WO2011145614A1 - 核酸標準物質検出用プローブの設計方法、核酸標準物質検出用プローブ及び当該核酸標準物質検出用プローブを有する核酸検出系 - Google Patents

核酸標準物質検出用プローブの設計方法、核酸標準物質検出用プローブ及び当該核酸標準物質検出用プローブを有する核酸検出系 Download PDF

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WO2011145614A1
WO2011145614A1 PCT/JP2011/061310 JP2011061310W WO2011145614A1 WO 2011145614 A1 WO2011145614 A1 WO 2011145614A1 JP 2011061310 W JP2011061310 W JP 2011061310W WO 2011145614 A1 WO2011145614 A1 WO 2011145614A1
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WO
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nucleic acid
standard substance
acid standard
probe
detecting
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/061310
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English (en)
French (fr)
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航 藤渕
勇地 関口
裕樹 中江
Original Assignee
独立行政法人産業技術総合研究所
特定非営利活動法人バイオチップコンソーシアム
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules

Definitions

  • the present invention relates to a probe design method for detecting a nucleic acid standard used in a system for detecting and / or quantifying nucleic acid, a nucleic acid standard detection probe designed by the design method, and the nucleic acid standard detection
  • the present invention relates to a nucleic acid detection system provided with a probe.
  • nucleic acid quantification targeting multiple subjects is indispensable for infectious disease diagnosis by quantitative detection of nucleic acids (genes) derived from pathogenic viruses and bacteria, and prognosis after drug administration.
  • nucleic acid quantification techniques for microbial quantitative inspection and varietal contamination evaluation using nucleic acids as an index have begun to be introduced.
  • DNA microarray DNA chip
  • quantitative PCR PCR is performed using primers for detecting a target nucleic acid, and the amount of the target present is quantitatively evaluated.
  • DNA microarrays are designed to relatively quantify gene expression levels by arranging a large number of probes that specifically hybridize with each mRNA as a target.
  • nucleic acid standard is used as a reference for determining that there is no problem in the quantification operation itself.
  • a nucleic acid having a base sequence different from the test nucleic acid is added as an internal standard substance, and the measurement value is standardized.
  • some of the naturally occurring gene sequences have been used as the nucleic acid standard used here, but these conventional nucleic acid standards compare the quantitative results in common among various methods, devices, and kits. Did not have enough performance to do.
  • a method for designing a DNA consisting of a non-natural and non-ordered base sequence has been developed.
  • DNA sequences that are unlikely to cause mishybridization with each other are efficiently designed.
  • a DNA sequence having a predetermined length is represented by a bit string (template) consisting of 0 and 1 for G or C and A or T, these are shifted between templates and between reverse sequences of templates.
  • a set of DNA sequences is selected (see Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Literature a method for designing a DNA consisting of a base sequence that has no bias in the base sequence and that does not have a higher order structure by utilizing these principles.
  • a plurality of DNAs designed by combining a plurality of DNAs having a certain length and a certain CG content are excluded from those designed to match an existing base sequence registered in a database, and the DNAs are created in combination.
  • a plurality of base sequences having a GC content of 50% and a length of 12 mer are designed, and these sequences are joined together to design a base sequence of about 600 bases.
  • a sequence whose nucleic acid base sequence and translation product sequence do not match 60% or more of the existing nucleic acid / protein database record is selected.
  • Patent Document 3 is a method developed by the present inventors in order to solve the above-mentioned problems, and the DNA sequence obtained by the method is a non-natural sequence, and is the above 1) to 3 Part of the problem is a nucleic acid standard that can be avoided.
  • the DNA sequence still contains a plurality of sequences that match 20 or more bases continuously with the naturally occurring sequence, in order to prepare a nucleic acid probe or primer for detection of the DNA sequence, If a partial sequence in a DNA sequence or its complementary sequence is to be used, there is a high possibility of selecting the similar sequence portion, and as a result, there remains a problem that a naturally occurring sequence is simultaneously detected.
  • the DNA sequence is at most 600 bases long, and when a longer sequence is used as a standard substance at the time of measurement using a DNA myloarray or the like, or in a multiplex nucleic acid quantification system, multiple types of nucleic acid standards having the same performance There was also a problem that it was not possible to cope with the case where substances were required at the same time.
  • An object of the present invention is to provide a detection probe design method capable of detecting a novel nucleic acid standard sample disclosed in Japanese Patent Application No. 2008-295338 with high accuracy, and detection of a nucleic acid standard substance designed by the design method.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid detection system including a probe for nucleic acid and a probe for detecting the nucleic acid standard substance.
  • the present invention includes the following.
  • a probe for detecting a standard substance comprising an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive base sequences of any one of SEQ ID NOS: 1 to 40.
  • the oligonucleotide is characterized by comprising at least 15 consecutive bases of a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 18, 20 to 22, 24 to 36, 38 and 40. Standard substance detection probe.
  • a nucleic acid detection system comprising the nucleic acid standard substance detection probe according to any one of (1) to (3).
  • the nucleic acid detection system according to (4) which is a microarray in which the probe for detecting a nucleic acid standard substance is fixed on a substrate.
  • a method for designing a probe for detecting a nucleic acid standard substance comprising calculating a Tm value for each of the detection probe candidate sequences not excluded in the above step and selecting a nucleic acid standard substance detection probe based on the calculated Tm value .
  • the method further comprises a step of calculating a dimer formation ratio and / or a secondary structure formation ratio in each molecule for each detection probe candidate sequence, and the calculated dimer formation ratio and / or secondary structure formation.
  • the binding rate between the oligonucleotide having the detection probe candidate sequence and the off-target is the binding rate at a temperature when the detection probe candidate sequence and the nucleic acid standard substance to be detected are hybridized at a predetermined ratio.
  • the nucleic acid standard substance detection probe In the step of selecting a nucleic acid standard substance detection probe based on the Tm value, the nucleic acid standard substance detection probe is regarded as a higher rank as the Tm value is closer to a predetermined value among a plurality of detection probe candidate sequences.
  • the method further comprises a step of performing a hybridization experiment between the dilution series of the nucleic acid standard substance to be detected and the selected nucleic acid standard substance detection probe and verifying the detectability of the selected nucleic acid standard substance detection probe.
  • the quantification ability between the nucleic acid quantification apparatuses can be compared and evaluated, or the quantitative values obtained by different nucleic acid quantification apparatuses can be objectively evaluated and compared. It becomes possible to detect a novel nucleic acid standard with high accuracy.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of detecting a nucleic acid standard substance 500_1 using six types of DNA microarrays A to F.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of detecting a nucleic acid standard substance 500_1 using six types of DNA microarrays A to F.
