KR102020614B1 - 결핵 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다양한 결핵균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 결핵 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 결핵 진단용 조성물, 결핵 진단용 키트 및 결핵 진단을 위한 방법에 관한 것으로, 결핵균에 대한 민감성이 높기 때문에 유전자 진단의 오류를 줄일 수 있으며, 일정한 온도를 맞출 수 있는 어떠한 조건에서도 유전자를 증폭할 수 있어 결핵을 간편하고 용이하게 진단할 수 있다.
Description
본 발명은 결핵 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 결핵 진단용 조성물, 결핵 진단용 키트 및 결핵 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 rpoB, rimM, IS6110 및 RD1로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 검출함으로써 결핵을 진단하기 위한 결핵 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 결핵 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 감염되어 발병되는 전염병으로 활동성 결핵환자가 기침이나 재채기를 통해 공기중으로 배출된 비말을 통해 주위에 전파된다. 매년 전 세계적으로 결핵으로 인해 사망하는 사람들의 수가 증가하고 있으며, 또한 약물 내성의 증가로 인해서 결핵의 유병률이 점점 증가하고 있다. 결핵의 정확하고 신속한 진단은 결핵 치료로 이어지고 전염성을 조기에 차단할 수 있으므로 중요한 요소이다.
결핵의 진단방법으로는 투베르쿨린 반응, 흉부 X-선 촬영, ROREKA 도말 검사 또는 면역학적 검사에 의하여 진단한다. 현재 결핵을 진단하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법에서는 여러 종류의 유전자 부위를 사용하고 있는데 일반적으로 IS6110, rpoB gene, hsp65 gene 등이 이용되고 있다.
그러나, 상기 PCR 진단법은 실험실 내에서는 검출이 가능하지만 고가의 장비와 전문적인 기술을 요하므로 현장에 직접 적용하기에는 어려움이 많다는 제약을 가지고 있다. 더욱이, 상기 PCR을 이용한 유전 진단은 유전자에 돌연변이가 발생했을 때 질병 원인을 정확하게 진단할 수 없다는 큰 문제점이 있다.
기존에 결핵을 진단하기 위하여 이용된 중합효소 연쇄반응(PCR)은 변성, 접합 및 신장 단계에서 각각 세 가지 온도변화를 주어야 하는 반면에 고리 매개 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal gene amplification, LAMP)은 한 가지 온도에서 DNA 증폭 반응이 일어나기 때문에 중합효소 연쇄반응처럼 별도의 특수한 기기 (PCR machine)가 필요하지 않다. LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) 등온증폭법은 60~65℃에서 1시간 내에 목표 핵산을 109 copies로 증폭시킬 수 있으므로, 64~65℃ 정도의 항온 유지 장치만 있으면 측정 가능하고 검사 시간이 30-60분 정도로 짧고 육안으로 관찰이 가능하며, 간편하고 쉽게 DNA를 증폭할 수 있다.
등온에서 특정 유전자를 증폭시키는 고리 매개 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal gene amplification, LAMP)은 4개의 프라이머를 이용한다. 구체적으로 이너 프라이머(Inner-primer)가 DNA에 먼저 결합하여 신장되고, 이어 그 바깥쪽으로 아우터 프라이머(outer-primer)가 결합되어 신장되면서 가닥 변위가 발생하며 먼저 형성된 가닥은 떨어져 나오게 된다. 떨어져 나온 단일 가닥의 5′-말단에서부터 loop 구조가 형성되며 이는 3′-말단에서도 같은 과정이 반복되고 loop 구조가 신장되게 된다. LAMP를 수행하기 위해서는 증폭시킬 유전자의 6개의 위치를 인식하도록 특별히 고안된 4개의 프라이머를 사용하게 된다. 이는 일반 PCR이 2개의 위치를 인식하는 것과 비교했을 때, LAMP는 target DNA에 대한 특이성이 매우 높아짐을 의미한다(Tsugunori, N. 2007. Loop-mediated isothermal amplification. Nippon Rincho. 65, 957-961.).
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 고리 매개 등온 증폭 반응을 수행할 경우, 다양한 결핵균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 다양한 결핵균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 결핵 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 결핵균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 결핵 진단용 프라이머 세트를 이용한 결핵 진단용 조성물 및 결핵 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 결핵 진단용 조성물 및 결핵 진단용 키트를 이용한 결핵 진단을 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은
서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 rpoB 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 rimM 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 9 내지 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 IS6110 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및
서열번호 13 내지 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 RD1 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 결핵 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열은 결핵을 진단하는데 이용되는 rpoB 유전자를 검출하기 위한 프라이머 서열로서, 서열번호 1 및 2의 프라이머는 각각 정방향(Forward) 및 역방향(Reverse) 아웃터 프라이머이고, 서열번호 3 및 4의 프라이머는 각각 정방향 이너 프라이머(forward inner primer; FIP) 및 역방향 이너 프라이머 (backward inner primer; BIP)이다.
또한, 서열번호 5 내지 8은 결핵을 진단하는데 이용되는 rimM 유전자를 검출하기 위한 서열로서, 서열번호 5 및 6의 프라이머는 각각 정방향(Forward) 및 역방향(Reverse)의 아웃터 프라이머이고, 서열번호 7 및 8의 프라이머는 각각 정방향 내부 프라이머(forward inner primer; FIP) 및 역방향 이너 프라이머 (backward inner primer; BIP)이다. 또한, 서열번호 9 내지 12은 결핵을 진단하는데 이용되는 IS6110 유전자를 검출하기 위한 서열로서, 서열번호 9 및 10의 프라이머는 각각 정방향(Forward) 및 역방향(Reverse) 아웃터 프라이머이고, 서열번호 11 및 12의 프라이머는 각각 정방향 내부 프라이머(forward inner primer; FIP) 및 역방향 이너 프라이머 (backward inner primer; BIP)이다.
