリゴヌクレオチドの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のvaの存在が示されるステップと
を含む、少なくとも1つの標的核酸を検出する方法を提供する。
第一の態様によると、本発明は、
(i)増幅される少なくとも1つの標的核酸の少なくとも1つの領域を同定および/または選択するステップと、ここで、前記領域が平均増幅効率(AE)よりも高いAEを有し、
(ii)同定および/または選択された領域にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを設計するステップと
を任意の順序で含む、核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供する。
患者試料内にどの標的核酸(例えば病原体)が存在するかは未知なので、増幅ステップおよび/または逆転写(RT)プロセスの間にランダムプライマーを用いて、存在する全てのRNAの、DNAへの公平な逆転写を確実にしてもよい。本発明の目的のために、当分野で公知の任意のランダム増幅方法を用いてもよい。本明細書において、ランダム増幅方法は、RT−PCRであってもよい。
(Sung et al.,2003;CSB)の方法の改良である本発明の方法によると、逆転写のために使用されるプライマーは、固定されたオリゴヌクレオチドタグ(頭部)およびランダムなオリゴヌクレオチド尾部を含む。理論的には、ランダムなオリゴヌクレオチド尾部は、患者試料中の全ての核酸に無差別に結合して、第一の鎖合成を開始するべきである。第二の鎖合成の後、全ての逆転写された配列は、固定されたオリゴヌクレオチドタグ(頭部)を両端に有する。これらの配列を、プライマーとして固定されたオリゴヌクレオチドタグ(頭部)を用いて少なくとも長さ10000bpのPCR産物を生じてPCRによって増幅する。具体的には、増幅されたPCR産物の大部分は、長さが500〜1000bpの間である。特定の実施形態によると、逆転写(RT)のために使用される26塩基長のプライマーは、9塩基長のランダムな尾部を有する固定された17塩基長のタグ:5’−GTTTCCCAGTCACGATANNNNNNNNN−3’(配列番号1)を含む。
vaの各位置iについて、Pf(i)およびPr(i)を、ランダムプライマーriが、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてvaの位置iに結合することができる確率とする。簡単にするために、本発明者らは、プライマーのランダムな尾部のヌクレオチド(例えば、図1に示されるようなランダムプライマーの最後の9ヌクレオチド)がvaのリバース相補物のサブストリング(フォワードプライマー)またはvaのサブストリング(リバースプライマー、図1)である場合に、ランダムプライマーがvaにのみ結合できると仮定する。確立したプライマー設計基準(Wu and Ugozzoli,1991)に基づいて、本発明者らは、riが有意なプライマー−二量体を形成するか、極端な融解温度を有する場合に、Pf(i)が低いと推定した。他方では、riが、いかなる有意なプライマー−二量体も形成せず、最適な融解温度を有した場合、Pf(i)は高い。ランダムプライマーの固定されたオリゴヌクレオチドタグ(頭部)(例えば、図1に示されるような固定された17塩基長のタグ)は、vaと類似しており、これはまた、結合を助け、より高いPf(i)を生じる場合がある。同様に、Pf(i)を計算した。
ウイルスvaのためのプローブ選択のための増幅効率スコアの閾値を、AES値vaの累積分布関数によって判定する。Xを、vaの全てのプローブのAES値を表す確率変数とする。kを、vaにおけるプローブの数とする。このとき、本発明者らは、AES値がx以下である確率を
プローブ選択のために、P(pi|va)≧λである場合にプローブpiを選択する。本発明者らの実験において、本発明者らは、λ=0.8に設定した。この閾値(上位20%AES)で、本発明者らは、期待されるプローブの50%より多くが、異なる臨床試料に再現性良くハイブリダイズすることを観察した。より高いAES(例えば、上位10%AES)を有するプローブを用いることによって、再現性が向上するが、これによって、種のレベルで10未満までいくつかのゲノムに残っている特有のプローブの数が減少し、結果として、アレイが病原体を特異的に同定する能力が損なわれる。したがって、上位20%AESを用いた。
<プローブ設計>
選択される領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブの設計のステップ(ii)は、当分野で公知のプローブ設計技術のいずれか1つに選択してもよい。以下の説明はプローブ設計に関するが、プライマーの設計、具体的にはRT−PCRのためのプライマーの設計にも、同じ原理が適用されることが当業者に明らかになる。
(a)均質性、感度および特異性の確立されたプローブ設計基準(Sung,W.K.et al.,2003,CSB)
(b)ヒトゲノムゲノムに対する有意な配列類似性はない
(c)本明細書に記載されているように、例えばRT−PCRによってAEスコアを用いて効率的に増幅される
の少なくとも1つを考慮して設計してもよい。
均質性は、類似した融解温度を有するプローブの選択を要する。低いCG含有量を有するプローブが、信頼できるハイブリダイゼーションシグナル強度を生じないこと、および高いCG含有量を有するプローブが非特異的結合を通して高いシグナル強度を生じる性向を有するがわかった。したがって、選択されたプローブのCG含有量が40%〜60%であるべきであることが確立できた。
(a)saとウイルスゲノムvb由来の任意の長さmのサブストリングsbとの間のハミング距離が0.25mより多く、
(b)saおよびsbの最も長い共通するサブストリングが15未満である
場合、vaに特異的である。
検出される標的核酸がヒトから(例えば、ウイルスゲノムを含むヒト試料)抽出される場合、ヒトゲノムに対して高い相同性を有するプローブもまた避けられるべきである。したがって、標的核酸vaに特異的な長さmの任意のプローブsaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、プローブsaが選択され、長さmのプローブsaが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および/または最少の数のヒットを有する長さmのプローブsaが選択される。具体的には、任意の長さmのプローブsaについて、BLASTアルゴリズムで、ヒトゲノムとのsaのヒットが見られる(Altschul,S.F.et al.,1997)。(W=15)のBLAST文字列サイズおよび100の期待値を用いて、全てのヒットを見出した。ヒトゲノムといかなるヒットも有さない、すなわち、vaに特異的である場合、saを選択する。しかしながら、vaの長さmの全てのサブストリングがヒトゲノムとヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および最少の数のヒットを有するものを選択した。