  • FIG. 11 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 500_1 using the DNA microarray A from the characteristic diagram shown in FIG. 11-1.
  • FIG. 11 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_1 using the DNA microarray B from the characteristic chart shown in FIG. 11-1.
  • FIG. 11 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_1 using the DNA microarray C from the characteristic diagram shown in FIG. 11-1.
  • FIG. 11 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting a nucleic acid standard substance 500_1 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 11-1.
  • FIG. 11 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 500_1 using the DNA microarray A from the characteristic diagram shown in FIG. 11-1.
  • FIG. 11 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_1 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 11-1.
  • FIG. 11 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_1 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG. 11-1. It is a characteristic view showing the result of detecting a nucleic acid standard substance 500_2 using six types of DNA microarrays A to F.
  • FIG. 13 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 500_2 using the DNA microarray A from the characteristic chart shown in FIG. 12-1.
  • FIG. 12 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_1 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 11-1.
  • FIG. 11 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_1 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG
  • FIG. 13 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 500_2 using the DNA microarray B from the characteristic chart shown in FIG. 12-1.
  • FIG. 13 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting a nucleic acid standard substance 500_2 using the DNA microarray C from the characteristic chart shown in FIG. 12-1.
  • FIG. 13 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_2 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 12-1.
  • FIG. 13 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_2 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 12-1.
  • FIG. 13 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting a nucleic acid standard substance 500_2 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG. 12-1. It is a characteristic view showing the result of detecting nucleic acid standard substance 500_3 using six types of DNA microarrays A to F.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 500_3 using the DNA microarray A from the characteristic chart shown in FIG. 13-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_3 using the DNA microarray B from the characteristic chart shown in FIG. 13-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_3 using the DNA microarray C from the characteristic chart shown in FIG. 13-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_3 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 13-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_3 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 13-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_3 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG. 13-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_4 using the DNA microarray A from the characteristic chart shown in FIG. 14-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_4 using the DNA microarray B from the characteristic chart shown in FIG. 14-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_4 using the DNA microarray C from the characteristic chart shown in FIG. 14-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_4 using the DNA microarray A from the characteristic chart shown in FIG. 14-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_4 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 14-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_4 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 14-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting a nucleic acid standard substance 500_4 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG. 14-1. It is a characteristic view showing the result of detecting nucleic acid standard substance 500_5 using six types of DNA microarrays A to F.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_4 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 14-1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_4 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG
  • FIG. 15 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_5 using the DNA microarray A from the characteristic diagram shown in FIG. 15-1.
  • FIG. 15 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_5 using the DNA microarray B from the characteristic diagram shown in FIG. 15-1.
  • FIG. 15 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting a nucleic acid standard substance 500_5 using the DNA microarray C from the characteristic chart shown in FIG. 15-1.
  • FIG. 15 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_5 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 15-1.
  • FIG. 15 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 500_5 using the DNA microarray A from the characteristic diagram shown in FIG. 15-1.
  • FIG. 15 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting a nucleic acid standard substance 500_5 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 15-1.
  • FIG. 15 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 500_5 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG. 15-1.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing the results of detecting a nucleic acid standard substance 1000_1 using six types of DNA microarrays A to F.
  • FIG. 16 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_1 using the DNA microarray A from the characteristic diagram shown in FIG. 16-1.
  • FIG. 16 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_1 using the DNA microarray A from the characteristic diagram shown in FIG. 16-1.
  • FIG. 16 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_1 using the DNA microarray B from the characteristic diagram shown in FIG. 16-1.
  • FIG. 16 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_1 using the DNA microarray C from the characteristic chart shown in FIG. 16-1.
  • FIG. 16 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_1 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 16-1.
  • FIG. 16 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_1 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 16-1.
  • FIG. 16 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_1 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG. 16-1.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of detecting a nucleic acid standard substance 1000_2 using six types of DNA microarrays A to F.
  • FIG. 18 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_2 using the DNA microarray A from the characteristic diagram shown in FIG. 17-1.
  • FIG. 18 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_2 using the DNA microarray B from the characteristic diagram shown in FIG. 17-1.
  • FIG. 18 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_2 using the DNA microarray C from the characteristic diagram shown in FIG. 17-1.
  • FIG. 18 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_2 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 17-1.
  • FIG. 18 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_2 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 17-1.
  • FIG. 18 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_2 using the DNA microarray F from the characteristic diagram shown in FIG. 17-1.
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_3 using the DNA microarray A from the characteristic chart shown in FIG. 18-1.
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_3 using the DNA microarray B from the characteristic diagram shown in FIG. 18-1.
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_3 using the DNA microarray C from the characteristic chart shown in FIG. 18-1.
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_3 using the DNA microarray A from the characteristic chart shown in FIG. 18-1.
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_3 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 18-1.
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_3 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 18-1.
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_3 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG. 18-1.
  • It is a characteristic view showing the result of detecting nucleic acid standard substance 1000_4 using six types of DNA microarrays A to F.
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_3 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 18-1.
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_3 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in
  • FIG. 20 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_4 using the DNA microarray A from the characteristic chart shown in FIG. 19-1.
  • FIG. 20 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_4 using the DNA microarray B from the characteristic chart shown in FIG. 19-1.
  • FIG. 20 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_4 using the DNA microarray C from the characteristic chart shown in FIG. 19-1.
  • FIG. 20 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_4 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 19-1.
  • FIG. 20 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_4 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 19-1.
  • FIG. 20 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_4 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG. 19-1.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing the results of detecting a nucleic acid standard substance 1000_5 using six types of DNA microarrays A to F.
  • FIG. 21 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_5 using the DNA microarray A from the characteristic chart shown in FIG. 20-1.
  • FIG. 20 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_4 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 19-1.
  • FIG. 20 is a characteristic diagram showing the result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_4 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG
  • FIG. 21 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_5 using the DNA microarray B from the characteristic diagram shown in FIG. 20-1.
  • FIG. 21 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_5 using the DNA microarray C from the characteristic chart shown in FIG. 20-1.
  • FIG. 21 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_5 using the DNA microarray D from the characteristic chart shown in FIG. 20-1.
  • FIG. 21 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_5 using the DNA microarray E from the characteristic chart shown in FIG. 20-1.
  • FIG. 21 is a characteristic diagram showing an extracted result of detecting the nucleic acid standard substance 1000_5 using the DNA microarray F from the characteristic chart shown in FIG. 20-1.