또한, 서열번호 13 내지 16은 결핵을 진단하는데 이용되는 RD1 유전자를 검출하기 위한 서열로서, 서열번호 13 및 14의 프라이머는 각각 정방향(Forward) 및 역방향(Reverse) 아웃터 프라이머이고, 서열번호 15 및 16의 프라이머는 각각 정방향 내부 프라이머(forward inner primer; FIP) 및 역방향 내부 프라이머 (backward inner primer; BIP)이다.
상기 용어 “프라이머(Primer)”는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 일컫는 것으로, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지 dNTP(deoxynucleotide triphosphate)의 존재 하에 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 감염균 검출 및 질환 진단의 민감도와 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.
본 발명에 의한 결핵균에 대한 프라이머 세트는
다중 서열 정렬된 복수 개의 유전자의 최소길이부터 최대길이까지의 프라이머 엔트로피(primer entropy)를 계산하여 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 세트 후보들을 생성하는 제1 단계;
상기 제1 단계에서 생성한 프라이머 세트 후보로부터 각각의 프라이머에 대한 이너 프라이머(inner primer) 세트 및 아우터 프라이머(outer primer) 세트를 선정하는 제2 단계; 및
상기 제2 단계에서 생성한 이너 프라이머(inner primer) 세트와 아웃터 프라이머(outer primer) 세트의 페어 매칭(pair matching)하여 최종 고리 매개 등온 증폭(LAMP) 용 프라이머(primer) 세트를 선별하는 제3 단계;를 포함하는 목표 유전자를 검출하기 위한 고리 매개 등온 증폭(LAMP) 프라이머의 설계 방법에 의하여 설계되었다.
구체적으로 다중 서열 정렬된 복수 개의 유전자의 최소길이부터 최대길이까지의 프라이머 엔트로피(primer entropy)를 계산하여 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 세트 후보들을 생성하는 제1 단계는
결핵균의 복수개의 서브타입 유전자 데이터들을 다중 서열 정렬(Multiple sequence alignment) 하는 제1-1 단계;
상기 제1 단계에서 다중 서열 정렬된 데이터에서 각각의 컬럼(column)에 대한 제 1 컬럼 엔트로피(column entropy)를 산출하는 제1-2 단계;
상기 제1-2 단계에서 정렬된 전체 유전자의 서열로부터 첫번째 염기서열로부터 마지막 염기서열까지 시작 위치를 이동하면서 길이를 변화시키면서 정방향, 역방향 후보 프라이머, 및, 정방향 프라이머(Forward primer) 및 역방향 프라이머(Reverse primer)의 프라이머 세트를 생성하는 제 1-3 단계;
상기 제1-3 단계에서 생성된 후보 프라이머 각각에 대해서 상기 제 2단계에서 산출된 제 1 컬럼 엔트로피(column entropy) 값에 프라이머 내에서의 위치 특이성을 반영한 위치 특이적 그래디언트 패널티(gradient penalty) 값을 적용하여 제 2 컬럼 엔트로피를 산출하는 제 1-4 단계;
상기 제 1-3 단계에서 생성된 정방향 프라이머(Forward primer) 및 역방향 프라이머(Reverse primer)의 후보 프라이머 세트에 대해 프라이머 내의 모든 서열에서의 상기 제 2 컬럼 엔트로피를 합산하여 프라이머 엔트로피(primer entropy) 를 산출하는 제 1-5 단계;
상기 제1-5 단계의 프라이머 엔트로피(primer entropy) 값과 프라이머의 길이, GC분률, Tm 온도, hairpin, dimer 점수 중 어느 하나 이상을 반영하여 정방향 및 역방향 프라이머의 프라이머 세트 매칭 점수를 산출하는 제 1-6 단계; 및
상기 제 6 단계의 프라이머 세트 매칭 점수를 바탕으로 정방향 및 역방향 프라이머를 선택하는 제 1-7 단계;를 포함하여 설계되었다.
돌연변이가 빈번한 게놈 서열 영역에서 엔트로피가 증가하는 특징을 이용하여, 본 발명의 일 실시예에서는, 다중 서열 정렬을 통해 얻은 정렬 파일에서 유전 변이가 가장 적은 영역에 대한 검색을 수행하였다. 구체적으로, 다중 서열 정렬 결과를 행렬 배열로 변환하여 행렬의 각각의 컬럼(column)에 대한 섀논 엔트로피(shannon entropy)을 적용하여 제 1 컬럼 엔트로피(Column entropy)를 계산하였다.
본 발명에 의한 목표 유전자를 선택적으로 증폭하기 위한 프라이머의 설계 방법에서는 상기 다중 서열 정렬 결과와 섀넌 엔트로피를 이용한 제 1 컬럼 엔트로피, 및 프라이머 내에서의 각각의 서열의 위치 특이적 조건을 반영한 그래디언트 페날티를 반영한 제 2 컬럼 엔트로피를 합산한 프라이머 엔트로피(primer entropy)를 활용한 프라이머 세트 매칭 점수를 기반으로 보다 유전자 서열의 상보적인 지역을 선별하여 프라이머를 선별할 수 있도록 방법을 제공하는 특징으로 한다.
본 발명의 상기 용어 ‘컬럼 엔트로피(Column entropy)’는 다중 서열 정렬된 유전자 데이터들의 정렬 파일에서 각각의 컬럼(column)의 돌연변이 정도를 섀논 엔트로피(Shannon entropy)를 이용하여 계산한 값을 의미한다.
본 발명에서는 상기 제 1 컬럼 엔트로피에 그래디언트 패널티(gradient penalty)를 적용하여 계산된 컬럼 엔트로피 값을 제 2 컬럼 엔트로피(position entropy)라고 하고, 위치와 길이를 다르게 하여 복수개의 프라이머를 가정하여 생성하고, 각각의 프라이머에 대해 각각의 열에 대한 상기 제 2 컬럼 엔트로피(position entropy) 값을 합산하여 프라이머 엔트로피(primer entropy) 로 정의하였다.
본 발명에 의한 프라이머 설계 방법에 있어서, 상기 제2 단계에서 컬럼 엔트로피(column entropy) 값은 하기 식 1에 따라 계산하는 것을 특징으로 한다.