(a)選択されたプローブが、40%〜60%のCG含有量を有する;
(b)隣接モデルに基づいて計算される最も高い自由エネルギーを有することによってプローブが選択される;
(c)標的核酸vaおよびvbのプローブsaおよびプローブsbサブストリングを仮定すると、saと標的核酸vb由来の任意の長さmのサブストリングsbの間のハミング距離および/もしくはsaおよびプローブsbの最も長い共通するサブストリングに基づいて、saが選択される;
(d)標的核酸vaに特異的な長さmの任意のプローブsaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、プローブsaが選択され、長さmのプローブsaが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および/もしくは最少の数のヒットを有する長さmのプローブsaが選択される;ならびに/または
(e)piが増幅された標的核酸の位置iにハイブリダイズすると予測される場合、標的核酸の位置iのプローブpiが選択される
の少なくとも1つに従って、選択および/または設計してもよい。
本発明の別の態様によると、上述のように少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを選択および/または設計する方法は、選択および/または設計されたプローブを調製するステップをさらに含む。プローブを設計することは、その配列を理解すること、および/または任意の適した手段によって、例えばソフトウエアを使用することによってそれを設計することを含む。プローブを調製するステップは、その物理的調製を含む。プローブは、当分野で公知の任意の標準的な方法に従って調製してもよい。例えば、プローブは、化学的に合成するか、またはクローニングによって調製してもよい。例えば、Sambrook and Russel,2001に記載されているように。
生体試料は、哺乳動物、例えばヒトから採取される、任意の試料であってもよい。生体試料は、血液、体液、唾液、尿、便等であってもよい。生体試料は、増幅ステップを行う前に生体試料中に含まれる核酸を取り除くよう処理してもよい。標的核酸は、検出されることが意図される任意の核酸であってもよい。検出される標的核酸は、少なくとも、生体試料の核酸にとって外因性である核酸であってもよい。したがって、生体試料がヒトに由来する場合、検出される外因性標的核酸(生体試料中に存在する場合)は、ヒト由来でない核酸である。本発明の態様によると、検出される標的核酸は、少なくとも、病原体ゲノムまたはその断片である。病原体核酸は、少なくとも、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の核酸、またはその断片であってもよい。
実施例部分に記載されている特定の実験によると、本発明者らは、シンガポールにおけるウイルス疾患の最も一般的な原因を代表するいくつかのウイルスゲノムを選択した。Genbankからダウンロードした全ゲノム配列を使用して、ゲノム全体にわたってタイリングされたオーバーラップ5塩基の解像度の40塩基長のプローブを生成した。Nimblegen技術(Nuwaysir,E.F.et al.,2002)を用いて、各ウイルスプローブの7つの複製を、マイクロアレイ上に直接合成した。マイクロアレイ上でプローブをランダムに分配して、ハイブリダイゼーションのアーチファクトの効果を最小限にした。試料の、プローブへの非特異的ハイブリダイゼーションを制御するために、10,000のオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に設計および合成した。これらの10,000のオリゴヌクレオチドは、ヒトゲノムに対して、または病原性ゲノムに対していかなる配列類似性も有さなかった。これらは40〜60%のCG含有量を有するランダムプローブであった。これらのプローブは、バックグラウンドシグナル強度を評価した。陽性対照として、免疫応答において公知または推定される機能を有するヒト遺伝子に対する400のオリゴヌクレオチドプローブをアレイ上で合成した。合計およそ380,000のプローブについて、植物ウイルス、PMMVを陰性対照として含めた。以下の説明において、病原体検出チップ分析(PDCとも呼ばれる)に関連して、本発明が、より具体的に説明される。しかしながら、分析(方法)は、この特定の実施形態に限定されず、本出願の内容全体にわたって記載されるような本発明のいくつかの態様を包含する。
別の態様によると、本発明は、
(i)生体試料を提供するステップと、
(ii)生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
(iii)生体試料中に存在する場合、少なくとも1つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを提供するステップと、ここで、前記プローブが、本明細書に記載される本発明の任意の態様による方法を用いることによって調製され、
(iv)プローブを増幅された核酸と接触させ、少なくとも1つの標的核酸にハイブリダイズしたプローブを検出するステップと
を含む、少なくとも1つの標的核酸を検出する方法を提供する。
(i)少なくとも1つの生体試料を提供するステップと、
(ii)生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
(iii)生体試料中に存在する場合、少なくとも1つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを提供するステップと、
(iv)プローブを増幅された核酸と接触させ、標的核酸にハイブリダイズしたプローブを検出するステップと、ここで、vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、vaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のvaの存在が示されるステップと
を含む、少なくとも1つの標的核酸を検出する方法を提供する。
ウイルスの異なる領域によって提示されるシグナル強度の変動がそれらの対応する増幅効率スコアと直接的な相関を有するかどうかを検証するために、ヒトに影響を及ぼす一般的な病原体、ヒト呼吸器多核体ウイルスB(RSV−B)に関して、合計5つのマイクロアレイ実験を行った。
以下の説明において、病原体検出チップ分析(PDCとも呼ばれる)に関連して、本発明をより具体的に説明する。しかしながら、分析(方法)は、この特定の実施形態に限定されず、本出願の内容全体にわたって記載されるような、本発明のいくつかの態様を包含する。したがって、具体的には、ウイルスゲノムのセットV={v1,v2,・・・,vn}のために設計される長さmのプローブのセットP={p1,P2,・・・,pI}を有するPDC仮定すると、病原体検出チップ分析の問題は、チップデータに基づいて試料中に存在するウイルスを検出することである。本明細書で、チップデータは、PDC上のプローブシグナルによって提供される集合的な情報をいう。したがって、チップデータD={d1,d2,・・・,dx}は、PDC上のプローブセットPの対応するシグナルのセットである。