  • nucleic acid refers to a nucleotide or polynucleotide in which a plurality of nucleosides are ester-linked in a straight chain via a phosphate group, including a short chain such as an oligonucleotide, in a single-stranded state. In addition, a state in which a double strand is formed with a complementary strand is also included.
  • the type of nucleotide is usually DNA or RNA, but when some nucleotides are modified with a methyl group or the like, and oxygen is substituted with sulfur, artificial nucleic acids such as PNA and LNA are also included.
  • the base sequence of the nucleic acid of the present invention is indicated by each sequence number
  • the base sequence of the single-stranded DNA described is read as the corresponding base sequence.
  • thymine (T) is read as uracil (U).
  • the “probe” includes an oligonucleotide in which the nucleic acids defined above are arranged in a predetermined order, and may be referred to as a nucleic acid probe.
  • the “probe” allows the oligonucleotide to hybridize to a nucleic acid construct having a predetermined sequence by complementary binding of nucleic acids.
  • the “probe” can supplement the nucleic acid construct by hybridizing to the target nucleic acid construct. For example, when detecting the presence or absence of the target nucleic acid construct, It can be used in measuring the abundance of the nucleic acid construct.
  • the target nucleic acid construct is not particularly limited, and is synthesized from mRNAs expressed in cells such as cells derived from mammals including humans, microorganisms including bacteria and fungi, plant cells, insect cells or the like. CDNA.
  • Examples of the target nucleic acid construct include DNA and RNA extracted from foods and environmental samples, or nucleic acid fragments amplified using these DNA or RNA as a template.
  • the target nucleic acid construct is meant to include a “nucleic acid standard substance” whose details will be described later.
  • the “probe” is particularly referred to as a “nucleic acid standard substance detection probe”.
  • the “probe” includes a detection probe for detecting a nucleic acid construct for the purpose described above.
  • the “probe” detects hybridization with the linker molecule for fixing one end of the oligonucleotide to the substrate and the target nucleic acid construct. Therefore, it may contain a labeling substance such as a fluorescent substance, a quenching substance, or any other molecule or substance.
  • the “probe” does not contain molecules and substances such as the above-described linker molecules, labeling substances, and quenching substances, and may consist of the above-described oligonucleotides.
  • oligonucleotide means that the number of nucleotides is not limited at all, and includes molecules consisting of any number of nucleotides. Specifically, the oligonucleotide can be designed as a molecule having a length of 15 to 500 bases, for example.
  • the oligonucleotide in the standard substance detection probe is designed to have a predetermined base sequence by a design method described in detail later.
  • the oligonucleotide consists of at least 15 consecutive base sequences of any one of SEQ ID NOs: 1 to 40. That is, in the present invention, 40 types of probes for detecting a standard substance containing oligonucleotides comprising at least 15 consecutive base sequences of any one of SEQ ID NOS: 1 to 40 are provided.
  • the base length of the oligonucleotide in the probe for detecting a nucleic acid standard substance can be, for example, 15 to 60 bases, preferably 20 to 60 bases, and preferably 40 to 60 bases. More preferably, the length is 50 to 60 bases, still more preferably 60 bases.
  • the base length of the oligonucleotide in the nucleic acid standard substance detection probe can be designed together with the base length of the detection probe described above, for example.
  • nucleic acid standard refers to the following 2. Means a nucleic acid construct having a base sequence without bias in GC content and having a non-natural base sequence that does not have a higher order structure, obtained according to the design method of In particular, in the prior application (Japanese Patent Application No. 2008-295338), as a “nucleic acid standard substance”, a nucleic acid comprising a base sequence of 10,000 bases or more, and a partial sequence of the nucleic acid having a length of 500 bases or 1000 bases A plurality of nucleic acids consisting of the base sequences are designed.
  • nucleic acid standard in particular, a nucleic acid standard consisting of a base sequence of 500 bases shown in any of SEQ ID NOs: 41 to 45 and a base sequence of 1000 bases shown in any of SEQ ID NOs: 46 to 50
  • the nucleic acid standard substance which consists of can be mentioned.
  • nucleic acid standard substance may be one that has been modified to immobilize the above-described nucleic acid construct on the surface of a substrate, a bead or the like, or a tag for labeling. May be.
  • the “nucleic acid standard substance” consisting of the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 41 to 50 is a combination of oligonucleotides having a constant GC content, and the entire nucleic acid base sequence as well as a partial region thereof. Is designed to be different from the base sequence of a naturally occurring nucleic acid so that the GC content remains constant and does not form a higher order structure.
  • this nucleic acid standard when used, PCR amplification or the like is not affected by variations in GC content in the sequence or the presence or absence of higher-order structures, and the bases differ from those of natural nucleic acids. Since it has a sequence, even if DNA other than the target existing in nature is unexpectedly mixed in the quantification system of the calibration experiment, it has little influence on PCR amplification and the like. Due to this, when this nucleic acid standard is used, the target nucleic acid construct can be detected and quantified with high accuracy. Furthermore, this nucleic acid standard does not have 20 or more consecutive bases that match the base sequence of a naturally occurring nucleic acid. For this reason, the above-described probe for detecting a nucleic acid standard substance is prevented from simultaneously hybridizing a naturally occurring sequence, even if it hybridizes to any part of these nucleic acid standard substances.
  • nucleic acid standard In order to prepare the nucleic acid standard defined in (1), a base sequence is designed according to the procedures of the following steps (1) to (6), and DNA synthesis or RNA synthesis is performed according to the obtained base sequence.
  • such a nucleic acid standard design method is similar to an existing base sequence registered in a database from a large number of DNAs designed by combining a plurality of DNAs having a certain length and a certain CG content. After deleting them and combining them, a sequence similar to a known base sequence existing in nature is further deleted from the binding sequence, and the sequence of a certain length selected does not have a higher-order structure. That is, the corresponding sequence that is supposed to promote the formation of the higher order structure is deleted, and it is further confirmed that there is no repetitive sequence in the nucleic acid sequence.
  • uracil in the RNA sequence is read as thymine.
  • the designed nucleic acid standard substance can be suitably used as a standard DNA sample used in a DNA quantification apparatus and a standard RNA sample used in an RNA quantification apparatus.
  • a standard RNA sample between different RNA quantification devices and comparing them, performance comparison such as sensitivity and accuracy can be performed, and calibration of each quantification device is also possible.
  • examples of the DNA quantification apparatus include a quantitative PCR apparatus and a DNA microarray apparatus.
  • examples of the RNA quantification apparatus include a quantitative PCR apparatus and a DNA microarray apparatus that also target RNA molecules.