[식 1]
(상기 식 1 에서 Pa 는 해당위치의 유전자 변이 분율, K는 다중서열 처리를 한 종의 개수로 컬럼 높이, i는 유전자의 특정 위치를 나타냄)
본 발명의 일 실시예에서는, 돌연변이가 빈번한 게놈 서열 영역에서 엔트로피가 증가하는 특징을 이용하여, 다중 서열 정렬을 통해 얻은 정렬 파일에서 유전 변이가 가장 적은 영역에 대한 검색을 수행하였다. 구체적으로, 다중 서열 정렬 결과를 행렬 배열로 변환하여 행렬의 각각의 컬럼(column)에 대한 섀논 엔트로피(shannon entropy)을 적용하여 제 1 컬럼 엔트로피(Column entropy)를 산출하였다. 본 발명의 일 실시예에서는, 프라이머 설계시 저빈도의 유전변이를 무시할 수 있도록 보존분율에 대한 필터링 조건을 선택하는 것이 가능하다. 예를 들어서 5%미만의 유전변이 보고는 실제적으로 자연계에서 발생빈도가 크지 않은 편이므로 해당 변이는 배제할 수 있다.
본 발명에서는 상기 제 1-3 단계에서 다중 서열 정렬된 유전자 데이터 서열의 모든 서열, 즉, 첫번째 염기서열 부터 마지막 염기서열까지 1 bp 간격으로 프라이머의 시작 위치를 이동하면서 15 내지 25 bp 의 길이로 길이를 변경시키면서 후보 프라이머를 생성하고, 이들을 조합한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머의 후보 프라이머 세트를 생성하였다.
본 발명에서는 먼저 이와 같이 위치와 길이를 다양하게 하여 후보 프라이머 및 후보 프라이머 세트를 가정하여 생성하고, 상기 제1-4 단계에서 상기 제 1 컬럼 엔트로피에 후보 프라이머 내에서의 위치 특이적 조건을 반영한 그래디언트 패널티(gradient penalty)를 적용하여 제 2 컬럼 엔트로피(position entropy)를 산출하고, 제 1-5 단계에서는 후보 프라이머 세트 내의 모든 유전자 위치 서열에 대한 상기 제 2 컬럼 엔트로피(position entropy) 값을 합산하여 프라이머 엔트로피(primer entropy) 로 정의하였다.
본 발명에서는 상기 제 1 컬럼 엔트로피에 그래디언트 패널티(gradient penalty)를 적용하여 산출된 수정된 제 1 컬럼 엔트로피 값을 제 2 컬럼 엔트로피(position entropy)라고 하였다. 본 발명에서는 새넌 엔트로피를 적용하는 과정에서 일반적으로 프라이머 길이가 짧은 경우에 나타나는 엔트로피 감소 효과, 및 프라이머의 서열의 3’ 말단에 나타나는 현저한 엔트로피 증가 효과에 대한 위치 특이적 효과의 보정을 위하여 상기 제 1 컬럼 엔트로피(column entropy)값에 그래디언트 패널티(gradient penalty) 값을 적용하여 제 2 컬럼 엔트로피를 산정하였다.
같은 위치에서 시작되는 프라이머인 경우에도 프라이머의 길이가 작은 쪽이 프라이머 길이가 긴쪽보나 낮은 엔트로피를 갖게 된다. 본원 발명에서는 이러한 현상을 보정하고 프라이머의 서열의 3’ 말단과 가까운 위치에서의 유전변이에 중요도를 부여하기 위해서 그래디언트 패널티(gradient penalty) 를 적용하였다. 즉, 본원 발명은 새넌 엔트로피를 적용하는 과정에서 일반적으로 프라이머의 서열 3’ 말단쪽으로 나타나는 프라이머 결합 저하 현상을 엔트로피에 반영하기 위하여 상기 제 1 컬럼 엔트로피(column entropy)값에 그래디언트 패널티(gradient penalty) 값을 적용하여 제 2 컬럼 엔트로피를 산정하였다.
즉, 본 발명에 의한 목표 유전자를 선택적으로 증폭하기 위한 프라이머의 설계 방법에서 제 1 컬럼 엔트로피는 복수개의 유전자 데이터에서 변이가 나타나는 정도를 수치화하였으며, 제 2 컬럼 엔트로피는 프라이머 내에서의 서열마다 프라이머 내에서의 위치 특이적 조건에 따른 영향을 수치화하였다.
본 발명의 목표 유전자를 검출하기 위한 프라이머 설계 방법에 있어서, 상기 제4 단계에서 프라이머 내의 특정 위치 i에서의 그래디언트 패널티(gradient penalty) 값 η(i)는 하기 식 2에 따라 산출하는 것을 특징으로 한다.
[식 2]
(상기 식 2에서 λw는 그래디언트 패널티(gradient penalty)의 가중치, lp는 프라이머 길이, Di는 해당 프라이머의 5’ 말단에서 특정 서열 위치 i까지의 거리, τ(i)는 해당 프라이머의 특정 서열 위치 i에서의 유전적 돌연변이 유형의 수이다.)
이때 그래디언트 패널티의 가중치(λw)는 사용자에 의해 정의될 수 있으며, 0 이상의 값을 갖으며, 초기값은 1로 설정된다.
본 발명의 목표 유전자를 검출하기 위한 프라이머 설계 방법에 있어서, 상기 제 1-4 단계에서 후보 프라이머 내의 모든 위치에 대해서 각각의 열에 대한 제 2 컬럼 엔트로피(column entropy) 값은 하기 식 3에 따라 산출하는 것을 특징으로 한다.
[식 3]
(상기 식 3에서, η(i)는 상기 식 2에 의한 특정 위치 i에서의 그래디언트 패널티(gradient penalty), entropy(i)는 상기 식 1에 의한 특정 위치에서의 컬럼 엔트로피이다.)
