JP2009509499A - 遺伝子配列分析のための多重ポリメラーゼ連鎖反応 - Google Patents

Abstract

一般に多数の遺伝子標的の増幅法及びマイクロアレイを用いた増幅産物の分析法を提供すること。
【課題】多数の遺伝子標的の増幅法及びマイクロアレイを用いた増幅産物の分析法を提供する。
【解決手段】
あらかじめ定義されたセットの病原体からの１またはそれ以上の病原体核酸を含むことが疑われる生物学的試料を提供すること；試料に、あらかじめ定義された病原体のセットに認められる遺伝子に対応する複数のＰＣＲプライマーを添加すること；および遺伝子に対応する核酸のサブセットを増幅するために試料に関するポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、を含むＰＣＲ方法。但し、上記プライマーは、各々の病原体について少なくとも１つのプライマー対を含み、および上記プライマーは、あらかじめ定義されたセットの病原体のいずれのＤＮＡまたは試料中のいずれのバックグラウンドＤＮＡにも相同でないテール配列を含む。ポリメラーゼ連鎖反応における少なくとも１個のプライマーの濃度は約１００ｎＭ以下である。

Description

本発明は、一般に多数の遺伝子標的の増幅方法およびマイクロアレイを用いた増幅産物の分析に関する。

ヒトにおいて急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）を引き起こす感染性病原体の正確で迅速な同定は、呼吸器疾病の治療成功、適切な集団発生管理措置の適用、および貴重な抗生物質と抗ウイルス薬の効率的な使用において決定的に重要な因子であり得る。しかし、ＡＲＩの臨床鑑別診断は、異なる病原体によって引き起こされる症状の類似性およびそれらの病原因子の数と生物学的多様性のゆえに困難である。現在、呼吸器病原体同定のために最も広く使用されている方法は、培養、免疫測定法およびＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲアッセイである。培養と免疫測定手法は一般に特定病原体に特異的であり、それ自体、種のレベルおよび時として血清型レベルで１つの疑わしい病原因子を検出することに限定される。これに対し、ＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲなどの核酸に基づく手法は多用途であり、選好性またはさもなければ培養の困難な生物を含む、すべての病原体の検出において高い感受性を提供する。ＰＣＲの多用途な性質のゆえに、その手法は多数の病原因子に同時に適用することができ、詳細な病因を確立する可能性を高め（非特許文献１）、２以上の病原体に関わる同時感染の正確な検出を可能にする（非特許文献２）。

ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，"Ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ，ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ"Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ，１９，３１４−３２２（２００５） Ｇｒｏｎｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｎｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｃａｕｓｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ：ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３７，１−７（１９９９）

ＡＲＩ病原因子は症候学的に（ｓｙｍｐｔｏｍｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）非特異的であり得るので、多重（マルチプレックス）アプローチによる１つ反応内でのいくつかの生物の検出は望ましい。つまり、一度に１つの病原体を検定することは非効率的であり、起こり得る同時感染についての情報を与えない。これに対処するためにいくつかの多重ＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ試験が開発されてきた（非特許文献３）；（非特許文献４）；（非特許文献５）；（非特許文献６）；（非特許文献７）；（非特許文献８）；（非特許文献９）；（非特許文献１０）；が、そのアプローチは、現在のアンプリコン検出法の識別力によって限定される。ゲルベースの分析アプローチは、その生成物が大きさだけによって識別できる限られた数の病原体に限定される傾向があるのに対し、リアルタイムＰＣＲのような蛍光レポーター系は、３または４時間以内で、明瞭に分割できる蛍光ピークの数によって制限される。そこで、ＡＲＩなどの、多くの潜在的原因を有する疾患症候群の原因である病原体の迅速な識別と同定を可能にする診断アッセイが求められている。

ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ；Ｇｒｏｎｄａｈｌ；Ｐｕｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３０，１６５−１７４（２００４） Ｂｅｌｌａｕ−Ｐｕｊｏｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ−ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １２ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ"Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２６，５３−６３（２００５） Ｍｉｙａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｉｎ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ"Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．，９８，５４２−５５０（２００４） Ｏｓｉｏｗｙ，"Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ，ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ ａｓｓａｙ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６，３１４９−３１５４（１９９８） Ｖｅｒｓｔｒｅｐｅｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ ａｓｓａｙ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３９，４０９３−４０９６（２００１） Ｃｏｉｒａｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒｔｅｅｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｂｙ ｔｗｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ"Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ，７２，４８４−４９５（２００４） Ｃｏｉｒａｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ−ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ"Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ，７６，２５６−２６４（２００５） Ｇｒｕｔｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４２，５５９６−５６０３（２００４）

より多くの病原体をＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ法によって同時に検出することを可能にするいくつかのテクノロジーが開発された。２２までの呼吸器病原体の多重同定が、ＭＡＳＳＣＯＤＥ（商標）マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲシステム（非特許文献１１）によって成された。スポット（特に長いオリゴヌクレオチド）マイクロアレイも、多重ＰＣＲ分析ツールとして使用され、ある程度の成功を収めた（非特許文献１２）；（非特許文献１３）；（非特許文献１４）；（非特許文献１５）；（非特許文献１６）；（非特許文献１７）；（非特許文献１８）；（非特許文献１９）；（非特許文献２０）。これらのシステムの主要な制限は、検出されるハイブリダイゼーション事象が部分配列の相違に対して非感受性であり得るため、同じ生物の密接に関連する菌株を識別できないことである。たとえばスポットマイクロアレイプローブは、２５％も異なる配列と非特異的にクロスハイブリダイズすることがあり、この目に見えない変異は、多型が特異的に定義できれば高度の菌株識別を可能にする十分な情報を担持するという事実を考慮すると、不幸な事実である。

Ｂｒｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ"Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１１，３１０−３１３（２００５） Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，"Ｕｓｅ ｏｆ ａｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４２，４２６８−４２７４（２００４） Ｃｈｉｚｈｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ"Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６７，３２５８−３２６３（２００１）； Ｃｈｉｚｈｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ"Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４０，２３９８−２４０７（２００２）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１５６８７−１５６９２（２００２） Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｖｉｒａｌ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ"ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ，１，Ｅ２（２００３） Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅｓ"Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６８，２５３５−２５４１（２００２） Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １８ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ，１６，１１９−１２７（２００２） Ｃａｌｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ"Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４７，３２９０−３２９５（２００３） Ｃａｌｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｉｘｅｄ−ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｒｅｖｅａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１，６３２−６３９（２００３）

菌株レベルの同定は、密接に関連する生物が非常に異なる臨床結果と疫学パターンを有し得る場合、決定的に重要であり得る。そのような場合、適切な治療と管理ができるように菌株を識別しなければならない。臨床的に関連する百日咳菌とその姉妹種である臨床的に無関係なパラ百日咳菌は古典的な例を提供する。もう１つの例は、ワクチン感受性と非感受性菌株、ならびに循環ヒト単離物と可能性のある人獣共通伝染病菌株（たとえば鳥Ｈ５Ｎ１）の識別が直ちに且つ明らかな価値を有する、インフルエンザウイルスである。

本発明は、あらかじめ決められたセットの病原体からの１またはそれ以上の病原体核酸を含むことが疑われる生物学的試料を用意し；試料に、あらかじめ決められた病原体のセットに認められる遺伝子に対応する複数のＰＣＲプライマーを添加すること；そして試料上でポリメラーゼ連鎖反応を実施して遺伝子に対応する核酸のサブセットを増幅することを含む方法を包含する。プライマーは、各々の病原体について少なくとも１つのプライマー対を含み、およびプライマーは、いずれの病原体のＤＮＡまたは試料中のいずれのバックグラウンドＤＮＡにも相同でないテール配列を含む。ポリメラーゼ連鎖反応における少なくとも１個のプライマーの濃度は、約１００ｎＭ以下である。

説明のためであって限定ではない、以下の説明において、特定の詳細は本発明の十分な理解を与えるために示すものである。しかし、本発明が、これらの特定詳細から逸脱する他の実施形態でも実施し得ることは当業者に明白である。また別の場合、不必要な詳細で本発明の説明をあいまいにしないように周知の方法および装置の詳細な説明は省く。