本発明において提供されるアルゴリズムおよび/または方法を行うことできるソフトウエアをどのようにして構成するかは、当業者に周知である。したがって、本発明はまた、本発明の任意の実施形態によるアルゴリズムおよび/または方法を行うよう構成されたソフトウエアおよび/またはコンピュータプログラム製品も提供する。少なくとも1つの電子記憶媒体もまた提供される。電子記憶媒体は、コンピュータハードドライブ、CD−ROM、フラッシュメモリー素子(例えば、USBメモリ)、フロッピー(登録商標)ディスク、または当分野の任意の他の電子記憶媒体であってもよい。ソフトウエアは、パソコン、メインフレーム、および任意の計算処理装置上で実行されてもよく、具体的な構成は、当業者に公知である。
本発明者らは、シンガポールにおけるウイルス疾患の最も一般的な原因を代表する35のウイルスゲノムを選択した(上記の表1参照)。
デング熱細胞系(ATCC #VR−1254)をATCC推奨のように培養し、Sin850 SARS細胞系を記載されているように(Vega et al.,2004)培養した。臨床材料(鼻咽頭洗浄液)を、インドネシアの小児科集団から得て、RNAゾル(Leedo Medical Laboratories,Inc.,Friendswood,TX)中、−80℃で保存した。全ては特定の呼吸器疾患の臨床兆候を示す、肺炎の疑いのある7〜38月齢の間の患者であった。製造業者の使用説明書に従って(Smalling et al.,2002;Tang et al.,1999)、RNAゾルでRNAを抽出した。抽出されたRNAを、RNA保存溶液(Ambion、米国)に再懸濁し、必要になるまで−80℃で保存した。Bohlander et al.and Wang et al.(Wang et al.,2002;Bohlander et al.,1992)によって記載されたプロトコルに基づいて、タグを付けられたランダムプライマーを用いてRNAをcDNAに逆転写した。次いでこれまでに記載されているように(Wong et al.,2002)、cDNAをランダムPCRによって増幅し、断片化し、ビオチン標識で末端標識し、マイクロアレイ上にハイブリダイズさせ、染色した。本発明者らの最初の実験において本発明者らは、プローブGC含有量によって、シグナル強度がプローブGC含有量に正比例して増加する、シグナル強度測定におけるアーチファクトが生じる可能性があることを見出した。0.82MのTMACをNimblegenの専売特許のTMACハイブリダイゼーションバッファーに加えることによって、このアーチファクトが排除された。
2μlの精製された患者RNA、5UのMuLV逆転写酵素、8Uの組換えRNアーゼ阻害剤、UNGを含まない10μlの2XユニバーサルPCRマスターミックス(全てApplied Biosystemsから)、0.9μMのプライマーおよび0.2μMのプローブを含有する20μlの反応混合物。ABI Prism 7900HT配列検出システム(Applied Biosystems)において、リアルタイムRT−PCR反応を行った。48℃で30分間RTを行い、続いてDNAポリメラーゼの活性化のために95℃で10分間行った。95℃で15秒間および60℃で1分間の40サイクルによってRT産物の増幅を行った。陰性対照およびプラスミドクローンの段階希釈(陽性対照)を各PCRアッセイに含んだ。増幅の間、各熱サイクルで蛍光発光をモニタリングした。閾値(CT)は、有意な蛍光が最初に検出されるサイクルを表す。既知の濃度の対照プラスミドを用いることによって、CT値をコピー数に変換した。RSVについては、2.61×109コピーが11.897のCT値を有したが、hMPVについては、7.51×109コピーが10.51のCT値を有した。
陽性対照としての使用のために、ヒトコロナウイルスOC43、229Eおよびライノウイルス16の凍結した生きた培養物を、ATCC(Cat# VR−1558,VR−740,VR−283)から購入した。製造業者の使用説明書に従ってRNAミニキット(Qiagen,Germany)を用いて、これらの培養物からRNAを抽出した。以下の診断用プライマー対:パンコロナウイルス(Cor−FW,Cor−RV)、OC43(OC43−FW,OC43−RV)、229E(229E−FW,229E−RV)、ライノウイルス(アンプリマー1,アンプリマー2)を用いて、これまでに記載されているように試料を増幅した(Moes et al.,2005;Deffernez et al.,2004)。
本発明者らの病原体マイクロアレイは、35のウイルスゲノムV={v1,v2,・・・,v35}について異なるプローブハイブリダイゼーションサインに分けられた、40塩基長のプローブのセットP={p1,p2,・・・,ps}を含有する。病原体核酸のハイブリダイゼーションの際に、プローブセットPに対応するプローブシグナル強度データのセットD={d1,d2,・・・,ds}が生じる。
ウイルスvaが存在する場合、次いでそのハイブリダイゼーションサインを含むプローブ(vaに含まれるプローブ)は、t統計(片側T検定)によって判定すると、vaに含まれないプローブよりも統計的に高いシグナル強度を有するべきである。
PDA v.1は、重み付きカルバック・ライブラー検定およびZスコア変換(WKLスコア)で始まり、正規性についてのアンダーソン・ダーリン検定が続く、一連の統計試験を含む。
H0:WKLスコアの分布は正規であり、すなわちウイルスは試料中に存在しない。
H1:WKLスコアの分布は正規でなく、すなわち少なくとも1つのウイルスが試料中に存在する。
<定義>
アンダーソン・ダーリン検定は、
H0:データは特定分布に従う。
Ha:データは特定分布に従わない。
検定統計:アンダーソン・ダーリン検定統計は、
A2=−N−S
として定義され、
式中、
有意性レベル:α
臨界領域:アンダーソン・ダーリン検定についての臨界値は、試験されている特定分布に依存する。いくつかの特定分布(正規、対数正規、指数関数、ワイブル、ロジスティック、極値分布1型)についての表集計値および式は、公開されている(Stephens,1974,1976,1977,1979)。検定は片側検定であり、分布が特定の形態であるという仮説は、検定統計Aが臨界値よりも大きい場合に拒絶される。
として定義される。
ウイルスセットVおよびプローブセットPを有する病原体マイクロアレイデータDを仮定し、
Vpresent=Fとし、
Vに含まれる全てのvについて、DWKLを
1.正規性についてのアンダーソン・ダーリン検定でDWKLの正規性を判定する。DWKLが有意性レベル0.05の正規分布である場合、Vpresentを返す。そうでなければステップ2に進む。
2.最も高いWKL(Pa‖Pa')を有するウイルスvaをDWKLから見つける。