본 발명의 목표 유전자를 검출하기 위한 프라이머 설계 방법에 있어서, 상기 제 1-5 단계에서 프라이머 엔트로피(primer entropy) 값은 상기 식 3에 의한 제 2 컬럼 엔트로피(column entropy) Q(i)를 이용하여 하기 식 4에 따라 산출하는 것을 특징으로 한다.
[식 4]
(상기 식 4에서 K는 프라이머 길이이고, Q(i)는 상기 식 3에 의한 특정 위치 i에서의 제 2컬럼 엔트로피이다)
본 발명의 목표 유전자를 검출하기 위한 프라이머 설계 방법에 있어서, 상기 제 1-6 단계에서는 상기 제 3 단계에서 생성된 각각의 후보 프라이머에 대한 상기 제1-5 단계에서 산출된 프라이머 엔트로피(primer entropy) 값을 기반으로 후보 프라이머를 조합한 후보 프라이머 세트에 대해 하기 식 5에 따라 각각의 프라이머 세트에 대한 페어 매칭(pair matching) 점수를 산출하는 것을 특징으로 한다;
[식 5]
(상기 식 5에서 Wl, Wg, Wt, Wh, Wd 및 We 는 각각 프라이머 길이, %gc, Tm, 헤어핀 형성, 다이머 형성 및 프라이머 엔트로피에 대한 가중치이다. 이 때 각각의 가중치 Wl, Wg, Wt, Wh, Wd 및 We 는 사용자에 의해 정의될 수 있으며, 0 이상의 값을 갖으며, 초기값은 1로 설정된다.
lf, lr은 각각 정방향과 역방향 프라이머의 길이이며, lo는 사용자 정의에 의한 최적의 프라이머 길이이다.
gcf, gcr은 정방향 및 역방향 프라이머의 %gc, gco는 사용자 정의에 의한 최적의 %gc 이다.
hf, hr 은 정방향 및 역방향 프라이머의 헤어핀 최대 score,
df, dr 은 정방향 및 역방향 프라이머의 이합체(다이머) 최대 score, 및
φf, φr은 상기 식 4에서 산출된 정방향 및 역방향 프라이머에 대한 프라이머 엔트로피임)
엔트로피가 낮더라도, 프라이머로써 적합한 속성을 만족하여야 한다. 본 발명에서는 이를 위하여 프라이머의 길이, GC분율, hairpin 점수, dimer점수, Tm값 중 어느 하나 이상을 반영하여 실험자가 설정한 기준 값을 기준으로 프라이머 세트를 선택하는 것이 가능하다.
Length score = | Optimal length - primer length |
GC분율 = | Optimal GC% - primer GC% |
hairpin 점수 = Max value (3’ hairpin formation), (A/T =2, G/C=4)
dimer점수 = Max value (dimer formation), (A/T =2, G/C=4)
Tm score = | Optimal Tm - primer Tm |
너무 긴 프라이머의 사용은 프라이머 다이머(dimer)를 형성한다거나 주형의 엉뚱한 부분과 결합할 여지가 있는 서열을 더 갖게 되어 결과적으로 비특이 프라이머-주형 결합이 초래될 수 있으므로 적당한 길이에서 선정되는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 프라이머 길이는 10-50 bp 범위에서 채택될 수 있고, 바람직하게는 10-40 bp 범위에서 채택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 10-25 bp 범위에서 채택할 수 있다.
목표 유전자를 검출하기 위한 고리 매개 등온 증폭(LAMP) 프라이머 설계 방법에 있어서, 상기 이너 프라이머 (inner primer) 셋트를 생성하는 제2 단계는,
제1 단계에서 생성한 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머 후보 세트들에 대한 이너 프라이머(inner primer)를 생성하는 제2-1 단계; 및
제1 단계에서 생성한 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머 후보 세트들에 대한 아웃터 프라이머(outer primer)를 생성하는 제 2-2 단계; 를 포함한다.
본 발명의 목표 유전자를 검출하기 위한 고리 매개 등온 증폭(LAMP) 프라이머 설계 방법에 있어서, 제 2 단계에서는 상기 1 단계에서 선정된 프라이머 후보들을 조합하여 이와 같은 고리 프라이머가 생성되기 위한 과정에 적절한 프라이머를 선정하는 것을 특징으로 한다. 먼저 정방향 이너 프라이머인 FIP 및 역방향 이너 프라이머인 BIP 를 선정한 후, 아웃터 프라이머인 F3, B3 를 선정하게 된다. 정방향 프라이머는 주쇄의 3' 에서 5' 방향으로 중합 반응을 일어나는 프라이머를 의미하고, 역방향 프라이머는 주쇄의 5' 에서 3' 방향으로 중합 반응을 일어나게 하는 프라이머를 의미한다.
상기 제 2-1 단계에서는 도 13에서 보는 바와 같이 먼저 제1 단계에서 생성한 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse priemr) 후보들 각각에 대한 이너 프라이머 세트 후보를 선정한다.
먼저 후보 프라이머로 F2c, B2c 지역을 선별하고 상보적인 F2 와 원하는 증폭 길이의 간격을 두고 F1c, B1c 프라이머를 선별하여 각각 F2 및 B2 링크 염기서열에 추가함으로써 프라이머가 조합된 정방향 이너 프라이머 FIP primer의 후보 쌍들을 생성하였다. 이 영역이 등온증폭시 단일 나선으로 노출되어 등온 증폭을 유발하는 핵심적인 프라이머 세트다. 도 13에서 F2 및 F1c 가 결합되어 정방향 이너 프라이머로 기능하는데, 이때 F2와 F1c 사이에 4 내지 5 bp 크기의 스페이서를 연결하는 것도 가능하다.
이때 정방향, 역방향 이너 프라이머 조합 내에서 B2/F2c와 B1/F1c간의 간격을 50bp 내지 60bp로 설계되었다. 이 조건을 만족하는 모든 이너 세트를 선별하였다.