臨床症候群が単一に病原体に特異的であることはめったになく、それ故多数の候補病原体を試験し、それらを識別することを可能にするアッセイは、公衆衛生の取り組みのために疑いなく有益である。ここで提示する研究は、広いスペクトルの条件下で２０の一般的な呼吸器病原体、ならびに６の生物脅威因子に関する、多重ＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ、リシークエンシングアレイ（ＲＡ）、および自動配列類似性検索および病原体特定−ＲＰＭ ｖ．１システムを組み合わせた、ＲＡアプローチの臨床診断および疫学的監視の潜在的可能性を明らかにする。多重ＰＣＲ増幅の感受性とＲＡの特異性を組み合わせることにより、診断アッセイを評価するときにしばしば見られる特異性と感受性の間の相殺取引を回避し得る。これは、抽出緩衝液中または健常患者の臨床試料にスパイクした複合体混合物としての対照試料を用いて明らかにされた。データはまた、このシステムが、インフルエンザ様疾病を有する患者からの１０１の咽喉スワブ試料を使用して、ＨＡｄＶおよびインフルエンザＡ型ウイルスの両方について受け入れられているＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲおよび培養ベースの方法と等しい感受性を提供することを示す。

短いオリゴヌクレオチドのリシークエンシングアレイ（ＲＡ）は、ＡＲＩ病原体からのＰＣＲアンプリコンの種レベルと菌株レベルの両方の同定を同時に提供し得る。これまでに認識されていない変異体からのユニーク多型を含む、菌株特異的情報が、アレイにタイル状に配置された原型配列からハイブリダイズされた標的を識別する配列相違を明らかにするＲＡの能力によって提供される（特許文献１参照）。これまでの試験は、明白な統計的解釈で、種と菌株の両方のレベルで広いスペクトルの気道病原体同定を達成するために、特注設計の呼吸器病原体マイクロアレイ（ＲＰＭ ｖ．１）を微生物核酸富化、ランダム核酸増幅および自動配列類似性検索を組み合わせた（非特許文献２１）；（非特許文献２２）。しかし、一般的な増幅方法は、低い力価の病原体を有する臨床試料を取り扱うときには限られた成功しか収めてこなかった。本明細書で開示するのは、ランダムな標的増幅に関連する感受性の問題を軽減する改善された多重ＰＣＲ増幅戦略である。ＡＲＩを呈する患者から得た臨床試料を使用した、実際に可能であることを示す実験の成功は、改善された検定時間（８．５時間）での直接配列読取りによる正しい種および菌株レベルの同定を提供しながら、標準参照アッセイ（たとえば培養、米国病理学会（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ）［ＣＡＰ］認定ＰＣＲ）との高い種レベルでの一致が達成できることを明らかにする。それらの結果は、このアプローチが直接自動化および小型化工程を受け入れやすく、それ故診断と監視の両方を目的としたマイクロアレイベースのプラットフォームを導き得ることを示唆する。

ＰｒｏＳｅｑｓ、本出願と同日に出願された、“Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ”と題するＭａｌａｎｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．への米国特許出願第１１／ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ"Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１６（４），５２７−５３５（２００６） ；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ，Ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ"Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１２（４），６３８−６４６（２００６）

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は当技術分野において周知である。本発明の方法は、病原体核酸を含み得る生物学的試料を使用する。この方法は、たとえば健常個体からの検体に関して実施し得るので、病原体核酸の存在を必要としない。予備段階として、病原体核酸を、鼻洗浄液、咽喉スワブ、痰、血液または環境試料などの、しかしこれらに限定されない、臨床試料から抽出し得る。臨床試料は、ヒトを含むがこれに限定されない、いかなる種の生物から入手してもよい。呼吸器病原体、腸病原体、および炭疽菌奉仕などの生物脅威病原体を含むがこれらに限定されない、いかなる種類の病原体も試験し得る。病原体のセットは、たとえば種レベルまたは菌株レベルで定義され得る。

本発明の方法は、病原体に認められ得る遺伝子に対応するＰＣＲプライマーを含む。ＰＣＲプライマーは当分野において周知である。各々の病原体について少なくとも１つのプライマー対が存在する。この方法で使用するプライマーは、病原体のいずれのＤＮＡまたは試料中のいずれのバックグラウンドＤＮＡにも相同でないテール配列を有する。バックグラウンドＤＮＡは、臨床試料が得られた種のＤＮＡであり得る。潜在的テール配列は、ランダムにまたは別の方法で作製でき、たとえばＧｅｎＢａｎｋなどの遺伝子配列のデータベースとの比較によって評価し得る。テール配列は、一般に、テールがいかなる他のプライマーにも相補的でないので、それ自体は病原体ＤＮＡに結合せず、ＰＣＲにおけるプライマー二量体の形成を低減させ得る。ヒトから得た検体に関する使用に適するテールは、
ＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴＡＣＴＡＧＣＧ（プライマーＬ、配列番号１）および
ＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴＡＣＴＡＧＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（プライマーＬＮ、配列番号２）を含むが、これらに限定されない。

１つのＰＣＲにおけるプライマーのセットは、たとえば少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個の異なるプライマーを含み得る。異なる長さの遺伝子に対応するプライマーを同じＰＣＲにおいて使用し得る。たとえば少なくとも５０、１００または２００以下および３０００または２０００以上のヌクレオチド長の増幅核酸が１回のＰＣＲで生産され得る。

これらのプライマーを使用するＰＣＲは、ＰＣＲの分野で一般に知られるおよび本明細書で開示する他の成分または使用装置を含み得る。プライマーの低濃度が反応において使用され得る。１個からすべてのプライマーが約１００ｎＭ以下の濃度で存在し得る。４０−５０ｎＭのようなより低い濃度を使用し得る。

生物学的試料を複数のアリコートに分割し、各々のアリコートに関して異なるプライマーを使用した別々のＰＣＲを実施し得る。ＰＣＲ後にアリコートを再び組み合わせ得る。これは、多数のプライマーを使用するときに実施し得る。ＰＣＲにおいてより多くのプライマーを使用するほど、プライマー二量体の形成を生じやすい。種々のプライマー混合物により、多数のアリコートに関してＰＣＲをより良く最適化し得る。

ＰＣＲ後、病原体の同定を実施し得る。これは、試料を、増幅核酸の少なくとも一部に相補的である複数の核酸配列を含むマイクロアレイに接触させること、および増幅核酸を相補的核酸にハイブリダイズさせることによって実施し得る。そのような方法は（特許文献２）に述べられている。相補的核酸は、２５から２９量体であり得るが、これらに限定されない。そのような短い相補的核酸の使用は、不正対合がマイクロアレイにハイブリダイズする可能性を低下させる。相補的核酸は、増幅核酸の少なくとも１個から全部までに完全にマッチするプローブおよび各々の完全にマッチするプローブの中央位置の３個の異なる一塩基多型を含み得る。この配置は遺伝子の配列全体を決定することを可能にし、そのことが病原体の菌株の同定を可能にし得る。

米国特許出願第１１／１７７，６４６号

ハイブリダイゼーション後、いずれの相補的核酸が増幅核酸にハイブリダイズしたかを検出するために蛍光などの公知の方法を使用し得る。次に、いずれの増幅核酸が検出されるかに基づいて病原体を同定し得る。これは、いずれの遺伝子がアレイにハイブリダイズするかに基づいて病原体を同定する、パターン認識アルゴリズムによって実施し得る。また、上述したようにハイブリダイズした遺伝子の配列決定に基づいても実施し得る。

分子診断手法は、病因因子の迅速で感受性のある同定を可能にする。ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびスポットマイクロアレイ等のような現在の方法は、偽陽性および偽陰性試験結果による誤同定を生じやすく、感受性と特異性の間で直接の相殺取引を受ける傾向がある。試料は、診断的ＰＣＲ増幅のために使用される標的配列に類似の領域も同時に含み得る、バックグラウンド生物の大きくて多様な群から成る。非標的ＤＮＡ（特にヒトＤＮＡ）の遺伝的複雑さは、交差反応性に起因する「偽陽性」産物の増幅を引き起こし得る。加えて、ウイルスは非常に速い速度で突然変異と組換え事象を通して進化し、特に感受性の高い試験を、絶え間ない再設計状態にさせるまたはほとんど即時に陳腐化する。遺伝的変異はまた、それらが感染の持続性と治療および／またはワクチン接種に対する応答に潜在的な影響がある抗原変異と相関し得るので、臨床的にも重要である。現在のＰＣＲ法で遺伝的変異を検討するには、付加的な配列決定工程が常に必要とされる。ＲＰＭ ｖ．１法は、種および菌株レベルで感染病原因子を検出するだけでなく、さらなる実験を必要とせずに微妙なゲノム差異も同定することができる。このアプローチはまた、７個までの病原体を高い感受性と特異性で同時に検出するための有効な手段であり、マイクロアレイ上の適切に選択された原型配列（ＰｒｏＳｅｑｓ）により、病原体についての明白で再現可能な配列に基づく菌株同定を可能にすることが示される。これは、各々の病原体の正確なフィンガープリンティング、抗生物質耐性プロファイリング、遺伝的浮動／シフト分析、法医学的分析、および多くの他のパラメータを許容することにより、臨床管理および局地的流行対策を増強するために有用であり得る。この能力は、鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスおよび生物テロ事象などの新たに生じる疾患の迅速な検出のために極めて貴重であり得る。