  • a standard DNA sample and a standard RNA sample it can be used as a solution in which a predetermined amount of a nucleic acid standard substance is dissolved in sterile water or a buffer solution.
  • the sample can also be used by mixing a plurality of types of nucleic acid standards.
  • nucleic acid standard substance can be used as a reference for determining that there is no problem in the quantification operation itself.
  • the above-described nucleic acid standard substance can be added as an internal standard substance to standardize the measurement value.
  • the DNA microarray apparatus when the above-mentioned nucleic acid standard substance is immobilized on the same or different substrate or bead surface as the target test nucleic acid sample in a single strand state, various analysis of the test nucleic acid sample is performed. As a control sample. Even if the nucleic acid corresponding to the base sequence at any position of the full length is selected, there is almost no possibility of detecting a naturally occurring sequence even if it is immobilized at a high density on the substrate surface. It can also be used for background correction with a chip immobilized on a substrate or for quality control of a DNA microarray.
  • a base sequence is designed according to the following steps 1 to 3, and DNA synthesis or RNA synthesis is performed according to the obtained base sequence.
  • a plurality of probe candidate sequences are designed so as to cover the entire nucleic acid standard. Specifically, for example, first, the base length of the probe candidate sequence to be designed is fixed to a predetermined length. Next, the predetermined length is assigned to the base sequence of the nucleic acid standard substance so as to include one end thereof to be the first probe candidate sequence, and then the predetermined sequence is shifted by one base to the other end. Assign the length of to other probe candidate sequences. The predetermined length is assigned so as to include the other end of the base sequence of the nucleic acid standard substance, and this is used as the last probe candidate sequence. That is, when the base sequence of the nucleic acid standard substance to be detected is X base length and the probe candidate sequence to be designed is n base length, (X ⁇ n + 1) probe candidate sequences are designed.
  • the nucleic acid standard substance to be detected may be divided into a plurality of regions, and a plurality of probe candidate sequences may be designed according to the above-described method for each divided region.
  • the nucleic acid standard substance to be detected can be divided into a 3 ′ terminal region and a 5 ′ terminal region, and probe candidate sequences can be designed for each of the 3 ′ terminal region and the 5 ′ terminal region. .
  • Step 2 the plurality of probe candidate sequences designed in step 1 are narrowed down based on the cross-hybridization rate with the off target.
  • step 2 first, for each probe candidate sequence, an off-target is searched from a known database by applying a homology search program.
  • the homology search program is not particularly limited, but known programs such as SSEARCH, FASTA, BLAST, and PSI-BLAST can be applied.
  • publicly known databases are not particularly limited, but databases such as Genbank (NCBI), DDBJ (Japan DNA Data Bank), EMBL (EBI), Unigene, and TIGR Gene Indeces that store nucleic acid sequences may be used. it can.
  • the database is searched using the base sequence of the probe candidate sequence as a query sequence.
  • an entry including a base sequence having a region having a high homology value with respect to the base sequence of the probe candidate sequence is specified.
  • the entry may include mRNAs actually expressed in cells, genes based on genomic analysis, information on splicing variants, RNA information such as snRNA, miRNA, rRNA, Mt_tRNA, etc. Contains sequence information.
  • 100 types of entries can be specified as the off target in descending order of homology.
  • the information regarding the off target only the base sequence included in the specified entry may be used. Therefore, the base sequence included in the specified entry may be acquired.
  • a temperature (denoted as T 99 ) at which the ratio (binding rate) at which each probe candidate sequence hybridizes to the nucleic acid standard substance to be detected reaches a predetermined value (for example, 99%) is calculated.
  • a predetermined value for example, 99%
  • the left side f is a coupling rate.
  • .DELTA.G T is the binding free energy change at a temperature T
  • C P is the concentration of probe candidate sequences
  • R is the gas constant
  • T is the absolute temperature.
  • the C P can be assigned, for example, 0.5 [mu] M
  • the f can be calculated value of T as 99.
  • the above formula, .DELTA.G T is, Nearest Neighbor method for nucleotide sequence of the nucleic acid calibrator to be detected (PNAS, 1998, 95: 1460-1465 ) can be calculated based on.
  • hybrid-min can be used as software for calculating ⁇ G by Nearest Neighbor method (Bioinformatics, Volume II. Structure, Functions and Applications (Method in Molecular Biology) 2008, chapter 1, pages 3-31). .
  • the temperature (T 99 ) at which each probe candidate sequence identified in Step 1 above and the nucleic acid standard substance hybridize with a binding rate of 99%, for example, can be calculated.
  • the binding rate at T 99 calculated as described above is calculated according to the above equation.
  • ⁇ G T can be calculated based on the Nearest Neighbor method (PNAS, 1998, 95: 1460-1465) for the off-target base sequence.
  • PNAS Nearest Neighbor method
  • this step 2 from the plurality of probe candidate sequences designed in step 1 above, those for which an off target whose binding rate exceeds a threshold (for example, 0.1%) are specified are excluded. That is, according to this step 2, the plurality of probe candidate sequences designed in the above step 1 can be narrowed down to only probe candidate sequences that generate cross-hybridization with an off target with a very low probability.
  • a threshold for example, 0.15%
  • Step 3 Tm values are calculated for the probe candidate sequences narrowed down in Step 2.
  • the probe for nucleic acid standard substance detection can hybridize well under the same temperature and salt concentration. It is preferable to approximate.
  • probe candidate sequences having Tm values close to each other can be specified.
  • the desired Tm value can be appropriately set within a range of 60 ° C. to 90 ° C., for example.
  • the dimer formation rate may be calculated for the probe candidate sequences narrowed down in step 2 by a known program such as Hybrid-min.
  • the formation ratio of secondary structure in the molecule may be calculated for the probe candidate sequences selected in step 2 by a known program such as Hybrid-ss. Thresholds may be set in advance for the dimer formation ratio and secondary structure formation ratio, and those exceeding the threshold may be excluded from the probe candidate sequences.
  • Step 4 the probe candidate sequences narrowed down to the above step 3 are actually synthesized as oligonucleotides and hybridized with a separately synthesized nucleic acid standard, and the performance as a probe is evaluated.
  • DNA microarrays include DNA microarray technology provided by Agilent Technologies Inc., Toray Industries, Inc., Mitsubishi Rayon Co., Ltd., DNA Chip Laboratories, Inc., Roche Nimblegen Co., Ltd., and Kurashiki Spinning Co., Ltd. (Kurabo Co., Ltd.). Can be used.
  • a protocol can be obtained from each company, and those skilled in the art can implement suitably based on these protocols.