Vpresent=Vpresent∪{va};DWKL=DWKL−{WKL(Pa‖Pa')}とする;ステップ1に進む。
3.検出されたSPSを除去し、WKL分布が正規であることを検証する。
4.分布が正規でない場合、ステップ2に戻って重感染している病原体を見つける。
臨床材料中の未知の病原体を同定するためには、プライマー特異的増幅よりもランダムプライマー増幅が好ましい。しかしながら、既知の病原体を同定するためのランダムプライミング増幅を用いた最初の実験において本発明者らは、しばしば配列多型によって説明されない、ゲノム領域に渡る不完全なハイブリダイゼーションを観察した(図7C)。ゲノム二次構造、プローブ二次構造およびプローブGC含有量もまた、これらの低シグナル強度プローブを説明することができなかった。したがって本発明者らは、不完全なハイブリダイゼーションが、ランダムプライマーが逆転写(RT)ステップでウイルスゲノムに結合する能力の差異から生じるPCRバイアスによるかもしれないという仮説を立てた。本発明者らの実験において使用されるランダムプライマーは、固定された17塩基長の配列(5’−GTTTCCCAGTCACGATA)(配列番号1)でタグを付けられたランダムノナマー(3’)で構成される26塩基長であり(図1も参照)、ここで固定された5’タグの目的は、RT産物のPCRを容易にして、10000bp未満のPCR断片、具体的には500〜1000bpのPCR断片を生じることであった(Pang et al.,2005;Wang et al.,2002;Wang et al.,2003)。この現象を研究するために本発明者らは、アルゴリズム(AES)を設計して実験データを用いてRT−PCRプロセスをモデリングした。成功するRT−PCRはプライマーが鋳型に結合する能力に依存する。鋳型との間の二量体およびヘアピン形成等のプライマー内二次構造形成。タグとノナマーとの間の二量体およびヘアピン形成等のプライマー内二次構造形成、ならびにプローブ融解温度は、結合効率に影響を及ぼすことが公知である(Nguyen and Southern,2000;Ratushna et al.,2005)。
臨床材料はしばしば、ゲノム増幅のために準最適である。それらは低いウイルス価を有するか、アレイ上の参考菌株由来の配列多型を有するか、または重感染している病原体を有する場合がある。マイクロアレイはまた、非特異的ハイブリダイゼーションおよび他のアーチファクト由来の内部雑音を有する。したがってマイクロアレイデータを解釈することは、プローブシグナル強度プロフィールをSPSに適合させるか、または単純な統計的手法(例えば、T検定、ANOVA等)を用いる簡単な問題ではない。この問題を扱うために本発明者らは、コンピュータ内で予測されるSPSと関連してプローブシグナル強度の分布を分析して、ハイブリダイズした試料中に存在する病原体を同定する、ロバスト統計ソフトウエア、PDA v.1を確立した(上記参照)。
本発明者らは図11に示されるワークフローに従って、33の臨床材料を本発明者らの病原体マイクロアレイ基盤にハイブリダイズすることによって、本発明者らの基盤を評価した。これらのうち27の標本は、予めRSV A、RSV−Bまたはメタニューモウイルスと診断されていた。本発明者らの基盤は21/27の試料から病原体を正確に検出した。ウイルスが検出されなかった6つの試料(偽陰性)は、リアルタイムPCRによる検出限界(<10ウイルスコピー/反応)であり、このような低いウイルス量は患者の深刻な疾患に関与する病原因子である可能性は低かった。これらのうち2つは、マイクロアレイによってライノウイルスに感染していると正しく診断された。未知の病原体によって引き起こされた深刻な呼吸器疾患を有する別の6人の患者のスクリーニングにおいて、マイクロアレイは試料のうちの1つにおいて、病原因子(ライノウイルス)を同定した(上記の表4)。リアルタイムPCRによってこれらの結果を検証した。期待されたように本発明者らは、非ウイルス性病因を有する肺炎患者から抽出された試料をハイブリダイズさせた場合、いかなる病原体も検出しなかった。
Axon 4000bスキャナーおよびGenepix 4ソフトウエア(Axon Instruments)を用いて、5μm分解能でマイクロアレイをスキャンした。Nimblescan 2.1ソフトウエア(NimbleGen Systems)を用いてシグナル強度を抽出した。自動化スクリプトを使用して本発明者らは、各プローブの7つの複製からメジアンシグナル強度(ハイブリダイゼーションアーチファクトを排除するため)および標準偏差を計算した。プローブシグナル強度をゲノムによって分類し、配列順に配置し、次いでJava(登録商標) Treeview(http://jtreeview.sourceforge.net)でシグナル強度を図式的に見るために、CDT形式に再フォーマットした。並行してPDA v.1を用いてプローブメジアンシグナル強度を分析して、どの病原体が存在するか、および関連する予測の信頼水準を判定した。本発明者らは実験を行って、実験結果に対するプローブ設計の効果を示し、次いで本発明による分析アルゴリズムのロバスト性を示した。
ヒトに影響を及ぼす35のウイルス由来の53555の40塩基長のプローブを含有するPDCを、4つの独立したマイクロアレイ実験に使用した。これらの53555のプローブを、各ウイルスの5bpのタイリングに基づいて選択し、プローブ設計基準のいずれにも供さなかった。したがって本発明者らは、CG含有量、クロスハイブリダイゼーションおよび不十分な増幅によって生じる誤差が、うまく設計されたプローブを有するPDCのものよりも有意に高いと期待した。本発明者らは4つの実験についてのこのような不利な設定において、本発明者らの分析アルゴリズムを試験した。
マイクロアレイ上のクロスハイブリダイゼーションを予測するのに利用可能なアルゴリズムはほとんどなく、1つのアルゴリズム、E−Predictだけが、マイクロアレイ上で病原体を検出することについて報告および検証されている(Urisman et al.,2005;Li et al.,2005)。E−Predictは、ハイブリダイゼーションサインを各マイクロアレイプローブについてのハイブリダイゼーションの理論的自由エネルギーに由来する、予測されるサインと適合させる。しかしながらE−predictを用いて本発明者らのマイクロアレイを分析すると、多くの偽陽性信号を生じた(上記の表5参照)。例えばE−Predictは、RSV患者412においてコロナウイルスを検出した(図15)。パンコロナウイルスプライマーならびにOC43および229Eコロナウイルスのための特定の診断用プライマーを用いた診断用PCRによって、患者412のコロナウイルスの非存在が確認された(上記の表4参照)。本発明者らは、E−Predictを用いた偽陽性信号が、ヒトまたはRSVゲノムとクロスハイブリダイズするコロナウイルスプローブから生じたという仮説を立てた。実際に最も高いシグナル強度を有する50のコロナウイルスプローブの85%がヒトゲノムとクロスハイブリダイズすると予測され、65%がRSVに関して17未満のHDを有し、これは家族性クロスハイブリダイゼーションについての本発明者らの12のHD閾値のすぐ上である。さらにE−Predictを最適化して、ヒトゲノムへのクロスハイブリダイゼーションが重要な考慮すべき事柄であるタイリングアレイの代わりに、ウイルスゲノム領域の間で高度に保存されたプローブを含有するマイクロアレイ上で機能させた。したがってこれらの2つの要因−異なるマイクロアレイ設計戦略およびヒトゲノムへのクロスハイブリダイゼーションは、本発明者らの基盤に関してE−predictの貧弱な性能に寄与するようである。本発明者らのE−predictでの経験から、PDA v1はそれらは異なるプローブ長について設計され、他の適用および基盤について最適化されているので、他のアルゴリズムと比較するのは公正ではない。