本発明を説明したが、以下の実施例は本発明の特定適用を例証するために提示するものである。これらの特定実施例は、本出願において述べる本発明の範囲を限定することを意図しない。

ＲＰＭ ｖ．１チップの設計−ＲＰＭ ｖ．１（呼吸器病原体マイクロアレイ）チップの設計は、２７の呼吸器病原体と生物兵器因子からの２９．７ｋｂの配列のリシークエンシングを可能にする５７のタイル状に配置された領域を含み、以前の試験において詳細に述べられている（非特許文献２３）。簡単に述べると、ＲＰＭアレイは、標的生物のゲノムから選択される配列内の各々の塩基である（およびそれを中心とする）連続的な２５量体の完全にマッチするプローブから成る。さらに、各々の完全にマッチするプローブについて、中央位置の３つの可能な一塩基多型（ＳＮＰ）にあたる３個のミスマッチプローブもアレイ上に配置した。このようにして、一連の完全対合配列へのハイブリダイゼーションは重複存在／不在情報を提供し、ミスマッチプローブへのハイブリダイゼーションは菌株特異的なＳＮＰデータを明らかにする。このチップ上で、２つの病原体、ＨＡｄＶおよびインフルエンザＡ型には他の病原体よりも多くのプローブ表示を与えた。これらは、直ちに関係のある母集団（訓練中の米国陸軍入隊者）にとっての臨床的重要性に基づいて選択した。ＨＡｄＶについては、血清型４、５および７の診断領域を含むＥ１Ａ、ヘクソンおよびファイバー遺伝子からの部分配列を、すべてのＡＲＩ関連ＨＡｄＶの検出のためにタイル状に配列した。同様に、インフルエンザＡ型ウイルス検出のために配列した領域は、赤血球凝集素（亜型Ｈ１、Ｈ３およびＨ５）、ノイラミニダーゼ（亜型Ｎ１およびＮ２）、およびマトリックス遺伝子からの部分配列から成った。３つのＨＡｄＶと３つのインフルエンザＡ型ウイルスに加えて、現在のＲＰＭ設計は、１５の他の一般的呼吸器病原体、および感染の初期段階でＡＲＩ、すなわち「インフルエンザ様」症状を生じさせることが知られる、６つの米国疾病予防センターカテゴリーＡの生物テロ病原体（表１）の識別を可能にする。ＲＰＭ ｖ．１の感受性と特異性を試験するために使用したすべての対照および野生株およびそれらの供給源を表１に列挙する。

Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ"Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１６（４），５２７−５３５（２００６）

表１：原型対照菌株についてのマイクロアレイに基づく検出の分析感受性

注：＠：精製プラーク；^＊：試験した最小検出限界；^＃：ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）によって標的遺伝子が構築され、ｐＵＣ１１９にクローニングされた。

臨床試料−アーカイブに保存されている咽喉スワブは、１９９９年−２００５年に様々な陸軍入隊者訓練施設、米国／メキシコ国境地帯、および配備中の海軍艦船においてＡＲＩ症状を有する患者から収集された。これらを、輸送の間ウイルス粒子を維持するために直ちにウイルス輸送培地（ＶＴＭ）１．５ｍＬを含む２ｍＬ凍結用バイアルに入れ、凍結して、−８０℃またはそれ以下で保存した。その後試料を海軍健康研究センター（ＮＨＲＣ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に輸送し、解凍して、アリコートに分け、ＣＡＰ認定の診断ＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲおよび培養試験を用いてＨＡｄＶおよびインフルエンザに関して試験した。凍結アリコートを、その後、盲検方式でマイクロアレイに基づく検出に供した。

核酸抽出−ＲＮアーゼ消化を省く、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（商標）ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、またはＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のいずれかを製造者の推奨するプロトコールに従って使用して、核酸を臨床試料から抽出した。

内部対照−ＮＡＣ１およびトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＩＭ）に対応する２つのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）遺伝子を、それらは臨床試料中で自然に生じる可能性が低いので、逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲ反応のための内部対照として選択した。上記の２個の遺伝子の〜５００ｂｐを含む２個のプラスミド、ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）−ＮＡＣ１およびｐＳＰ６４ポリ（Ａ）−ＴＩＭは、Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のＤｒ．Ｎｏｒｍａｎ Ｈ．Ｌｅｅの好意により提供された。ＮＡＣ１をＳＰ６およびＭ１３ＲプライマーでＰＣＲによって増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＰＣＲ産物を精製した。ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）−ＴＩＭからＲＮＡを作製するため、プラスミドをＥｃｏＲＩで線形化し、ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いてＳＰ６プロモーターからインビトロ転写した。ＮＡＣ１およびＴＩＭの各々６０ｆｇを、増幅効率および検体中の阻害因子の存在を調べるための内部対照として使用した。

プライマーの設計と多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅−プライマーを２つの独立した反応に分けることは、プライマーの設計と最適化を単純にした。２６の標的病原体（西ナイルウイルスがアレイに含まれているが、この増幅スキームには含まない）からのすべての標的遺伝子が、ハイブリダイゼーションを可能にするように十分に増幅することを確実にするため、両方の混合物に対する微調整（良好に増幅しなかったプライマーを新しいものと取り替えること）を実施した。ＲＰＭ ｖ．１チップ上のすべての標的についての遺伝子特異的プライマー対（表２、３および４〜７に列挙する）を、多重ＰＣＲのために良好な増幅効率を確保するように設計した。すべてのプライマーが同様のアニーリング温度を有するように設計し、唯一性を確実にするため、公知の配列についてのＢＬＡＳＴプログラムによるＧｅｎＢａｎｋデータベースの完全な検索を使用して確認した。プライマー二量体形成の潜在的可能性を低減するため、全プライマーを他のプライマーへの潜在的ハイブリダイゼーションに関して検討した。加えて、我々は、（非特許文献２４）および（非特許文献２５）によって開発された方法を、プライマー二量体形成をさらに抑えるためこの試験において使用したプライマーの５’末端に２２ｂｐのリンカー配列（プライマーＬ）を付加することによって適合させた。逆転写（ＲＴ）反応は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣ１、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの各々５００μＭ、ＲＮアーゼＯＵＴ（商標）４０Ｕ、１０ｍＭ ＤＴＴ、プライマーＬＮ ２μＭ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ２００Ｕ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２つの内部対照（ＮＡＣ１およびＴＩＭ）の各々６０ｆｇ、および抽出した臨床検体または実験対照５−８μｌを含む２０μｌ容量中で実施した。反応は、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ−ＰＴＣ２４０ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ ２（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を製造者の推奨するプロトコールに従って使用して実施した。

Ｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲｓ"Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，５，４８８−４９３（１９９５） Ｂｒｏｗｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ＰＣＲ"Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３２３５−３２４１（１９９７）

表２、３：多重ＰＣＲのために使用したプライマー混合物ＡにおけるＰＣＲプライマーのリスト

表４〜７：多重ＰＣＲのために使用したプライマー混合物ＢにおけるＰＣＲプライマーのリスト

＊ＲＳＶ：呼吸器合胞体ウイルス

ＲＴ反応産物を、２つの異なる多重ＰＣＲ反応に供するために２つの１０μｌ容量に分けた。プライマー混合物Ａは、１９のプライマー対を含み、３個の異なるインフルエンザＡ型ウイルス、１個のインフルエンザＢ型ウイルス、３つの血清型のＨＡｄＶからの１８個の遺伝子標的、および１個の内部対照（ＴＩＭ）を増幅する。プライマー混合物Ｂは、３８のプライマー対を含み、残りの３７個の遺伝子標的および他方の内部対照（ＮＡＣ１）を増幅する。ＰＣＲ反応は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣ１、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰの各々４００μＭ、熱不安定性ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ１Ｕ（ＵＳＢ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、プライマーＬ ２μＭ、混合物Ａからのプライマー各々４０ｎＭまたは混合物Ｂからのプライマー各々５０ｎＭ、白金Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、およびＲＴ産物１０μｌを含む５０μｌ中で実施した。増幅反応は、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ− ＰＴＣ２４０ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ ２（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）において、初期インキュベーション２５℃、１０分、予備変性９４℃、３分、次いで９４℃、３０秒、５０℃、９０秒、７２℃、１２０秒の５サイクル、次に９４℃、３０秒、６４℃、１２０秒の３５サイクル、および７２℃、５分の最終伸長で実施した。両方のＰＣＲ反応からの増幅産物を単一容量に混合し、精製およびプロセシングに供した後、ＲＰＭ ｖ．１チップにハイブリダイズした（以下参照）。