  • a sample solution (including a gene serving as a positive control) in which a nucleic acid standard substance to be detected is diluted stepwise is prepared, and an oligonucleotide consisting of a candidate probe sequence to be evaluated.
  • the sample solution may contain a nucleic acid fragment amplified by PCR or RT-PCR using a synthesized nucleic acid standard as a template, or may contain a synthesized nucleic acid standard as it is.
  • marker at the time of detecting hybridization it may differ with various platforms, and you may use the same label
  • the signal value derived from the oligonucleotide consisting of the probe candidate sequence to be evaluated is normalized, and it is verified whether the normalized signal value changes depending on the concentration of the nucleic acid standard.
  • the normalization method is not particularly limited, and examples thereof include a process of subtracting the background value from the raw signal value in the same DNA microarray and dividing the result by the median value of a plurality of types of positive control-derived signals.
  • the background value is a signal when a region where the oligonucleotide is not fixed is measured.
  • the positive control is not particularly limited, and examples thereof include 10 types of genes such as ACTB gene, B2M gene, GAPDH gene, GUSB gene, HPRT1 gene, PGK1 gene, PPIA gene, RPLP0 gene, TBP gene, and YWHAZ gene. be able to.
  • this step 4 it is possible to select a plurality of probe candidate sequences further narrowed down in step 3 that can generate a signal depending on the concentration of the nucleic acid standard based on the result of the hybridization experiment. it can.
  • this Step 4 it is preferable to select a probe candidate sequence capable of generating a signal depending on the concentration of the nucleic acid standard substance in all of the plurality of platforms related to the DNA microarray.
  • a probe for detecting a nucleic acid substance was designed for a nucleic acid standard substance having the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 41 to 50 by executing the above steps 1 to 4.
  • these 10 kinds of nucleic acid standards were divided into 5 ′ terminal region and 3 ′ terminal region, respectively, and two probes for detecting nucleic acid standard materials were designed for each of the 5 ′ terminal region and the 3 ′ terminal region.
  • the nucleic acid standard substance having a length of 500 bases shown in SEQ ID NOs: 41 to 45 the 5 ′ end region from the 5 ′ end to the 300 th end was the 5 ′ end region, and the 301 th to 3 ′ end was the 3 ′ end region.
  • SSARCH was used as a homology search program with default settings, and an Ensemble (rel.49) human cDNA sequence database was used as the database.
  • 10 types of nucleic acid standard substances consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 41 to 50 are respectively “500_1”, “500_2”, “500_3”, “500_4”, “500_5”, “1000_1”. ”,“ 1000_2 ”,“ 1000_3 ”,“ 1000_4 ”, and“ 1000_5 ”.
  • four types of nucleic acid standard substance detection probes (40 types in total) could be designed for each of the 10 types of nucleic acid standard substances having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 41 to 50.
  • the probe for detecting a nucleic acid standard substance designed in (1) can be widely used in nucleic acid detection systems and nucleic acid quantification systems based on hybridization between probes such as DNA microarrays and DNA bead arrays and nucleic acids to be detected.
  • the probe for detecting a nucleic acid standard substance is fixed at a predetermined position on the surface of the substrate.
  • a probe for detecting a nucleic acid standard substance is immobilized on a predetermined bead surface.
  • nucleic acid standard substance detection probe In such a system, one type of nucleic acid standard substance detection probe may be used, but a plurality of types of nucleic acid standard substance detection probes may be used. All or part of the 40 types of nucleic acid standard substance detection probes (SEQ ID NOs: 1 to 40) designed as described above can be used. In particular, the above-described 40 types of nucleic acid standard substance detection probes are excellent in detection sensitivity on various platforms, and it has been demonstrated that nucleic acid standard substances can be quantified with high accuracy. It is.
  • probe names displayed in the oligo_id column in Table 1 are excluded: 500_1_1 (SEQ ID NO: 1), 500_5_3 (SEQ ID NO: 19), 1000_1_3 (SEQ ID NO: 23), 1000_5_1 (SEQ ID NO: 37), and 1000_5_3 (SEQ ID NO: 39). It has been demonstrated that other nucleic acid standard substance detection probes can quantitate nucleic acid standard substances with particularly high sensitivity (see Examples described later).
  • the probe for detecting a nucleic acid standard substance can detect with high sensitivity whether the nucleic acid to be detected is DNA or RNA. If the nucleic acid to be detected is a DNA microarray, a nucleic acid standard detection probe may be prepared as a DNA molecule. If the nucleic acid to be detected is RNA, a nucleic acid standard detection probe is prepared as an RNA molecule. do it.
  • Example 1 DNA microarray
  • Six DNA microarrays of Agilent Technology Co., Ltd., Toray Co., Ltd., Mitsubishi Rayon Co., Ltd., DNA Chip Laboratories Co., Ltd., Roche Nimblegen Co., Ltd. and Kurashiki Spin Co., Ltd. (Kurabo Co., Ltd.) was used for gene expression analysis according to the standard protocol of each company.
  • DNA microarrays comprising 40 nucleic acid standard substance detection probes having 40 types of oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 40 were produced according to the specifications specific to each company.
  • a to F six types of DNA microarrays with different specifications manufactured by the above six companies will be denoted as A to F in random order.
  • each DNA microarray was provided with a probe that specifically hybridizes to 10 types of genes as a positive control for use in signal normalization.
  • the 10 types of positive control genes were ACTB gene, B2M gene, GAPDH gene, GUSB gene, HPRT1 gene, PGK1 gene, PPIA gene, RPLP0 gene, TBP gene and YWHAZ gene.
  • Human Reference RNA 50 ng / uL was used to prevent adsorption to the inner surface of the tube.
  • Human Reference RNA (50 ng / uL) was prepared from commercially available HURR (pool) (1241.78 ng / uL) (24.2 ⁇ uL HURR mixed with 575.8 uL D.W.).
  • a standard amount of 6 types (S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6) is obtained by separating and mixing a predetermined amount of these 6 types of liquid mixture.
  • a substance stock solution was prepared.
  • Table 3 shows the concentrations of 10 kinds of nucleic acid standard substances contained in the standard substance stock solution.
  • DNA Microarray Measurement Using the samples prepared as described above, signals in 40 types of nucleic acid standard substance detection probes were measured according to the protocols of each company. The measured signals were normalized and compared by the following method. That is, the signal value in the nucleic acid standard substance detection probe was normalized by subtracting the background value from the signal value in the nucleic acid standard substance detection probe and dividing it by the median value of the signal value in the 10 positive controls.