クロスハイブリダイゼーション閾値を経験的に判定することによって、本発明者らは、臨床試料中に存在する特定のウイルスとよくハイブリダイズするプローブのみを含むコンピュータ内での病原体サインプローブセットを作製した。AESアルゴリズムによってユニバーサルプライマータグを設計して、ウイルスゲノム全体を効率的に増幅することが可能になった。PDA v.1検出アルゴリズムとともに、臨床試料由来のマイクロアレイ上に示される病原体のいずれかを確実に同定することができる。この手法によって、各病原体ハイブリダイゼーションサインの経験的な検証の必要性が排除され、病原体同定の強力な診断の基盤となる、10000を越える病原体についてのプローブを含有する将来のマイクロアレイが可能になる。
本発明者らは、病原体検出マイクロアレイの設計および分析を最適化し、病院におけるそれらの使用を容易にした。本発明者らは、ランダムPCRにおいて日常的に使用されるプライマータグが偏っており、病原体ゲノムの不均一な増幅を生じることを発見した。この偏りは、本発明者らのAESアルゴリズムを用いてプライマーを設計することによって避けることができる。本発明者らのコンピュータ内でのサインプローブセットによって、どのプローブがアレイ上に示されるいずれかの病原体にハイブリダイズするかを正確に予測することができる。PDA v.1検出アルゴリズムとともに、この手法によって、各病原体ハイブリダイゼーションサインの経験的な検証の必要性が排除され、病原体同定のための強力な診断の基盤となる10000を越える病原体についてのプローブを含有する将来のマイクロアレイが可能になる。
Claims (93)
- (I)増幅される少なくとも1つの標的核酸の少なくとも1つの領域を同定および/または選択するステップと、ここで、領域が平均増幅効率(AE)よりも高いAEを有し、
(II)同定および/または選択された領域にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを設計するステップと
を任意の順序で含む、核酸検出のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを設計する方法。 - 選択される領域のAEが、フォワードプライマーriが位置iに結合することができ、リバースプライマーrjが標的核酸の位置jに結合することができる確率である、増幅効率スコア(AES)として計算され、および|i−j|が、増幅されることが所望される標的核酸の領域である、請求項1に記載の方法。
- |i−j|が10000bp以下である、請求項2に記載の方法。
- |i−j|が1000bp以下である、請求項2に記載の方法。
- |i−j|が500bp以下である、請求項2に記載の方法。
- ステップ(I)が、幾何学的増幅バイアスまたは標的核酸の各位置の効果を判定すること、および平均増幅効率(AE)よりも高いAEを有する領域として増幅される少なくとも1つの領域を選択することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 幾何学的増幅バイアスがPCRバイアスである、請求項6に記載の方法。
- 選択される領域にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、以下の基準:
(a)選択されたオリゴヌクレオチドは、40%〜60%のCG含有量を有する;
(b)オリゴヌクレオチドは、隣接モデルに基づいて計算される、最も高い自由エネルギーを有することによって選択される;
(c)標的核酸vaおよびvbのオリゴヌクレオチドsaおよびオリゴヌクレオチドsbサブストリングを仮定すると、saはsaと標的核酸vb由来の任意の長さmのサブストリングsbとの間のハミング距離ならびに/またはsaおよびオリゴヌクレオチドsbの最も長い共通するサブストリングに基づいて選択される;
(d)標的核酸vaに特異的な長さmの任意のオリゴヌクレオチドsaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、オリゴヌクレオチドsaが選択され、長さmのオリゴヌクレオチドsaが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および/または最少の数のヒットを有する長さmのオリゴヌクレオチドsaが選択される;ならびに
(e)piが、増幅された標的核酸の位置iにハイブリダイズすると予測される場合、標的核酸の位置iのオリゴヌクレオチドpiが選択される
の少なくとも1つに従って選択および設計される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。 - P(pi|va)>λであり、式中λが0.5であり、P(pi|va)が、piが標的核酸vaの位置iにハイブリダイズする確率である場合、基準(e)に基づいて、標的核酸vaの位置Iのオリゴヌクレオチドpiが選択される、請求項8に記載の方法。
- λが0.8である、請求項9に記載の方法。
- 選択および/または設計されるオリゴヌクレオチドを調製するステップをさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- (i)少なくとも1つの生体試料を提供するステップと、
(ii)生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
(iii)生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも1つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、ここで請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法に従って前記オリゴヌクレオチドが設計および/または調製され、
(iv)前記オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させるステップおよび/または標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと
を含む、少なくとも1つの標的核酸を検出する方法。 - 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅ステップが、少なくとも1つのランダムフォワードプライマーおよび/または少なくとも1つのリバースランダムプライマーの存在下で行われる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅ステップがRT−PCRである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅ステップが、フォワードおよびリバースプライマーを含み、フォワードおよびリバースプライマーのそれぞれが、5’−3’配向で、不変のプライマー頭部および可変のプライマー尾部を含み、少なくとも可変の尾部が、標的核酸vaの一部にハイブリダイズする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅ステップが、配列番号1のヌクレオチド配列またはそのバリアントもしくは誘導体を有するフォワードおよび/またはリバースランダムプライマーを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 検出される標的核酸が、生体試料の核酸にとって外因性の核酸である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 検出される標的核酸が、少なくとも、病原体ゲノムまたはその断片である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 病原体核酸が、少なくとも、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の核酸、またはその断片である、請求項21に記載の方法。
- 生体試料がヒトから得られ、標的核酸が生体試料中に存在する場合、前記標的核酸はヒト由来でない、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- プローブが不溶性支持体上に配置される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 不溶性支持体がマイクロアレイである、請求項24に記載の方法。
- 検出ステップ(iv)において、vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、vaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のvaの存在が示される、請求項13〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 検出ステップ(iv)において、vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、vaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有しvaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む請求項13〜25のいずれか一項に記載の方法であって、プローブvaのシグナル強度の密度分布が、vaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって生体試料中のvaの存在が示される方法。
- 検出ステップ(iv)において、生体試料中の少なくとも1つの標的核酸の存在が、0.1以下のt検定の値および/または0.05以下のアンダーソン・ダーリン検定値および/または1.0以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項13〜25のいずれか一項に記載の方法。
- t検定値が0.05以下である、請求項28に記載の方法。
- 重み付きカルバック・ライブラー情報量の値が5.0以上である、請求項28または請求項29に記載の方法。
- 標的核酸vaの非存在を表す各サインプローブセット(SPS)が、正規分布したシグナル強度および/または5より小さい重み付きカルバック・ライブラー(WKL)情報量スコアを有する、請求項31に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的核酸vaの存在を表す各サインプローブセット(SPS)が、正に歪んでいるシグナル強度分布および/または5より大きい重み付きカルバック・ライブラー(WKL)情報量スコアを有する、請求項32に記載の方法。
- WKLスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、P>0.05の結果が、それによって標的核酸vaの非存在を示す、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
- WKLスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、P<0.05の結果が、それによって、標的核酸vaの存在を示す、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
- さらなるアンダーソン・ダーリン検定が行われ、それによってさらなる重感染している標的核酸の存在が示される、請求項35に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的核酸vaに対する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含み、vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値がvaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによってvaの存在が示される、少なくとも1つの標的核酸vaの存在を判定する方法。
- vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、vaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するvaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含み、プローブvaのシグナル強度の密度分布がvaに含まれないプローブのものより正に歪んでおり、それによってvaの存在が示される、請求項37に記載の方法。
- 少なくとも1つの生体試料中の少なくとも1つの標的核酸の存在が、0.1以下のt検定の値および/または0.05以下のアンダーソン・ダーリン検定値および/または1.0以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項37または請求項38に記載の方法。
- t検定値が0.05以下である、請求項39に記載の方法。