マイクロアレイハイブリダイゼーションとプロセシング−２つのＰＣＲ産物混合物を、断片化とマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのために増幅後に再び一緒にした。マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびプロセシングを、以下の修正を加えて製造者の推奨するプロトコールに従って（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）実施した。精製したＰＣＲ産物を３７℃で５分間断片化し、その後３７℃で３０分間ビオチン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰで標識した。ロティサリーオーブンにおいて４５℃、６０回転／分で２時間、ハイブリダイゼーションを実施した。走査後、対応するプローブ位置の各々に割り当てた強度で生画像（．ＤＡＴ）ファイルを単純化ファイル形式（．ＣＥＬファイル）に変換するためにＧＣＯＳソフトウエアを使用した。最後に、正しいベースコール（塩基呼び出し）の推定値を生成するためにＧＤＡＳソフトウエアを使用して組み込み型のＡＢＡＣＵＳ（非特許文献２６）アルゴリズムを適用し、センスとアンチセンスプローブセットについてのそれぞれの強度を比較した。ベースコールのパーセンテージを高めるため、最も許容性のベースコーリングを可能にするようにパラメータを調整した（以下参照）。リシークエンシングアレイの各々のタイル状配置領域について作製したベースコールからの配列を、次に、ＦＡＳＴＡ形式ファイルとしてＧＤＡＳからエクスポートした。

Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ"Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１１，１９１３−１９２５（２００１））

−フィルター条件
・無シグナル閾値＝０．５００（デフォルト＝１．００００００）
・弱シグナルフォールド閾値＝２００００．０００（デフォルト＝２０．００００００）
・大きなＳＮＲ閾値＝２０．００００００（デフォルト＝２０．００００００）
−アルゴリズムパラメータ
・鎖のクオリティ閾値＝０．０００（デフォルト＝０．００００００）
・総クオリティ閾値＝２５．００００（デフォルト＝７５．００００００）
・ヘテロ接合コールの最大フラクション＝０．９９０００（デフォルト＝０．９０００００）
・モデル型（０＝ヘテロ接合、１＝ホモ接合）＝０
・完全コールクオリティ閾値＝０．５００（デフォルト＝２．００００００）
−最終信頼性規則
・近接プローブにおけるコールの最小フラクション＝１．００００（フィルターを無効にする）
・試料のコールの最小フラクション＝１．００００（フィルターを無効にする）

自動病原体同定アルゴリズム（ＮＡ配列に基づく病原体同定）−マイクロアレイハイブリダイゼーションと走査から生じた生出力配列を、データベース記録に対する配列類似性比較を用いて病原体を同定するアルゴリズムを使用して処理した。Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＲＥＰＩ）プログラムにおいてこれまでに実施された作業を組み込み（非特許文献２７）、加えてこれまで手動で行われた決定を実施することによって完全に結果を解析するため、新しいソフトウエアプログラム、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒシステムバージョン２（ＣＩＢＳＩ ２．０）を開発した。改善されたＲＥＰＩアルゴリズムを含む、このプロトコールのより広い考察が、２００６年６月６日出願の米国特許出願第１１／４２２，４３１号に詳細に述べられている。

Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ"Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１６（４），５２７−５３５（２００６）

病原体の定量−このアッセイの特異性を、様々な原型菌株および臨床試料を用いて確認した。結果は、標的間の識別可能な干渉を示さなかった。ＲＰＭ ｖ．１アッセイの分析感受性を、次に、原型菌株の核酸鋳型の連続１０倍希釈を用いて評価した。表１は、各々の病原体についてその病原体が検出可能である最小希釈を示す。それらの結果は、原型菌株について反応当たり１０−１０^３ゲノムコピーの感受性範囲を明らかにし、これは標準多重ＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ法の感受性に匹敵する。ゲノムコピー数は、呼吸器病原体についての生菌数より桁違いに高くない限り、通常は少なくとも１であるので、ゲノムコピー数は生菌数（プラーク形成単位）と同じではないことに留意すべきである。より特異的なプロトコールで最初に明らかにされた近接する遺伝子を同定し、識別するＲＰＭ ｖ．１の能力が、このプロトコールで再現された。ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）の１７の異なる血清型から生じた配列は、このアッセイが様々なＡＲＩ関連ＨＡｄＶ菌株を区別できることを明らかにし、このアッセイが広範囲の変異体を検出するために使用できることを証明した（表８）。標的のクロスハイブリダイゼーションは、種々の血清型の中でＨＡｄＶヘクソン遺伝子に関してのみ認められた；しかしこれは、正しい標的病原体の明確な同定を妨げない。

表８：様々なＦＲＩが引き起こすＨＡｄＶのＲＰＭ ｖ．１による識別

感受性評価のため、各々の試料中のアデノウイルスの数を測定するためにｉＣｙｃｌｅｒまたはＭＹＩＱ（商標）装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でリアルタイムＰＣＲアッセイを実施した。試料についての所見を、ファイバー特異的プライマーＡｄ４Ｆ−ＦおよびＡｄ４Ｆ−Ｒを使用することにより、既知のコピー数（１０^１−１０^６コピー）のＨＡｄＶ−４原型ゲノムＤＮＡ鋳型の１０倍連続希釈に関する所見と比較した（表９）。精製ウイルスＤＮＡからＤＮＡ濃度を測定し、以下の換算係数を用いることによってＨＡｄＶ−４ゲノムコピー数を算定した：０．３８４ｆｇ＝〜３５ｋｂの１個のアデノウイルスゲノム。リアルタイムＰＣＲ反応は、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）２．５μｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの各々２００μＭ、プライマー２００ｎＭ、およびアデノウイルスゲノムＤＮＡ（臨床検体またはＤＮＡ抽出物１−４μｌ）を含む反応容量２５μｌ中で実施した。増幅反応は、９４℃、１０分の予備変性、次いで９４℃、２０秒、６０℃、３０秒の４０サイクルで実施した。

特異的プライマー（表４）および先に述べられている（非特許文献２８）；（非特許文献２９）；（非特許文献３０）；（非特許文献３１）；（非特許文献３２）ＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ条件を使用することにより、他の病原体のゲノムコピー数を測定するために同様のアッセイを実施した。

Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ"Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１７，１０３−１１２（２００４） Ｈａｒｄｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ"Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１，４５−５１（２０００） Ｃｏｒｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ， Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ａｎｄ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３９，１５５３−１５５８（２００１） Ｍｏｉｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｉｎｇ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ ａｎｄｐｏｒＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲ"Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０，４５３１−４５３５（２００２） Ｖａｂｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｉｒｅｃｔ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ ２２９Ｅ ａｎｄ ＯＣ４３ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ"Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９１，５９−６６（２００１）

表９．定量的リアルタイムＰＣＲのために使用したＰＣＲプライマーのリスト

呼吸シンシチアルウイルス、二重ラベルプローブは５’末端でフルオレス−レポーター色素として６−カルボキシ−フルオレスセンス（ＦＡＭ）、および３’末端にブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ）を含有する。
参考文献：（非特許文献３３）．（（非特許文献３４）．（非特許文献３５）．（非特許文献３６）．（非特許文献３７）．（非特許文献３８）．

Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｍｕｔａｎｅｏｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ"Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１７，１０３−１１２（２００４） Ｖａｂｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｉｒｅｃｔ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ ２２９Ｅ ａｎｄ ＯＣ４３ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ"Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，９７，５９−６６（２００２） Ｈａｒｄｅｇｇｅｒ ｅｒ ａｔ．，"Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃ ｓａｍｌｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ"Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１，４５−５１（２０００） Ｃｏｒｌｅｓｓ ａｔ ａｌ．，"Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ， Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ， ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ａｎｄ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３９，１５５３−１５５８（２００１） Ｍｅｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ"Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５２，８９３−８９６（２００３） Ｍｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｉｎｇ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ ｐｏｒＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０，４５３１−４５３５（２００２）