  • FIG. 1 is a graph showing the detectability of four types of nucleic acid standard substance detection probes 500_1_1, 500_1_2, 500_1_3, and 500_1_4 prepared for the nucleic acid standard substance 500_1.
  • the horizontal axis represents the logarithm of the concentration of the nucleic acid standard substance
  • the vertical axis represents the logarithm of the median value of the signal value after normalization.
  • FIG. 11A is a graph showing the detectability of the four types of nucleic acid standard substance detection probes 500_1_1, 500_1_2, 500_1_3, and 500_1_4 prepared for the nucleic acid standard substance 500_1 in all six types of DNA microarrays A to F.
  • the results relating to DNA microarrays A to F were extracted from the graph shown in FIG. 11A and divided into FIGS. 11-2 to 11-7.
  • the horizontal axis represents the logarithm of the concentration of the nucleic acid standard substance
  • the vertical axis represents the logarithm of the median value of the signal value after normalization.
  • the detection results of the nucleic acid standard substances “500_2”, “500 — 3”, “500 — 4”, “500 — 5”, “1000 — 1”, “1000 — 2”, “1000 — 3”, “1000 — 4” and “1000 — 5” are shown in FIG. -1, 13-1, 14-1, 15-1, 16-1, 17-1, 18-1, 19-1 and 20-1. Also for these, similarly to FIGS. 11-1 to 11-7, the results regarding the DNA microarrays A to F are extracted and divided.
  • each of the 40 types of nucleic acid standard substance detection probes prepared in this example can detect the nucleic acid standard substance to be detected with high accuracy. Also, as shown in FIGS. 1 to 20, the signal values resulting from these 40 types of nucleic acid standard substance detection probes and the concentration of the nucleic acid standard substance show a linear relationship. Therefore, by using these 40 kinds of nucleic acid standard substance detection probes and a dilution series of nucleic acid standard substances, for example, when quantifying mRNA expressed in cells, the nucleic acid to be detected contained in the sample is greatly reduced. Can be accurately quantified.

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Abstract

　新規な核酸標準試料を高精度に検出する。　配列番号１～４０のうちいずれかに示す塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含む標準物質検出用プローブを用いて、配列番号４１～５０のいずれかに示す塩基配列を有する核酸標準試料を検出する。

Description

核酸標準物質検出用プローブの設計方法、核酸標準物質検出用プローブ及び当該核酸標準物質検出用プローブを有する核酸検出系
　本発明は、核酸を検出及び/又は定量する系に使用される核酸標準物質を検出するためのプローブの設計方法及び、当該設計方法により設計された核酸標準物質検出用プローブ並びに当該核酸標準物質検出用プローブを備える核酸検出系に関する。
　近年、テイラーメイド医療への急速なニーズの高まりにともなって、ＳＮＰｓやトランスクリプトーム等のDNA・RNAに関する遺伝子多型の判別と、それらに対する核酸定量技術が医療分野において盛んに導入されている。病原性ウイルスや細菌等に由来する核酸（遺伝子）の定量的検出による感染症診断や薬剤投与後の予後診断にも複数の対象をターゲットとした核酸定量が欠かせない。食品、農林水産分野、環境分野においても、核酸を指標とした微生物定量検査や品種混入評価のための核酸定量技術が導入され始めている。
　現在、特定の配列を持つ核酸の定量のため、定量的PCR法をはじめDNAマイクロアレイ（DNAチップ）技術等様々な定量的核酸評価手法が用いられている。定量的PCRにおいては、標的核酸を検出するためのプライマーによるPCRを行い、その標的の存在量を定量的に評価する。また、DNAマイクロアレイは、遺伝子発現量などを定量的に評価するため、各mRNAを標的とし特異的にハイブリダイズするプローブを多数配列させ、遺伝子発現量を相対的に定量するものである。
　これらの核酸定量技術においては、定量操作そのものに問題が無いことを判定するための基準として、核酸標準物質が用いられる。また、DNAマイクロアレイや競争的PCR等により相対定量を行う場合には、被験核酸とは異なった塩基配列を持つ核酸を内部標準物質として添加し、測定値を標準化する。ここで使用する核酸標準物質としては従来、天然に存在する遺伝子配列の一部が使用されてきたが、これら従来の核酸標準物質は、様々な手法・装置・キット間で共通に定量結果を比較するのに十分な性能を備えていなかった。
　これらを解決するために、非天然で高次構造をとらない塩基配列からなるDNAを設計する方法が開発されている。この方法では、互いにミスハイブリダイゼーションを起こしにくいDNA配列を効率よく設計するものである。この方法は、所定の長さのDNA配列を、ＧまたはＣとＡまたはＴを０と１からなるビット列（テンプレート）で表わした場合、各テンプレート間、各テンプレートの逆配列間、これらをシフトした配列間、これらの連結配列間とのハミング距離が、いずれも所定値以上になるテンプレートを選択し、当該テンプレートが表現するDNA配列の集合の中から、DNA配列同士が少なくとも前記ハミング距離ｋを保つDNA配列の集合を選定するというものである（特許文献１、２参照。）。
　さらに、本発明者らは、これらの原理を利用し、塩基配列中の塩基に偏りがなく、しかも非天然で高次構造をとらない塩基配列からなるDNAを設計する方法を開発した(特許文献３)。この方法では、一定の長さと一定のＣＧ含量を有するDNAを複数組み合わせてデザインした多数のDNAから、データベースに登録されている既存の塩基配列と一致するものを除き、そのDNAを組み合わせて作成する。具体的には、特許文献１の方法を用い、ＧＣ含量５０％で長さが１２ｍｅｒの塩基配列を複数設計し、さらにこれらの配列をつなぎ合わせて、約６００塩基の塩基配列をデザインし、このようにデザインした複数の候補配列の中で、核酸塩基配列および翻訳産物の配列が既存の核酸・蛋白質データベースのレコードと６０％以上一致しないものを選択したものである。
　ところで、核酸標準物質として、既知の遺伝子配列を利用することに起因して生じる主な問題点としては、例えば以下のものが考えられる。
１）天然に存在する塩基配列を有する核酸標準物質の場合、核酸定量系に予期せず混入するDNAやRNAとハイブリダイズする等の恐れがあり、これがPCR等の増幅効率や検出系に影響を与え、定量値が正確でない可能性がある。
２）核酸標準物質における塩基配列やＧＣ含量、高次構造の形成しやすさ、といった性質がPCR等の増幅効率に影響を与え、使用する核酸標準物質中の標的配列が異なっている場合には、定量値に違いが生じる恐れがある。
３）従来、校正等の目的で定量装置・定量手法ごとに異なった標準物質が使われてきた。それら種類が異なった標準物質の、塩基配列も物性も異なったサイトに対してプライマー、プローブを設計することから、増幅やハイブリダイゼーションの効率は各種核酸定量装置ごと・定量手法ごとに異なる。このため定量値を客観的に比較・校正することは難しく、各手法・装置・キット等による定量性の優劣を比較すること、また、異なった手法・装置・キット等で得られた定量値を評価、比較することは非常に困難であった。
　特許文献３の手法は上記のような問題点を解決すべく本発明者らにより開発された手法であり、当該手法で得られたDNA配列は非天然の配列であって、上記１）～３）の問題の一部は回避できる核酸標準物質である。しかしながら、当該DNA配列中には依然として天然に存在する配列と連続して２０塩基以上一致する配列が複数箇所含まれているため、当該DNA配列の検出用核酸プローブ、プライマーを作製するために、当該DNA配列又はその相補配列中の部分配列を用いようとすると、当該類似配列部分を選択する可能性が高く、結果として天然に存在する配列を同時に検出してしまう問題を残している。また、当該DNA配列はたかだか６００塩基長であり、DNAマイロアレイなどによる測定時においてより長い配列が標準物質として使用される場合、またマルチプレックスによる核酸定量系において、同一性能を有する複数種類の核酸標準物質が同時に必要とされる場合に対応できないという問題もあった。
　このような問題を解決することを目的として、本発明者らは、核酸の定量値が正確で、各種核酸定量装置により得られた定量値を客観的な値に校正することが可能であって、このため、各核酸定量装置間の定量能力を比較、評価でき、あるいは異なる核酸定量装置で得られた定量値を、客観的に評価、比較可能にし得る新規な核酸標準物質に関する特許出願をした（特願２００８－２９５３３８号）。
特開２００４－３５５２９４号公報 ＷＯ２００３／０３８０９１ 特開２００７－６０９６６号公報
　本発明の課題は、特願２００８－２９５３３８号にて開示した新規な核酸標準試料を、高精度に検出することができる検出用プローブの設計方法及び、当該設計方法により設計された核酸標準物質検出用プローブ並びに当該核酸標準物質検出用プローブを備える核酸検出システムを提供することにある。
　本発明は以下を包含する。
　（１）配列番号１～４０のうちいずれかに示す塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含む標準物質検出用プローブ。
　（２）上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２～１８、２０～２２、２４～３６、３８及び４０からなる群から選ばれる塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなることを特徴とする（１）記載の標準物質検出用プローブ。
　（３）上記オリゴヌクレオチドは、６０塩基から構成されることを特徴とする（１）又は（２）記載の核酸標準物質検出用プローブ。
　（４）（１）乃至（３）いずれか一に記載の核酸標準物質検出用プローブを有する核酸検出システム。