- 重み付きカルバック・ライブラー情報量の値が5.0以上である、請求項39または請求項40に記載の方法。
- (i)少なくとも1つの生体試料を提供するステップと、
(ii)生体試料中に含まれる少なくとも1つの核酸を増幅するステップと、
(iii)生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも1つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを提供するステップと、
(iv)プローブを増幅された核酸と接触させ、標的核酸にハイブリダイズしたプローブを検出するステップと、ここで、vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、vaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のvaの存在が示されるステップと
を含む、少なくとも1つの標的核酸を検出する方法。 - ステップ(iv)において、vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、vaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するvaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含む請求項42に記載の方法であって、プローブvaのシグナル強度の密度分布が、vaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって生体試料中のvaの存在が示される、方法。
- ステップ(iv)において、少なくとも1つの生体試料中の少なくとも1つの標的核酸の存在が、0.1以下のt検定の値および/または0.05以下のアンダーソン・ダーリン検定値および/または1.0以上の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項42または請求項43に記載の方法。
- t検定値が0.05以下である、請求項44に記載の方法。
- 重み付きカルバック・ライブラー情報量の値が5.0以上である、請求項44または請求項45に記載の方法。
- 検出される標的核酸が、生体試料の核酸にとって外因性の核酸である、請求項37〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 検出される標的核酸が、少なくとも1つの病原体ゲノムまたはその断片である、請求項37〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 病原体核酸が、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の少なくとも1つの核酸、またはその断片である、請求項48に記載の方法。
- 生体試料がヒトから得られ、標的核酸が、生体試料中に存在する場合、ヒトゲノム由来でない、請求項37〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのプローブが、不溶性支持体上に配置される、請求項37〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 支持体がマイクロアレイである、請求項51に記載の方法。
- (I)増幅される少なくとも1つの標的核酸の少なくとも1つの領域を同定および/または選択する、ここで、前記領域が平均増幅効率(AE)よりも高いAEを有する、ならびに
(II)同定および/または選択される領域にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを設計する
ように構成された、核酸検出のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを設計するための装置。 - 選択される領域のAEが、フォワードプライマーriが位置iに結合することができ、リバースプライマーrjが標的核酸の位置jに結合することができる確率である、増幅効率スコア(AES)として計算され、および|i−j|が、増幅されることが所望される標的核酸の領域である、請求項53に記載の装置。
- |i−j|が10000bp以下、1000bp以下、または500bp以下である、請求項54に記載の装置。
- ステップ(I)が、幾何学的増幅バイアスまたは標的核酸の各位置の効果を判定すること、および平均増幅効率(AE)よりも高いAEを有する領域として増幅される少なくとも1つの領域を選択することを含む、請求項53〜55のいずれか一項に記載の装置。
- 幾何学的増幅バイアスがPCRバイアスである、請求項56に記載の装置。
- 選択される領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが、以下の基準:
(a)選択されたオリゴヌクレオチドが、40%〜60%のCG含有量を有する;
(b)オリゴヌクレオチドが、隣接モデルに基づいて計算される最も高い自由エネルギーを有することによって選択される;
(c)標的核酸vaおよびvbのオリゴヌクレオチドsaおよびオリゴヌクレオチドsbサブストリングを仮定すると、saがsaと標的核酸vb由来の任意の長さmのサブストリングsbとの間のハミング距離および/またはsaおよびオリゴヌクレオチドsbの最も長い共通するサブストリングに基づいて選択される;
(d)標的核酸vaに特異的な長さmの任意のオリゴヌクレオチドsaについて、標的核酸と異なる核酸のいずれの領域ともいかなるヒットも有さない場合、オリゴヌクレオチドsaが選択され、長さmのオリゴヌクレオチドsaが標的核酸と異なる核酸とヒットを有する場合、最も小さい最大アライメント長および/または最少の数のヒットを有する長さmのオリゴヌクレオチドsaが選択される;ならびに
(e)標的核酸の位置iの少なくとも1つのオリゴヌクレオチドpiが、piが、増幅された標的核酸の位置iにハイブリダイズすると予測される場合に選択される
の少なくとも1つに従って選択および/または設計される、請求項53〜57のいずれか一項に記載の装置。 - P(pi|va)>λであり、式中λが0.5であり、P(pi|va)が、piが標的核酸vaの位置iにハイブリダイズする確率である場合に、基準(e)に基づいて、標的核酸vaの位置iのオリゴヌクレオチドpiが選択される、請求項58に記載の装置。
- λが0.8である、請求項59に記載の装置。
- 構成が、選択および/または設計されたオリゴヌクレオチドを調製するステップをさらに含む、請求項53〜61のいずれか一項に記載の装置。
- 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブおよび/またはプライマーである、請求項53〜62のいずれか一項に記載の装置。
- (i)少なくとも1つの生体試料を提供するステップと、
(ii)生体試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