상기 제 2-2 단계에서는 상기 제 2-1 단계에서 생성된 이너 프라이머 세트인 FIP 및 BIF프라이머의 외곽지역을 대상으로 정방향 아웃터 프라이머인 F3프라이머와 역방향 프라이머인 B3 프라이머를 포함하는 아웃터 프라이머 세트를 생성한다.
본 발명의 목표 유전자를 검출하기 위한 고리 매개 등온 증폭(LAMP) 프라이머 설계 방법은 이후 상기 제2 단계에서 생성한 이너 프라이머(inner primer) 세트와 아웃터 프라이머(outer primer) 세트의 페어 매칭(pair matching)하여 최종 고리 매개 등온 증폭(LAMP) 용 프라이머(primer) 세트를 선별하는 제3 단계;를 포함한다.
LAMP 실험에서 상기와 같은 조건을 만족하는 이너 프라이머 세트와 아웃터 프라이머 세트의 프라이머 조합을 선택하는 것은 중요하다. 이를 위하여 이전 단계에서 생성된 이너 프라이머에 대한 아웃터 프라이머의 조합을 상기에 기술된 프라이머 쌍의 점수를 생성했다. 이 과정에서 프라이머 세트 조합의 선택 기준은 사용자가 지정한 산물의 길이 정보를 이용하여 원하는 증폭 길이를 갖는 최적의 등온 증폭(LAMP) 프라이머 세트를 선별하였다.
그 다음, 설계된 프라이머 세트는 해당 strain만을 증폭한다는 것을 확인해야 한다. 이를 위해 모든 유전 정보를 보유하고 있는 NCBI Genbank 데이터베이스를 기반으로 한 blast search를 수행하였고, 최종적으로 이는 해당 strain에 대해 특정 증폭이 이루어지는지 여부를 확인한다.
본 발명의 목표 유전자를 검출하기 위한 고리 매개 등온 증폭(LAMP) 프라이머 설계 방법에 있어서, 이너 프라이머(inner primer) 세트와 아웃터 프라이머 세트에 대한 페어 매칭(pair matching)하여 프라이머 세트를 선정하는 제3 단계는,
이너와 아우터 프라이머(inner/outer primer)의 각각의 프라이머 쌍의 조합을 선별하기 위한 점수법을 이용하여 프라이머 페어 매칭(pair matching) 점수를 산출하는 제3-1 단계;
상기 제3-1 단계의 점수에 따라 생성된 아우터 프라이머 세트와 이너 프라이머 세트의 페어 매칭(pair matching) 점수를 산정하는 제3-2 단계; 및
상기 제3-2 단계에서 산출된 페어 매칭(pair matching) 점수에 따라 등온 증폭(LAMP) 프라이머로 선택하는 제3-3 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 프라이머 페어 매칭 점수는 하기 식 5에 따라 이너와 아우터 프라이머(inner/outer primer)에 대한 각각의 프라이머 세트의 조합을 선별하기 위한 점수법을 이용하여 산출된다.
[식 5]
(상기 식 5에서 Wl, Wg, Wt, Wh, Wd 및 We 는 각각 프라이머 길이, %gc, Tm, 헤어핀 형성, 다이머 형성 및 프라이머 엔트로피에 대한 가중치이다. 이 때 각각의 가중치 Wl, Wg, Wt, Wh, Wd 및 We 는 사용자에 의해 정의될 수 있으며, 0 이상의 값을 갖으며, 초기값은 1로 설정된다.
lf, lr은 각각 정방향과 역방향 프라이머의 길이이며, lo는 사용자 정의에 의한 최적의 프라이머 길이이다.
gcf, gcr은 정방향 및 역방향 프라이머의 %gc, gco는 사용자 정의에 의한 최적의 %gc 이다.
hf, hr 은 정방향 및 역방향 프라이머의 헤어핀 최대 score,
df, dr 은 정방향 및 역방향 프라이머의 이합체(다이머) 최대 score, 및
φf, φr은 상기 식 4에서 산출된 정방향 및 역방향 프라이머에 대한 프라이머 엔트로피임)
상기 제 3-2 단계에서는 상기 제3-1 단계의 점수에 따라 생성된 아우터 프라이머 세트와 이너 프라이머 세트의 전체 페어 매칭(total pair matching) 점수가 하기 식 6에 의하여 산출된다.
[식 6]
(상기 식 6에서 ρo, ρi는 각각 아웃터 프라이머 세트와 이너 프라이머 세트의 프라이머 페어 매칭 점수이다.)
상기 제3-3 단계에서는 상기 제3-2단계에서의 전체 페어 매칭(total pair matching) 점수를 하기 식 7에 따라 최소값으로 분류하고, 분류한 최소값을 갖는 프라이머(primer) 세트를 등온 증폭(LAMP) 프라이머로 선택한다.
[식 7]
본 발명에서는 먼저 주쇄에 정방향 이너 프라이머인 FIP 가 주쇄에 상보적으로 결합하여 단일 사슬로의 증폭을 시작한 후, 아웃터 프라이머에 의해 상보적으로 결합된 서열을 분리(displacement)하게 된다. 이와 같이 증폭된 단일 사슬이 역방향 프라이머가 작용하는 주쇄 기능을 하게 되며, 역방향 이너 프라이머가 이를 주쇄로 하여 5' 에서 3' 방향으로 상보적으로 결합하여 증폭을 시작한 후, 역방향 아우터 프라이머가 증폭된 단일 서열을 주쇄에서 분리한다. 이와 같이 역방향 이너 아웃터 프라이머로부터 증폭된 단일 서열을 증폭하여 고리 모양을 만들면서 프라이머로 제조된다. 이후 이와 같은 고리 모양의 프라이머를 주쇄로 하여 고리 매개 등온 증폭 반응(Loop-Mediated Isothermal Amplification)이 진행된다.
본 발명에 따른 결핵 진단용 프라이머 세트에 있어서, 상기 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 균주는 M.Tuberculosis(마이코박테리움 투베르큘로시스), M.Bovis(마이코박테리움 보비스), M.Bovis BCG(마이코박테리움 보비스 BCG), M.Africanum (마이코박테리움 아프리카눔) 및 M.Microti(마이코박테리움 마이크로티)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 마이코박테리움 속의 균주인 것을 특징으로 한다.