　（５）上記核酸標準物質検出用プローブを基板上に固定したマイクロアレイであることを特徴とする（４）記載の核酸検出システム。
　（６）検出対象の核酸標準物質の塩基配列に基づいて、所定の塩基長を有する複数の検出用プローブ候補配列を特定するステップと、
　上記ステップで特定した各検出用プローブ候補配列のオフターゲットを検索し、検出用プローブ候補配列を有するオリゴヌクレオチドとオフターゲットとの結合率を算出し、上記ステップで特定した複数の検出用プローブ候補配列のなかから、算出した結合率が閾値を超えるオフターゲットが特定されたものを排除するステップと、
　上記ステップで排除されなかった検出用プローブ候補配列のそれぞれについてTm値を算出し、算出したTm値に基づいて核酸標準物質検出用プローブを選抜するステップを有する、核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
　（７）検出用プローブ候補配列のそれぞれについてダイマーの形成割合及び/又は分子内の二次構造の形成割合を算出するステップを更に有し、算出したダイマーの形成割合及び/又は二次構造の形成割合が所定の閾値を超えるものを排除するステップを更に有することを特徴とする（６）記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
　（８）　上記オフターゲットは、特定した各検出用プローブ候補配列の塩基配列に基づいて、塩基配列情報が格納されたデータベースを検索して特定することを特徴とする（６）記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
　（９）　上記検出用プローブ候補配列を有するオリゴヌクレオチドとオフターゲットとの結合率は、検出用プローブ候補配列と検出対象の核酸標準物質とが所定の割合でハイブリダイズするときの温度における結合率として算出することを特徴とする（６）記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
　（１０）　Tm値に基づいて核酸標準物質検出用プローブを選抜するステップでは、複数の検出用プローブ候補配列のなかでTm値が所定の値に近いほど高順位なものとして核酸標準物質検出用プローブを選抜することを特徴とする（６）記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
　（１１）　検出対象の核酸標準物質の希釈系列と選抜した核酸標準物質検出用プローブとのハイブリダイズ実験を行い、選抜した核酸標準物質検出用プローブの検出能を検証するステップを更に有することを特徴とする（６）記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-113343号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明に係る核酸標準物質検出用プローブによれば、各核酸定量装置間の定量能力を比較、評価でき、あるいは異なる核酸定量装置で得られた定量値を、客観的に評価、比較可能にし得る新規な核酸標準物質を高精度に検出することが可能となる。
DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を示す特性図である。 DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿２を検出した結果を示す特性図である。 DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿３を検出した結果を示す特性図である。 DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿４を検出した結果を示す特性図である。 DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿５を検出した結果を示す特性図である。 DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿１を検出した結果を示す特性図である。 DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿２を検出した結果を示す特性図である。 DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿３を検出した結果を示す特性図である。 DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿４を検出した結果を示す特性図である。 DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿５を検出した結果を示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を示す特性図である。 図１１－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１１－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１１－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１１－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１１－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１１－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質５００＿２を検出した結果を示す特性図である。 図１２－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１２－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質５００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１２－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質５００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１２－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質５００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１２－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質５００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１２－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質５００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質５００＿３を検出した結果を示す特性図である。 図１３－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１３－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質５００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１３－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質５００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１３－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質５００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１３－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質５００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１３－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質５００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質５００＿４を検出した結果を示す特性図である。 図１４－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１４－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質５００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１４－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質５００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１４－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質５００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１４－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質５００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１４－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質５００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質５００＿５を検出した結果を示す特性図である。 図１５－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１５－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質５００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１５－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質５００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１５－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質５００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１５－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質５００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１５－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質５００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質１０００＿１を検出した結果を示す特性図である。 図１６－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１６－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質１０００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１６－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質１０００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１６－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質１０００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１６－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質１０００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１６－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質１０００＿１を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質１０００＿２を検出した結果を示す特性図である。 