呼吸器病原体の同時検出と識別−これまでの試験は、単一病原体種を正確に同定することに加えて、病原体検出のためにＲＰＭ ｖ．１アッセイを使用することの顕著な利益の１つが同時感染を検出する能力であることを示した。この試験では、多数の病原体を同時に同定するＲＰＭ ｖ．１アッセイの能力を、病原体鋳型の様々な組合せの製剤によってさらに評価した（表１０および１１）。多数の病原体についての検出感受性および特異性を評価するために鋳型の連続希釈を使用した。各々の病原体、ＨＡｄＶ−４、化膿連鎖球菌、肺炎マイコプラスマ、およびペスト菌の反応当たり１０^６−１０^３ゲノムコピーを含む核酸鋳型を混合し、ＲＰＭ ｖ．１アレイで試験した。これらの結果は、このアッセイが、反応当たりの標的につき１０^３ゲノムコピーの最小濃度でも４つの病原体すべての再現可能な配列に基づく同定を可能にすることを明らかにした（表１０）。この複雑な混合物において識別可能な干渉が存在しなかったという事実は、複雑な混合物においても、ＲＡのヌクレオチドベースコーリング能力および付随する同定アルゴリズムの頑健性を裏付けた。

複雑な混合物における多病原体検出のためのこのアプローチの有効性をさらに評価するため、３−７の培養生物を、志願者から収集した鼻洗浄液プールに異なる力価で［１０^２−１０^５（ｃｆｕまたはｐｆｕ）／ｍＬ］スパイクし、調製した試料１５０μＬを試験のために使用した。初期結果は、このアプローチが、１００ｃｆｕ（ｐｆｕ）／ｍＬの最小力価で同時に７つの病原体、ＨＡｄＶ−４、ＨＡｄＶ−７、炭疽菌、インフルエンザＡ型−Ｈ１Ｎ１、パラインフルエンザウイルス、ＲＳＶ−Ａ、肺炎マイコプラスマ、および化膿連鎖球菌の明確な検出を可能にすることを明らかにした（表１１）。異なるセットの７つの病原体に関するさらなる評価は、ＲＰＭ ｖ．１アッセイがそれらのうちの６つを同時に検出できることを示した。これらの中で、ＨＡｄＶ−４、炭疽菌、インフルエンザＡ型−Ｈ１Ｎ１、ＲＳＶ−Ａ、および肺炎マイコプラスマは１００ｃｆｕ（ｐｆｕ）／ｍＬの最小力価で検出され、化膿連鎖球菌は１０００ｃｆｕ（ｐｆｕ）／ｍＬで検出された（表６）。ペスト菌は最高濃度でも検出できなかった。精製核酸鋳型を使用したときには１０００ゲノムコピーのペスト菌が検出できたので、これは無傷ペスト菌病原体についての核酸抽出プロトコールの不適切さに帰せられた（表１および１０）。さらなる確認のため、ＲＰＭ ｖ．１を、精製核酸鋳型を使用して試験した同じセットの４つの病原体に関して培養生物で試験した（表１０）。失敗することなく、結果は、このアッセイが１００ｃｆｕ（ｐｆｕ）／ｍＬでＨＡｄＶ−４と肺炎マイコプラスマを再現可能に検出できるが、化膿連鎖球菌に対してより感受性が低く（１０００ｃｆｕ（ｐｆｕ）／ｍＬ）、ペスト菌は検出できないことを示した。３つの病原体、この場合は炭疽菌、インフルエンザＡ型−Ｈ１Ｎ１、およびＨＣｏＶ−２２９ＥまたはＲＳＶ−Ａ、を同時に試験したとき、アッセイは１００ｃｆｕ（ｐｆｕ）／ｍＬの低い力価で３つの病原体すべてを検出した（表１１）。これらの結果は、ＲＡに基づくアプローチが、少なくとも７つの病原体の同時感染を検出するための高い感受性と特異性の利点を備えた、鼻洗浄液試料から直接様々な病原体を検出し、分類する有効な手段であることを指示する。このアプローチは、個体群内でのこれらの病原体の常套的診断および疫学調査のために有用であり、多数の病原体の発生率に関する新しい情報を提供する。

表１０：ＲＰＭ ｖ．１による多数の核酸鋳型の同時検出
注：試料は、１０^６ゲノムコピー／μｌの原液を作製するためにＴＥ緩衝液中で精製核酸鋳型を混合することによって生成した。この濃度から始めて、ＴＥ緩衝液中で１０倍連続希釈を調製した。

表１１：ＲＰＭ ｖ．１による多数の病原体の同時検出

注：試料は、１０^５ｃｆｕ（ｐｆｕ）／ｍｌを生成するために健常志願者から収集した鼻洗浄液プールと培養試料を混合することによって作製した。この濃度から始めて、健常志願者から収集した鼻洗浄液プールによる１０倍連続希釈を調製した。各々の希釈について、試料１５０μｌをＲＰＭ ｖ．１処理のために使用した。ＢＡ−炭疽菌（Ｓｔｅｒｎｅ）、Ｈ１Ｎ１−インフルエンザＡ型−Ｈ１Ｎ１、ＨＣｏＶ２２９Ｅ−ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＨＡｄＶ−ヒトアデノウイルス、ＧＡＳ−化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌属）、ＭＰ−肺炎マイコプラスマ、ＰＩＶ１−パラインフルエンザウイルス１、ＲＳＶ−呼吸器多核体（ＲＳ）ウイルス、ＹＰ−ペスト菌。＋：検出、−：検出されず。

臨床検体の評価−病原体検出に関するＲＰＭ ｖ．１アッセイの能力を成功裏に証明した後、ＡＲＩを引き起こす感染症の予期的および後方視的診断のためにそれを使用した。主としてＡＲＩを呈する陸軍入隊者から収集した臨床検体を、マイクロアッセイに基づく診断の有用性を呼吸器病原体検出のより確立された方法と比較するために使用した。試料（ｎ＝１０１）は、臨床的に確認された呼吸器疾病を有するウイルス輸送培地中の咽喉スワブから成った。試料は、ＮＨＲＣにおいてＣＡＰ認定の診断方法（細胞培養および／またはＰＣＲ）を用いてＨＡｄＶまたはインフルエンザウイルスに関して試験陽性であったセットから無作為に選択した。これらを盲検化し（無作為に改めて番号を割り当て、関連する臨床記録から切り離した）、ＲＰＭ ｖ．１試験のために海軍研究所（ＮＲＬ）に送った。比較した実験は２つの独立した研究室によって実施され、試料の同一性は結果がまとめられた後に初めて明らかにされた。インフルエンザＡ型ウイルスについては、ＲＰＭ ｖ．１法は、初期診断結果に関して８７％の検出感受性および９６％の特異性、および９２％の全体的一致を示した（表１２）。アデノウイルスについては、ＲＰＭ ｖ．１の検出感受性は９７％、特異性は９７％であり、９７％の全体的一致であった（表１２）。ＲＰＭ ｖ．１結果を培養およびＰＣＲ法とさらに比較したとき、データは、培養またはＰＣＲアッセイに比肩し得る検出感受性および特異性を示した（表１３）。データは、分子学的方法が一般に培養よりも感受性が高いことから予想され得るように、ＲＰＭ ｖ．１が培養またはＰＣＲよりも良好な感受性および特異性を有すること、およびＲＰＭ ｖ．１法の配列決定能力はＰＣＲよりも高い特異性を提供することを示唆した（表１４）。このデータは、マイクロアレイに基づく診断が非培養患者検体中の臨床的に関連するインフルエンザＡ型菌株を正しく同定する能力をさらに強力に示した。