M.Tuberculosis(마이코박테리움 투베르큘로시스)는 크기가 0.2∼0.5×1∼4㎛ 정도 되는 간균으로서 아포를 형성하지 않고, 편모가 없으며, 가늘고 길쭉한 형태이다. 이 균은 그램 양성균으로서 호기성이며 세포벽의 많은 지질 때문에 항산성을 띤다. 분열 증식한 균은 균집락을 이루는데 이것은 균이 서로 엉겨 붙어 새끼줄처럼 보이는 균삭을 이루고 이 균삭의 형태로 결핵을 유발하게 된다. M.Bovis(마이코박테리움 보비스)는 소 결핵의 원인이 되는 매개체로서 낮은 속도에서 생장하는 혐기성 균이다. 인체 내 결핵을 유발하는 원인균인 M.Tuberculosis와 연관성이 높기 때문에 M.Bovis는 인수공통매개의 균으로서 인체 내에서도 결핵을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, M.Bovis BCG(마이코박테리움 보비스 BCG)는 상기 M.Bovis(마이코박테리움 보비스)의 변종으로 알려져 있다. M.Africanum(마이코박테리움 아프리카눔)은 널리 퍼지지는 않았지만, 일부 아프리카에서는 결핵을 유발하는 주요 원인균이며, M.Microti(마이코박테리움 마이크로티)는 주로 면역이 결핍된 사람에게서 결핵을 유발하는 원인균으로 알려져 있다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 결핵 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 결핵 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 결핵 진단용 키트에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로서 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 예컨대, DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 반응 완충액, 증류수 등으로 구성된 증폭 반응 혼합물을 포함할 수 있으며, 증폭 산물의 검출 여부를 확인할 수 있는 아가로스 및 전기영동 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있으며, 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 개체의 시료로부터 추출된 핵산에 제1항의 프라이머 세트를 처리하여 핵산을 증폭하는 단계; 상기 증폭에 의한 생성물로부터 결핵균의 유전자 검출 유무를 확인하는 단계; 및 상기 유전자의 검출 유무에 따라 결핵균의 감염 여부를 판단하는 단계;를 포함하는 결핵 진단을 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 결핵 진단을 위한 방법에 있어서, 상기 개체의 시료는 혈액, 객담, 침 조직, 소변, 뇌척수액, 늑막액, 및 기관지 세척액으로부터 선택되는 하나 이상의 시료일 수 있으나, 결핵균을 검출할 수 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 “개체의 시료”는 란 개체에서 유래한 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액, 혈액 등의 시료일 수 있다. 또한, 상기 개체의 시료로부터 추출된 핵산은, 검출하고자 하는 감염균의 유전자 마커가 존재하는 표적 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 핵산으로서, DNA 또는 RNA 일 수 있다.
본 발명에 따른 결핵 진단을 위한 방법에 있어서, 상기 증폭은 고리 매개 등온 증폭 반응(Loop-Mediated Isothermal Amplification)에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 결핵 진단을 위한 방법에 있어서, 상기 고리 매개 등온 증폭 반응은 60℃ 내지 65℃에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
등온증폭법은 기존의 PCR 방법과 유사하나, 기존 PCR 방법은 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응 과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소를 사용함으로서 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서, 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문 장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다. 등온증폭반응을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이 중 F3와 FIP(forward inner primer)는 유전자의 5' 방향에 결합하는 프라이머이며, B3와 BIP(backward inner primer)는 3' 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. 또한 FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다.
본 발명에 따른 결핵 진단을 위한 방법에 있어서, 결핵균의 유전자는 rpoB, rimM, IS6110 및 RD1로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 한다.
rpoB 유전자는 박테리아 RNA polymerase의 β-subunit을 encode하는 유전자로서 결핵을 유발하는 것으로 알려져 있고, IS6110은 결핵 균주를 분류하는 유전자로 알려져 있으며, RD1는 결핵균에만 존재하는 유전자로서 결핵균의 특이 단백질인 ESTA-6 및 CFP-10을 생성하는 것으로 알려져 있다. 상기 유전자들은 모두 결핵을 진단하기 위해 검출하는 유전자로 알려져 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지 될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지 될 수 있다.
본 발명에 따른 결핵 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 결핵 진단용 조성물 및 키트는 고리 매개 등온 증폭 방법을 이용하여 다양한 결핵균을 모두 검출할 수 있어 결핵균에 대한 민감성이 높으므로, 유전자 진단의 오류를 줄일 수 있다.
또한, 고리 매개 등온 증폭 반응을 이용함으로써 일정한 온도를 맞출 수 있는 어떠한 조건에서도 유전자를 증폭할 수 있으므로, 결핵을 간편하고 용이하게 진단할 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 실험을 하였을 때의 결과를 나타낸다.
도 3 내지 도 6은 각각 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 프라이머를 이용하여 rpoB, rimM, IS6110 및 RD1 유전자 증폭 실험을 하였을 때의 결과를 나타낸다.
도 3 내지 도 6은 각각 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 프라이머를 이용하여 rpoB, rimM, IS6110 및 RD1 유전자 증폭 실험을 하였을 때의 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: LAMP 프라이머 디자인
결핵균을 검출하기 위해서 본 연구에서는 현재 보고된 6 종의 결핵균(하기 표 1 참조)을 대상으로 다중 서열 정렬을 수행하였다.
| Species | GenBank ID | Sequence length |
| M. Tuberculosis | NC_000962.3 | 4,411,532 bp |
| M. Bovis | CP010332.1 | 4,336,227 bp |
| M. Bovis BCG | NZ_CUWQ01000001.1 | 4,317,624 bp |
| M. Africanum | NC_015758.1 | 4,389,314 bp |
| M. Microti | CP010333.1 | 4,370,115 bp |
이는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex; MTC)에 대한 균종으로서, 상기 균종을 모두 검출할 수 있는 LAMP 프라이머를 설계하였다.