(iii)生体試料中に標的核酸が存在する場合、少なくとも1つの標的核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、ここで前記オリゴヌクレオチドが、請求項53〜63のいずれか一項に記載の装置に従って構成されている装置に従って設計および/または調製され、
(iv)オリゴヌクレオチドを増幅された核酸と接触させる、および/または標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出するステップと
のいずれか1つのステップを含む、少なくとも1つの標的核酸を検出するよう構成された装置。 - 増幅ステップが、少なくとも1つのランダムフォワードプライマーおよび/または少なくとも1つのリバースランダムプライマーの存在下で行われる、請求項53〜64のいずれか一項に記載の装置。
- 増幅ステップがRT−PCRである、請求項53〜65のいずれか一項に記載の装置。
- 増幅ステップが、フォワードおよびリバースプライマーを含み、フォワードおよびリバースプライマーのそれぞれが、5’−3’配向で、不変のプライマー頭部および可変のプライマー尾部を含み、少なくとも可変の尾部は、標的核酸vaの一部にハイブリダイズする、請求項53〜67のいずれか一項に記載の装置。
- 増幅ステップが、配列番号1のヌクレオチド配列またはそのバリアントもしくは誘導体を有するフォワードおよび/またはリバースランダムプライマーを含む、請求項53〜68のいずれか一項に記載の装置。
- 検出される標的核酸が、生体試料の核酸にとって外因性である少なくとも1つの核酸である、請求項53〜69のいずれか一項に記載の装置。
- 検出される標的核酸が、少なくとも1つの病原体ゲノムまたはその断片である、請求項53〜69のいずれか一項に記載の装置。
- 病原体核酸が、ウイルス、寄生生物、もしくは細菌由来の少なくとも1つの核酸、またはその断片である、請求項71に記載の装置。
- 生体試料がヒトから得られ、標的核酸が生体試料中に存在する場合、前記標的核酸がヒト由来でない、請求項53〜72のいずれか一項に記載の装置。
- 少なくとも1つのプローブを配置する少なくとも1つの不溶性支持体を含む、請求項53〜73のいずれか一項に記載の装置。
- 不溶性支持体がマイクロアレイである、請求項74に記載の装置。
- 検出ステップ(iv)において、vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、vaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高く、それによって生体試料中のvaの存在が示される、請求項64〜75のいずれか一項に記載の装置。
- 検出ステップ(iv)において、vaにハイブリダイズするプローブのシグナル強度の平均値が、vaに含まれないプローブの平均値よりも統計的に高いことを特徴とし、高いシグナル強度を有する検出方法において使用されるプローブの割合に対する、高いシグナル強度を有するvaに含まれないプローブの割合の相対的差異を計算するステップをさらに含むよう構成された請求項64〜75のいずれか一項に記載の装置であって、プローブvaのシグナル強度の密度分布がvaに含まれないプローブのものよりも正に歪んでおり、それによって生体試料中のvaの存在が示される、装置。
- 検出ステップ(iv)において、生体試料中の標的核酸の存在が、0.1以下のt検定の値および/または0.05以下のアンダーソン・ダーリン検定値および/または1.0の重み付きカルバック・ライブラー情報量の値によって示される、請求項64〜75のいずれか一項に記載の装置。
- t検定値が0.05以下である、請求項78に記載の装置。
- 重み付きカルバック・ライブラー情報量の値が5.0以上である、請求項78または請求項79に記載の装置。
- 標的核酸の非存在を表す各サインプローブセット(SPS)が、正規分布したシグナル強度および/または5より小さい重み付きカルバック・ライブラー(WKL)情報量スコアを有する、請求項81に記載の装置。
- 少なくとも1つの標的核酸の存在を表す各サインプローブセット(SPS)が、正に歪んでいるシグナル強度分布および/または5より大きい重み付きカルバック・ライブラー(WKL)情報量スコアを有する、請求項81に記載の装置。
- WKLスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、P>0.05の結果が、それによって標的核酸の非存在を示す、請求項81〜83のいずれか一項に記載の装置。
- WKLスコアの分布に関してアンダーソン・ダーリン検定を行うことをさらに含み、P<0.05の結果が、それによって標的核酸の存在を示す、請求項81〜83のいずれか一項に記載の装置。
- さらなるアンダーソン・ダーリン検定が行われ、それによってさらなる重感染している標的核酸の存在が示される、請求項85に記載の装置。
- 少なくとも1つの電子記憶媒体上で構成が記憶される、請求項53〜86のいずれか一項に記載の装置。
- 請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法を行うよう構成された、コンピュータプログラム製品。
- 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを設計するためおよび/または少なくとも1つの標的核酸を検出するために、WKL情報量スコアおよび/またはアンダーソン・ダーリン検定を判定するよう構成されたソフトウエアを含む、コンピュータプログラム製品。
- WKL、アンダーソン・ダーリン検定、オリゴヌクレオチドプローブの設計、オリゴヌクレオチドプライマーの設計、および/または標的核酸の検出が、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法に従って定義される、請求項89に記載のコンピュータプログラム製品。
- 請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法を行うよう構成されたソフトウエアを含む、取り外し可能な電子記憶媒体。
- 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを設計するため、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するため、および/または少なくとも1つの標的核酸を検出するために、WKL情報量スコアおよび/またはアンダーソン・ダーリン検定を判定するよう構成されたソフトウエアを含む、取り外し可能な電子記憶媒体。
- WKL、アンダーソン・ダーリン検定、オリゴヌクレオチドプローブの設計、オリゴヌクレオチドプライマーの設計、および/または標的核酸の検出が、請求項1〜52のいずれか一項に従って定義される、請求項92に記載の取り外し可能な電子記憶媒体。
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