表１２：臨床試料におけるアデノウイルス、インフルエンザＡ型ウイルスおよび陰性対照検出に関するＲＰＭ ｖ．１の評価

表１３：４０の臨床試料におけるインフルエンザＡ型ウイルス陽性および陰性対照検出についての、培養およびリアルタイムＰＣＲアッセイとＲＰＭ ｖ．１の比較

表１４：４０の臨床試料におけるインフルエンザＡ型ウイルス陽性および陰性対照検出についてのリアルタイムＰＣＲアッセイと培養の比較

この試験は、このアッセイがインフルエンザウイルスの亜型を同定し、インフルエンザ菌株内の遺伝子変化を追跡する能力を明らかにした。抗原ドリフトは、インフルエンザウイルスがそれまでの自然暴露およびワクチン接種によって誘導される免疫圧を免れる機構であるので、これはインフルエンザの疫学にとって特に重要である。ＲＰＭ ｖ．１から生じた赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列の分析は、抗原ドリフトを通して１９９９−２００５年に起こった公知の系統変化を反復した（表１５）。２００３−２００４年のインフルエンザシーズンに先立って収集された７つのインフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２臨床検体は、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９様系統に属すると同定され、一方２００３−２００４年のインフルエンザシーズンに収集された９つのインフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２試料は、明らかに、ＨＡ遺伝子内にシグナチャーＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様系統のヌクレオチド置換を担持していた。Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様菌株からＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４様菌株へのシフトは、２００４−２００５年のインフルエンザシーズンに収集された１８のインフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２試料において明らかである。３つの試料がＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様菌株と同定され、残りはＨＡ遺伝子内のシグナチャーＣａｌｉｆｏｒｎｉａ様核酸置換を示した。同じ期間中に収集された２つの試料は、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２とだけしか同定することができなかった。これは、標的の増幅および／またはハイブリダイゼーションの不良によるものであり、菌株レベルの同定のための十分な配列情報を生じなかった。２０００−２００１年に収集された２つのインフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１試料は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９に密接に関連すると同定された。

表１５：ＲＰＭ ｖ．１を用いたインフルエンザ菌株および系統の同定
注：^＊は、１つの菌株だけが同定されたことを示す。

臨床試料中の１つの病原体を検出することに加えて、ＨＡｄＶ−４／インフルエンザＡ型ウイルス、ＨＡｄＶ−４／化膿連鎖球菌、およびインフルエンザＡ型ウイルス／肺炎マイコプラスマなどの様々な同時感染を臨床試料において検出することができた（データは示していない）。これらの同時感染は、公表されている型特異的ＰＣＲアッセイ（非特許文献３９）；（非特許文献４０）および手持ちの特異的ＰＣＲプライマー（表９）を用いてさらに確認された（データは示していない）。さらに、このアッセイはまた、臨床試料の２６％における肺炎連鎖球菌および１６％における髄膜炎菌を検出した。肺炎連鎖球菌および髄膜炎菌の存在は、臨床試料のうちの４０のサブセットにおいて（使用可能な試料容量のために制限された）公表されている種特異的な定量的リアルタイムＰＣＲアッセイによって確認された（データは示していない）。肺炎連鎖球菌と髄膜炎菌が口内および上気道系における共生細菌であることは周知であるので、これらが臨床試料中で一般的に認められることは意外ではない。しかし、定量的リアルタイムＰＣＲデータは、臨床試料中に存在する肺炎連鎖球菌および髄膜炎菌の大部分が低い力価であったが（≦１０^３ゲノムコピー／μｌ）、インフルエンザ陽性試料の３２％が高い力価の肺炎連鎖球菌（７／２５）または髄膜炎菌（１／２５）（≧１０^５ゲノムコピー／μＬ）を有することを示した（データは示していない）。これらの臨床試料中に存在する高力価細菌は、おそらくウイルスが誘導する細菌の重複感染によるものである。

Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ"Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１７，１０３−１１２（２００４） Ｈａｒｄｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ"Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１，４５−５（２０００）

プライマーＬおよびＬＮによる多重ＰＣＲプロトコール−以下は、実施例手順の詳細なプロトコールである。

調製作業
１．ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）−ＴＩＭ−ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＳＰ６キット（Ａｍｂｉｏｎ，カタログ番号１３３０）からＴＩＭ ＲＮＡを作製する
ａ）ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）−ＴＩＭ １μｇをＥｃｏＲＩ酵素で線形化する
ｘμｌ ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）−ＴＩＭ
２μｌ １０ｘＥｃｏＲＩ緩衝液
２μｌ ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ，カタログ番号Ｒ０１０１Ｓ）
（１６−ｘ）μｌ Ｈ_２Ｏ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
２０μｌ 総容量
反応物を３７℃で５時間インキュベートする。
ｂ）以下を添加することによって制限消化を停止する：
・１／２０容の０．５Ｍ ＥＤＴＡ（１μｌ）
・１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（２μｌ）
・２容のエタノール（４０μｌ）
ｃ）十分に混合し、−２０℃で２０分間冷却する。次に最高速度のマイクロ遠心分離機で１５分間ＤＮＡをペレット化する。
ｄ）上清を除去し、チューブを数秒間再び遠心して、非常に微細な先端のピペットで残留液を取り出す。ヌクレアーゼ不含水２０μｌに再懸濁する。
ｅ）ＲＮＡポリメラーゼ酵素混合物を氷上に置く。
ｆ）１０Ｘ反応混合液および４つのリボヌクレオチド溶液をボルテックスする。
ｇ）（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）それらが完全に溶液になるまで。
ｈ）ひとたび解凍すれば、リボヌクレオチドを氷上で保存するが、１０Ｘ反応緩衝液は、反応物を作製する間室温に保持する。
ｉ）すべての試薬は、チューブの縁の周囲に存在し得る物質の損失および／または汚染を防ぐために開封前に短時間マイクロ遠心すべきである。
ｊ）以下の転写反応物を室温で組み合わせる。
１６μｌ 線形化ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）−ＴＩＭ
１６μｌ ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ−各々４μｌ）
４μｌ １０Ｘ反応緩衝液
４μｌ 酵素混合物
４０μｌ 総容量
――――――――――――――――――――――――――――――――――
反応物を３７℃で６時間インキュベートする。
ｋ）ＲＮＡ産物をＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ（商標）Ｇ−５０ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，カタログ番号２７５３３５０１）で精製する。
ｌ）回収したＲＮＡのＯ．Ｄ．を測定し、希釈して６０ｆｇ／μｌ原液を作製する。

２．白金Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１０９６６−０３４）でｐＳＰ６４ポリ（Ａ）−ＮＡＣ１−ＰＣＲからＮＡＣ１ ＤＮＡフラグメントを作製する
１μｌ ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）−ＮＡＣ１（１ｎｇ／μｌ）
５μｌ １０ｘＰＣＲ緩衝液
２μｌ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物
１μｌ ＳＰ６（１０μＭ）
５’−ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＡＡＴ−３’
１μｌ ＳＰ６（１０μＭ）
５’−ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＴＧ−３’
０．５μｌ 白金Ｔａｑポリメラーゼ
３８．５μｌ Ｈ_２Ｏ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
５０μｌ 総容量
以下のＰＣＲプログラムを実施する：
９４℃−３分
以下の４０サイクル：
９４℃−３０秒
５０℃−３０秒
７２℃−４０秒
７２℃−５分
４℃−永続的。

精製ＰＣＲ産物−ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号２８１０６）
ａ）ＰＢ緩衝液２５０μｌをＰＣＲ試料５０μｌに添加する。
ｂ）ＱＩＡｑｕｉｃｋ遠心カラムを２ｍｌ収集チューブに入れる。
ｃ）ＤＮＡを結合するため、試料をＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに適用し、３０−６０秒間遠心する。
ｄ）フロースルー液を廃棄し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを同じチューブに戻す。
ｅ）洗浄するため、ＰＥ緩衝液０．７５ｍｌをＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに添加し、３０−６０秒間遠心する。
ｆ）フロースルー液を廃棄し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを同じチューブに戻す。
ｇ）カラムをさらに１分間遠心する。
ｈ）ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを正常な１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに入れる。
ｉ）ＤＮＡを溶出するため、ＥＢ緩衝液（１０ｍＭトリス・Ｃｌ、ｐＨ８．５）またはＨ_２Ｏ ５０μｌをＱＩＡｑｕｉｃｋ膜の中心部に添加し、カラムを１分間放置して、その後カラムを１分間遠心する。
ｊ）ＰＣＲ産物のＯ．Ｄ．を測定し、希釈して６０ｆｇ／μｌ原液を作製する。

３．１００μＭオリゴ原液１０μｌ（表２（ａ））を混合することによって１μＭプライマー混合物Ａ原液１ｍｌを作製し、水を加えて１ｍｌにする。十分に混合し、その後１００μｌアリコートに分ける。
４．１００μＭオリゴ原液１０μｌ（表２（ｂ））を混合することによって１μＭプライマー混合物Ｂ原液１ｍｌを作製し、水を加えて１ｍｌにする。十分に混合し、その後１００μｌアリコートに分ける。