구체적으로, 상기 종들의 4개의 유전자(rpoB, rimM, IS6110, RD1)를 대상으로 본 발명에 따른 알고리즘을 이용하여 LAMP 프라이머 세트를 설계하였다. 설계된 프라이머 세트는 하기 표 2와 같다.
| Gene | Primer type | sequence | length |
| rpoB | Forward | TTCGTTCGAGTGGCTGATC | 19 |
| rpoB | Reverse | GCTGACCACCACACGCT | 17 |
| rpoB | FIP | AACGACATCGACCCGGACGAGCGGGGTGATGTCAA | 35 |
| rpoB | RIP | ACCGCCGAGTTCATCAACAACAATTGATGATGAACGTGCCCT | 42 |
| rimM | Forward | ACAATCAACAACGTTTCGCT | 20 |
| rimM | Reverse | CAGCTGGTGGGGCTTAT | 17 |
| rimM | FIP | ATCACTCGGTGGACGACACAAATTTCGTCAAGCGCT | 36 |
| rimM | RIP | ACGCACAAACGGCACCAAAACCGGGGAGGGTGTTGGTGTCGT | 42 |
| IS6110 | Forward | GGTTTGCGGTGGGGTGTCGA | 20 |
| IS6110 | Reverse | GACAGGCCGAGTTTGGT | 17 |
| IS6110 | FIP | TGCTCCTTGAGTTCGCCATCGCGAGCTGGGTGTGCCGAT | 39 |
| IS6110 | RIP | TCCACGCCGCCAACTACTTCGACGGTGCATCTGG | 34 |
| RD1 | Forward | CAGGATGTGTGGGGCGTAGA | 20 |
| RD1 | Reverse | ATCTTGRACCTGCCCCTC | 18 |
| RD1 | FIP | GCGGTGAGTGTGTGGCGACATCGGTATTGGGGGCGCA | 37 |
| RD1 | RIP | CTGCGTGACGATCCAAGTCGGGAACTCGCCGACAAA | 36 |
비교예: 종래 알려진 LAMP 프라이머의 설계
| 유전자 이름 | 방향 | 서열 | 길이 |
| rpoB | Forward | ACTCGACATCCTCGATGGAC | 20 |
| Reverse | CCAACAAGAAGGCGTACTCG | 20 | |
| Forward inner | GGTTGGATGCCTGCCTCGGCATACGGATAGGGGATCTCAGT | 41 | |
| Reverse inner | AGCGGTCGGAAGCTCCTATGACAGGGTTTG ATCAGCTCGGTCT | 43 | |
| IS6110 | Forward | TGATCCGGCCACAGCC | 16 |
| Reverse | TCGTGGAAGCGACCCG | 16 | |
| Forward inner | GCTACCCACAGCCGGTTAGGTGTCCCGCCGATCTCGT | 37 | |
| Reverse inner | TCACCTATGTGTCGACCTGGGCGCCCAGGATCCTGCGA | 38 | |
| rimM | Forward | CTAAGGGGCCTTTTGACGG | 19 |
| Reverse | CACCACTTCGGTGACGACAC | 20 | |
| Forward inner | TCCAGCGAGTCGCACCAACAGTTTGGCAGTGCGGTGAGTTACGTC | 45 | |
| Reverse inner | GACGCCGATGACTTGCCCCCTTTTTCGCCGTCTGGACCATAAGC | 44 | |
| RD1 | Forward | CTGGCTCAGGACGAACG | 17 |
| Reverse | GCTCATCCCACACCGC | 16 | |
| Forward inner | CACCCACGTGTTACTCATGCAAGTCGAACGGAAAGGTCT | 39 | |
| Reverse inner | TCGGGATAAGCCTGGACCACAAGACATGCATCCCGT | 36 |
실험예 1: 유전자 증폭 실험
상기 실시예 및 비교예를 통해 제조한 프라이머를 이용하여 유전자 증폭을 확인하였다.
구체적으로, 반응 조건은 TB의 각 유전자에 대한 gDNA를 추출하여 희석을 통해 해당 조건 copy수에 template DNA를 준비하였다.
LAMP실험 수행을 위해서 10X buffer, 10mM dNTP, 실시에 및 비교예를 통해 제작한 Forward/Reverse primer (10pmol)와 FIP/BIP primer(20pmol), 및 Bst Polymerase(8U)을 이용하였다.
각 반응에 대한 유전자 증폭 산물의 양을 측정하기 위해서 Quant studio를 이용하여 30초마다 30초간 유전자 증폭 산물의 양을 측정하였다. LAMP 반응은 60℃에서 30분간 수행하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 1에서 확인할 수 있듯이 비교예의 프라이머를 이용한 경우에는 증폭이 미미하였으나, 도 2와 같이 본 발명에 따른 실시예의 프라이머를 이용하나 경우에는 102 copy까지 안정적으로 증폭됨을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 프라이머를 이용할 경우, 결핵균을 검출하기 위한 민감도가 우수한 것을 알 수 있다.
도 3 내지 도 6은 각각 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 프라이머를 이용하여 rpoB, rimM, IS6110 및 RD1 유전자 증폭 실험을 하였을 때의 결과를 나타낸다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpoB Forward
<400> 1
ttcgttcgag tggctgatc 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpoB Reverse
<400> 2
gctgaccacc acacgct 17
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpoB FIP
<400> 3
aacgacatcg acccggacga gcggggtgat gtcaa 35
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpoB RIP
<400> 4
accgccgagt tcatcaacaa caattgatga tgaacgtgcc ct 42
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rimM Forward
<400> 5
acaatcaaca acgtttcgct 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rimM Reverse
<400> 6
cagctggtgg ggcttat 17
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rimM FIP
<400> 7
atcactcggt ggacgacaca aatttcgtca agcgct 36
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rimM RIP
<400> 8
acgcacaaac ggcaccaaaa ccggggaggg tgttggtgtc gt 42
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IS6110 Forward
<400> 9
ggtttgcggt ggggtgtcga 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IS6110 Reverse
<400> 10
gacaggccga gtttggt 17
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IS6110 FIP
<400> 11
tgctccttga gttcgccatc gcgagctggg tgtgccgat 39
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IS6110 RIP
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tccacgccgc caactacttc gacggtgcat ctgg 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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atcttgracc tgcccctc 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RD1 FIP
<400> 15
gcggtgagtg tgtggcgaca tcggtattgg gggcgca 37
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<213> Artificial Sequence
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<223> RD1 RIP
<400> 16
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<223> rpoB Forward
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actcgacatc ctcgatggac 20
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<223> rpoB Reverse
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ccaacaagaa ggcgtactcg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> rpoB Forward inner
<400> 19
ggttggatgc ctgcctcggc atacggatag gggatctcag t 41
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpoB Reverse inner
<400> 20
agcggtcgga agctcctatg acagggtttg atcagctcgg tct 43
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IS6110 Forward
<400> 21
tgatccggcc acagcc 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IS6110 Reverse
<400> 22
tcgtggaagc gacccg 16
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IS6110 Forward inner
<400> 23
gctacccaca gccggttagg tgtcccgccg atctcgt 37
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IS6110 Reverse inner
<400> 24
tcacctatgt gtcgacctgg gcgcccagga tcctgcga 38
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rimM Forward
<400> 25
ctaaggggcc ttttgacgg 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rimM Reverse
<400> 26
caccacttcg gtgacgacac 20
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rimM Forward inner
<400> 27
tccagcgagt cgcaccaaca gtttggcagt gcggtgagtt acgtc 45
<210> 28
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rimM Reverse inner
<400> 28
gacgccgatg acttgccccc tttttcgccg tctggaccat aagc 44
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RD1 Forward
<400> 29
ctggctcagg acgaacg 17
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RD1 Reverse
<400> 30
gctcatccca caccgc 16
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RD1 Forward inner
<400> 31
cacccacgtg ttactcatgc aagtcgaacg gaaaggtct 39
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RD1 Reverse inner
<400> 32
tcgggataag cctggaccac aagacatgca tcccgt 36
Claims (10)
- 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 rpoB 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 rimM 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 9 내지 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 IS6110 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및
서열번호 13 내지 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 RD1 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 를 모두 포함하는,
결핵 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 균주는 M.Tuberculosis(마이코박테리움 투베르큘로시스), M.Bovis(마이코박테리움 보비스), M.Bovis BCG(마이코박테리움 보비스 BCG), M.Africanum (마이코박테리움 아프리카눔) 및 M.Microti(마이코박테리움 마이크로티)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 마이코박테리움 속의 균주인 것인,
결핵 진단용 프라이머 세트.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는,
결핵 진단용 조성물.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는,
결핵 진단용 키트.
- 제4항에 있어서,
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로서 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼를 더 포함하는 것인,
결핵 진단용 키트.
- 개체의 시료로부터 추출된 핵산에 제1항의 프라이머 세트를 처리하여 핵산을 증폭하는 단계;
상기 증폭에 의한 생성물로부터 결핵균의 유전자 검출 유무를 확인하는 단계; 및
상기 유전자의 검출 유무에 따라 결핵균의 감염 여부를 판단하는 단계;를 포함하는,
결핵 진단을 위한 정보제공 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 개체의 시료는 혈액, 객담, 침 조직, 소변, 뇌척수액, 늑막액 및 기관지 세척액으로부터 선택되는 하나 이상의 시료인 것인,
결핵 진단을 위한 정보제공 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 증폭은 고리 매개 등온 증폭 반응(Loop-Mediated Isothermal Amplification)에 의해 수행되는 것인,
결핵 진단을 위한 정보제공 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 고리 매개 등온 증폭 반응은 60℃ 내지 65℃에서 수행되는 것인,
결핵 진단을 위한 정보제공 방법.
- 제6항에 있어서,
결핵균의 유전자는 rpoB, rimM, IS6110 및 RD1로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자인 것인,
결핵 진단을 위한 정보제공 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180108476A KR102020614B1 (ko) | 2018-09-11 | 2018-09-11 | 결핵 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| PCT/KR2018/013316 WO2020054906A1 (ko) | 2018-09-11 | 2018-11-05 | 목표 유전자를 검출하기 위한 프라이머의 설계 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180108476A KR102020614B1 (ko) | 2018-09-11 | 2018-09-11 | 결핵 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102020614B1 true KR102020614B1 (ko) | 2019-09-11 |
Family
ID=67949037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180108476A KR102020614B1 (ko) | 2018-09-11 | 2018-09-11 | 결핵 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102020614B1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080052585A (ko) * | 2005-08-12 | 2008-06-11 | 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 | 올리고뉴클레오티드 디자인 및/또는 핵산 탐지 방법및/또는 장치 |
| KR20100031188A (ko) * | 2008-09-12 | 2010-03-22 | 주식회사 엘지생명과학 | 결핵균군 또는 마이코박테리아 속 검출용 조성물 및 이를 이용한 실시간 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 결핵균 및 마이코박테리아 속의 동시 분석 방법 |
-
2018
- 2018-09-11 KR KR1020180108476A patent/KR102020614B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080052585A (ko) * | 2005-08-12 | 2008-06-11 | 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 | 올리고뉴클레오티드 디자인 및/또는 핵산 탐지 방법및/또는 장치 |
| KR20100031188A (ko) * | 2008-09-12 | 2010-03-22 | 주식회사 엘지생명과학 | 결핵균군 또는 마이코박테리아 속 검출용 조성물 및 이를 이용한 실시간 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 결핵균 및 마이코박테리아 속의 동시 분석 방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Bioinformatics, 2015, 제31권, 제9호, 1472-1474 페이지 * |
| BMC Bioinformatics, 2013, 제14권, 아티클 번호 255, 1-9 페이지 * |
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