多重ＰＣＲ
１．核酸抽出−ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（商標）ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，カタログ番号ＭＣ８９０１０）
ａ）１ＸＰＢＳ１００μｌを鼻洗浄液５０μｌに添加する。
ｂ）プロテイナーゼＫ１μｌと２ＸＴ＆Ｃ溶解溶液１５０μｌを添加する。
ｃ）６５℃で１５分間インキュベートし、５分ごとにボルテックスする。
ｄ）氷上または４℃で３−５分間インキュベートする。
ｅ）ＭＰＣ溶液１５０μｌを試料に添加し、１０秒間ボルテックスする。
ｆ）最大速度で１０分間遠心する。
ｇ）上清を新鮮１．５ｍｌチューブに移し、次にイソプロパノール５００μｌを加えて、十分に混合する。
ｈ）４℃にて最大速度で１０分間遠心する。上清を廃棄し、その後８０％アルコールで２回洗浄する。
ｉ）ペレットを乾燥し、ヌクレアーゼ不含水８μｌに再懸濁する。
２．プライマーＬＮによる逆転写−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１８０８０−０９３）
工程１からのＮＡ ８μｌ
プライマーＬＮ（４０μＭ） １μｌ
５’−ＣＧＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＧＴ ＡＣＴ ＡＧＣ ＧＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ Ｎ−３’
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ
ＴＩＭ（６０ｆｇ／μｌ） １μｌ
ＮＡＣ１（６０ｆｇ／μｌ） １μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
総容量 １２μｌ
６５℃で５分間インキュベートし、その後＞１分間氷上に置く。
以下の反応混合物をチューブに添加し、ピペットで取ることによって静かに混合する：
５Ｘ第一鎖緩衝液 ４μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌ
ＲＮアーゼＯＵＴ １μｌ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ １μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
総容量 ８μｌ
ＰＣＲ装置で以下のプログラムを実施する：
２５℃−１０分
５０℃−５０分
８５℃−５分

３．多重ＰＣＲをプライマーＬで分割する
ａ．反応物Ａ：
１０ＸＰＣＲ緩衝液 ５μｌ
５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μｌ
５０ＸｄＮＴＰ ２μｌ
プライマーＬ（１００μＭ） １μｌ
５’−ＣＧＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＧＴ ＡＣＴ ＡＧＣ Ｇ−３’
プライマーＡ混合物（１μＭ） ２μｌ
５ｘＱ溶液 ５μｌ
ＲＴ鋳型（工程２から） １０μｌ
白金ｔａｑ ２μｌ
ヌクレアーゼ不含水 １８μｌ
ＵＤＧ １μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
総容量 ５０μｌ
ｂ．反応物Ｂ：
１０ＸＰＣＲ緩衝液 ５μｌ
５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μｌ
５０ＸｄＮＴＰ ２μｌ
プライマーＬ（１００μＭ） １μｌ
５’−ＣＧＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＧＴ ＡＣＴ ＡＧＣ Ｇ−３’
プライマーＢ混合物（１μＭ） ２．５μｌ
５ｘＱ溶液 ５μｌ
ＲＴ鋳型 １０μｌ
白金ｔａｑ ２μｌ
ヌクレアーゼ不含水 １７．５μｌ
ＵＤＧ １μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
総容量 ５０μｌ
以下のＰＣＲプログラムを実施する：
９４℃−３分
以下の５サイクル：
９４℃−３０秒
５０℃−９０秒
７２℃−２分
以下の３５サイクル：
９４℃−３０秒
６４℃−２分
７２℃−５分
４℃−永続的。

アレイの作製
タグＩＱ−ＥＸ ＰＣＲ−１．０ｋｂのタグＩＱ−ＥＸまたは７．５ｋｂのタグＩＱ−ＥＸ
１．０ｋｂのタグＩＱ−ＥＸ ＰＣＲ
正プライマー（１ｋｂ） ３μｌ
逆プライマー ３μｌ
タグＩＱ−ＥＸ ５μｌ
ＭｇＣｌ_２（５０ｍＭ） ５μｌ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ） ２μｌ
１０ＸＰＣＲ緩衝液 １０μｌ
白金Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ
水 ７１μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
総容量 １００μｌ
・９４℃、３分
・９４℃、３０秒；６８℃、３０秒；７２℃、４０秒の３０サイクル
・７２℃、１０分
７．５ｋｂのタグＩＱ−ＥＸ ＰＣＲ
正プライマー（７．５ｋｂ） ３μｌ
逆プライマー ３μｌ
タグＩＱ−ＥＸ ５μｌ
ｄＮＴＰ（ＬＡ ＰＣＲキット） １６μｌ
１０ＸＰＣＲ緩衝液（ＬＡ ＰＣＲキット） １０μｌ
ＴａＫａＲａ Ｔａｑ １μｌ
水 ６２μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
総容量 １００μｌ
・９４℃、３分
・９４℃、３０秒；６８℃、７分３０秒の３０サイクル
・６８℃、１０分

精製ＰＣＲ産物（タグＩＱ−ＥＸおよび多重ＰＣＲ）−ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号２８１０６）
ａ）ＰＢ緩衝液５００μｌをＰＣＲ試料１００μｌ（反応物ＡとＢを一緒にする）に添加する。
ｂ）ＱＩＡｑｕｉｃｋ遠心カラムを２ｍｌ収集チューブに入れる。
ｃ）ＤＮＡを結合するため、試料をＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに適用し、３０−６０秒間遠心する。
ｄ）フロースルー液を廃棄する。ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを同じチューブに戻す。
ｅ）洗浄するため、ＰＥ緩衝液０．７５ｍｌをＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに添加し、３０−６０秒間遠心する。
ｆ）フロースルー液を廃棄し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを同じチューブに戻す。
ｇ）カラムをさらに１分間遠心する。
ｈ）ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを清浄な１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに入れる。
ｉ）ＤＮＡを溶出するため、ＥＢ緩衝液（１０ｍＭトリス・Ｃｌ、ｐＨ８．５）またはＨ_２Ｏ ４０μｌをＱＩＡｑｕｉｃｋ膜の中心部に添加し、カラムを１分間放置して、その後カラムを１分間遠心する。
ｊ）ＰＣＲ産物のＯ．Ｄ．を測定する。

断片化と標識化
１．断片化のために試料につき１つのチューブを用意し、各々の反応物について最終容量３５μｌになるまでＥＢ緩衝液を添加する。タグＩＱ−ＥＸを１つの試料として処理する。

２．氷上で断片化カクテルを調製する
１０Ｘ断片化緩衝液 ４．３μｌ
水 ３．２３μｌ
断片化試薬 ０．０７μｌ
総容量 ７．６μｌ
３．氷上で断片化試薬を冷却し、その後工程１および２から作製した各々のＤＮＡに７．６μｌを添加する。
４．以下のプログラムを実施する：
・３７℃、５分
・９５℃、１０分
・４℃、保持
５．標識化カクテルを調製する（反応物当たり）
Ｔｄｔ緩衝液（５Ｘ） １２μｌ
遺伝子チップＤＮＡ標識化試薬（５ｍＭ） ２μｌ
ＴｄＴ（３０Ｕ／μｌ） ３．４μｌ
総量 １７．４μｌ
６．標識化カクテル１７．４μｌを反応物の各々１つずつおよび対照断片化ＰＣＲ産物に添加する。

７．以下のプログラムを実施する：
・３７℃、３０分
・９５℃、５分
・４℃、保持
ハイブリダイゼーション
１．４５℃に設定したハイブリダイゼーションオーブンのスイッチを入れ、チップを室温に温める。
２．プレハイブリダイゼーション溶液を調製する。
１％トゥイーン−２０ ２μｌ
１Ｍトリス、ｐＨ７．８ ２μｌ
水 １９６μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
総容量（チップ当たり） ２００μｌ
３．チップを４５℃のプレハイブリダイゼーション緩衝液とプレハイブリダイズする。
４．ハイブリダイゼーションマスターミックスを作製する。
タグＩＱ−ＥＸ^＊（断片化して０．２６μｇ） １．９μｌ
５Ｍ ＴＭＡＣ １３２μｌ
１Ｍトリス、ｐＨ７．８ ２．２μｌ
１％トゥイーン−２０ ２．２μｌ
ニシン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ） ２．２μｌ
アセチル化ＢＳＡ ２．２μｌ
対照オリゴＢ２ ３．４μｌ
水 １３．９μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
最終容量（チップ当たり） １６０μｌ
^＊ハイブリダイゼーションマスターミックスのためにどれだけの断片化タグＩＱ−ＥＸが必要かを決定するには以下の計算を用いる：
・精製ＰＣＲ産物濃縮物（たとえば１００ｎｇ／μｌ）×３５μｌ＝３５００ｎｇ
・断片化および標識後の最終容量は６０μｌである。
・断片化タグＩＱ−ＥＸの最終濃度＝５８．３ｎｇ／μｌ
・２６０／５８．３＝４．４６５８．３μｌが必要である。
５．標識試料６０μｌに１６０μｌを添加する。以下のプログラムを実施する：
・９５℃、５分
・４５℃、５分
６．チップからプレハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、ハイブリダイゼーションミックスを満たす。
７．４５℃、６０ｒｐｍで一晩ハイブリダイズする。
洗浄と染色
１．洗浄緩衝液ＡおよびＢを調製する。
緩衝液Ａ
２０ＸＳＳＰＥ ３００ｍｌ
１０％トゥイーン−２０ １ｍｌ
水 ６９９ｍｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
０．２μｍフィルターでろ過し、ふたをして室温で保存する。
緩衝液Ｂ
２０ＸＳＳＰＥ ３０ｍｌ
１０％トゥイーン−２０ １ｍｌ
水 ９６９ｍｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
０．２μｍフィルターでろ過し、ふたをして室温で保存する。
２．ＳＡＰＥ染色溶液を調製する（各々のチップについて）
２０ＸＳＳＰＥ ３６０μｌ
１％トゥイーン−２０ １２μｌ
５０ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ ５０μｌ
ＳＡＰＥ １２μｌ
ＤＩ水 ７６６μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
十分に混合し、６００μｌの２つのアリコート（染色１および染色３）に分ける。
３．抗体溶液を調製する（各々のチップについて）
２０ＸＳＳＰＥ １８０μｌ
１％トゥイーン−２０ ６μｌ
５０ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ ２５μｌ
１０ｍｇ／ｍｌ正常ヤギＩｇＧ ６μｌ
０．５ｍｇ／ｍｌビオチニル化抗体 ３．６μｌ
ＤＩ水 ３７９．４μｌ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
最終容量 ６００μｌ
４．洗浄プロトコール−ＤＮＡＡＲＲＡＹ ＷＳ４を実施する。

伝統的な方法と異なり、最適化したＲＰＭ ｖ．１アッセイは、病原体を同定し得るだけでなく、配列情報も提供し、同じアッセイにおいて多数の病原体を検出し、系統発生的に分類することを可能にし得る。配列情報は、循環および突発出現ウイルス（すなわちインフルエンザ）の遺伝的変異分析のための強力なツールである、広い範囲の変異体（たとえばＨＡｄＶ）を同定するためのＲＰＭ ｖ．１の能力を明らかにした。これはまた、公知の変異体の動きを追跡する上でも有用である。この有用性は、Ａ／Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９様菌株（２００３年のインフルエンザシーズン以前）から、２００３−２００４年のインフルエンザシーズンにＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様菌株へ、次に２００４−２００５年のインフルエンザシーズンにＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４様菌株への系統変化を示したインフルエンザＡ型陽性臨床試料において明らかに示された。インフルエンザＡ型ウイルスの間で比較的保存されている、１個のＭ遺伝子（Ｈ１Ｎ１）配列だけがＲＰＭ ｖ．１上に配置された。しかし、Ｍ遺伝子ＰｒｏＳｅｑはまだ全く異なる亜型の相同領域を検出することができ、正しい識別を可能にした（表１５）。このＭ遺伝子ＰｒｏＳｅｑは、理論的には、抗原性ＨＡおよびＮＡ配列がアレイ上に配置されなかったいかなる他の型のインフルエンザウイルスの検出も可能にする。

この試験は、このシステムが卓越した臨床的感受性と特異性、感受性を失うことなく複雑な同時感染を解明する能力を示し得ること、および感受性は２６の標的病原体および潜在的生物兵器因子すべてに対して同様であることを明らかにする。培養およびＰＣＲのどちらとも異なり、このアッセイプラットフォームは、ＨＡｄＶとインフルエンザＡ型ウイルスの両方に対して同等の検出感受性と特異性を示した（表１２）。データは、ＲＰＭ ｖ．１システムを、従来の検出方法と良好に相関する形で、直接（非培養）臨床検体において臨床的に関連するアデノウイルスとインフルエンザＡ型ウイルスを正しく同定し、型検出するための診断ツールとして使用することの実現可能性を裏付ける。

明らかに、上記の教示に照らして本発明の多くの修正および変法が可能である。それ故、特許請求される本発明が、特定して記述されているのとは異なる方法で実施され得ることは了解されるべきである。単数の、たとえば冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」または「ｓａｉｄ」を用いた、特許請求要素への言及は、要素を単数に限定するとは解釈されない。

Claims (22)

1. あらかじめ決めたセットの病原体からの１またはそれ以上の病原体核酸を含むことが疑われる生物学的試料を用意し；
   前記試料に、あらかじめ決めた病原体のセットに認められる遺伝子に対応する複数のＰＣＲプライマーを添加し；
   ここで前記プライマーは各々の病原体について少なくとも１つのプライマー対を含み、そして該プライマーはあらかじめ決めたセットの病原体のいずれのＤＮＡまたは試料中のいずれのバックグラウンドＤＮＡにも相同でないテール配列を含む；そして
   試料上でポリメラーゼ連鎖反応を実施して遺伝子に対応する核酸のサブセットを増幅する；
   ここでポリメラーゼ連鎖反応における少なくとも１個のプライマーの濃度は約１００ｎＭ以下とする；
   ことを特長とする方法。
2. ポリメラーゼ連鎖反応における各々のプライマーの濃度が約１００ｎＭ以下である請求項１に記載の方法。
3. テール配列が、ＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴＡＣＴＡＧＣＧ（配列番号１）である請求項１に記載の方法。
4. テール配列が、ＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴＡＣＴＡＧＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号２）である請求項１に記載の方法。
5. 生物学的試料を生成するために臨床試料から核酸を抽出することをさらに含む請求項１に記載の方法。
6. 臨床試料が鼻洗浄液、咽喉スワブ、痰、血液または環境試料を含む請求項５に記載の方法。
7. 臨床試料が生物からのものであり、および
   テール配列が前記生物の種のＤＮＡと相同でない請求項５に記載の方法。
8. 生物がヒトである請求項７に記載の方法。
9. 病原体が呼吸器病原体である請求項１に記載の方法。
10. 病原体が腸病原体または生物脅威因子（ｂｉｏｔｈｒｅａｔ ａｇｅｎｔ）である請求項１に記載の方法。
11. 増幅された核酸が２００ヌクレオチド以下の配列および２０００ヌクレオチド以上の配列を含む、請求項１に記載の方法。
12. テール配列がプライマー二量体の形成を低下させる請求項１に記載の方法。
13. ＰＣＲプライマーが少なくとも５０個の異なるプライマーを含む請求項１に記載の方法。
14. 複数のＰＣＲプライマーを添加することおよびポリメラーゼ連鎖反応を実施することを、各々、生物学的試料の複数のアリコートに関して実施し；
    各々のアリコートについて異なる複数のＰＣＲプライマーを使用し；および
    ＰＣＲ反応後にアリコートを一緒にする請求項１に記載の方法。
15. 試料を、増幅核酸の少なくとも一部に相補的である複数の核酸配列を含むマイクロアレイに接触させ；および
    増幅核酸を相補的核酸にハイブリダイズさせることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
16. 相補的核酸が２５量体から２９量体である請求項１５に記載の方法。
17. 相補的核酸が、増幅核酸の少なくとも１個に完全にマッチするプローブおよび各々の完全にマッチするプローブの中央位置の３個の異なる一塩基多型を含む、請求項１５に記載の方法。
18. いずれの増幅核酸が相補的核酸にハイブリダイズするかを検出することをさらに含む請求項１５に記載の方法。
19. いずれの増幅核酸が検出されるかに基づいて病原体を同定することをさらに含む請求項１８に記載の方法。
20. 同定がパターン認識に基づく請求項１９に記載の方法。
21. 同定が増幅核酸の配列決定に基づく請求項１９に記載の方法。
22. 同定が病原体の菌株を含む請求項１８に記載の方法。