図１７－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１７－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質１０００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１７－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質１０００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１７－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質１０００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１７－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質１０００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１７－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質１０００＿２を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質１０００＿３を検出した結果を示す特性図である。 図１８－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１８－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質１０００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１８－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質１０００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１８－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質１０００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１８－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質１０００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１８－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質１０００＿３を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質１０００＿４を検出した結果を示す特性図である。 図１９－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１９－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質１０００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１９－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質１０００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１９－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質１０００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１９－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質１０００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図１９－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質１０００＿４を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 ６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質１０００＿５を検出した結果を示す特性図である。 図２０－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質１０００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図２０－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＢを用いて核酸標準物質１０００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図２０－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＣを用いて核酸標準物質１０００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図２０－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＤを用いて核酸標準物質１０００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図２０－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＥを用いて核酸標準物質１０００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。 図２０－１に示した特性図から、DNAマイクロアレイＦを用いて核酸標準物質１０００＿５を検出した結果を抜き出して示す特性図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．用語の定義
　本発明において、「核酸」とは、ヌクレオシドがリン酸基を介して直鎖状に複数個エステル結合したヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指し、オリゴヌクレオチドなど短い鎖も含み、一本鎖の状態及び相補鎖と共に二本鎖が形成された状態も含まれる。ヌクレオチドの種類は、通常DNA又はRNAであるが、一部のヌクレオチドがメチル基などで修飾されている場合、酸素がイオウに置換している場合、ＰＮＡ、ＬＮＡなどの人工核酸も包む。なお、本発明の核酸の塩基配列を各配列番号で示す際には、表記される一本鎖DNAの塩基配列をそれぞれ対応する塩基配列に読み替える。例えば、二本鎖DNAの場合は相補配列との対として、一本鎖RNAの場合はチミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）として読み替える。
　本発明において「プローブ」とは、上記で定義した核酸が所定の順序で配列してなるオリゴヌクレオチドを含み、核酸プローブと称される場合もある。「プローブ」は、核酸の相補結合により所定の配列からなる核酸構築物に対して上記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができる。換言すると、「プローブ」は、目的とする核酸構築物に対してハイブリダイズすることで当該核酸構築物を補足することができ、例えば、目的とする核酸構築物の存在の有無を検出する際、又は目的とする核酸構築物の存在量を測定する際に使用することができる。ここで、目的とする核酸構築物とは、特に限定されず、ヒトを含む哺乳動物由来の細胞、細菌や真菌を含む微生物、植物細胞、昆虫細胞など細胞中において発現したmRNA又は当該mRNAから合成されたcDNAを挙げることができる。また、目的とする核酸構築物とは、例えば、食品や環境試料から抽出されたDNA、RNA、又はこれらDNA若しくはRNAを鋳型として増幅された核酸断片を挙げることができる。さらに、目的とする核酸構築物は、詳細を後述する「核酸標準物質」を含む意味である。
　ハイブリダイズの対象となる核酸構築物が「核酸標準物質」である場合、その「プローブ」を特に「核酸標準物質検出用プローブ」と称する。なお、「プローブ」としては、この核酸標準物質検出用プローブ以外に、上述したようなことを目的とする核酸構築物を検出する検出用のプローブがある。
　また、「プローブ」は、目的とする核酸構築物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド以外に、当該オリゴヌクレオチドの一方端部を基板に固定するためのリンカー分子、目的とする核酸構築物とのハイブリダイズを検出するための蛍光物質等の標識物質や消光物質、その他いかなる分子や物質を含んでいても良い。なお、「プローブ」は、上述したリンカー分子、標識物質及び消光物質等の分子や物質を含んでおらず、上述したオリゴヌクレオチドからなるものであっても良い。
　ここで、オリゴヌクレオチドと称する場合、ヌクレオチドの個数は何ら限定されず、如何なる個数のヌクレオチドからなる分子をも包含する意味である。具体的に、オリゴヌクレオチドとしては、例えば、１５～５００塩基長の分子として設計することができる。
　特に、標準物質検出用プローブにおけるオリゴヌクレオチドは、詳細を後述する設計方法により所定の塩基配列となるように設計される。具体的に、本発明に係る標準物質検出用プローブにおいてオリゴヌクレオチドは、配列番号１～４０のうちいずれかに示す塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなる。すなわち、本発明においては、配列番号１～４０のうちいずれかに示す塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含む４０種類の標準物質検出用プローブが提供される。
　さらに、核酸標準物質検出用プローブにおけるオリゴヌクレオチドの塩基長としては、例えば、１５～６０塩基長とすることができ、２０～６０塩基長とすることが好ましく、４０～６０塩基長とすることがより好ましく、５０～６０塩基長とすることが更に好ましく、６０塩基長とすることが最も好ましい。また、核酸標準物質検出用プローブにおけるオリゴヌクレオチドの塩基長は、例えば、上述した検出用のプローブの塩基長に併せて設計することができる。
　一方、本発明において、「核酸標準物質」というとき、下記２．の設計方法に従って得られた、ＧＣ含量に偏りのない塩基配列を有し、かつ、非天然で高次構造をとらない塩基配列を有する核酸構築物を意味する。特に、先願（特願2008-295338号）においては、「核酸標準物質」として、１０，０００塩基以上の塩基配列からなる核酸及び、当該核酸の部分配列であって５００塩基長若しくは１０００塩基長の塩基配列からなる複数の核酸を設計している。本発明において核酸標準物質としては、特に、配列番号４１～４５のいずれかに示す５００塩基長の塩基配列からなる核酸標準物質、及び配列番号４６～５０のいずれかに示す１０００塩基長の塩基配列からなる核酸標準物質を挙げることができる。
　また、「核酸標準物質」は、上述の核酸構築物を基板やビーズなどの表面に固定化処理するための修飾が施されたものであっても良いし、標識用タグが付加されたものであってもよい。特に、配列番号４１～５０のいずれかに示した塩基配列からなる「核酸標準物質」は、ＧＣ含量が一定のオリゴヌクレオチドを組み合わせており、全体の核酸の塩基配列はもちろん、その一部の領域においてもＧＣ含量が一定となるよう、また、高次構造を形成しないよう、更に天然に存在する核酸の塩基配列とは異なるように設計している。したがって、この核酸標準物質を使用した場合には、配列中のＧＣ含量のバラツキや高次構造の有無によりPCR増幅等が影響されることがなく、また、天然の核酸の塩基配列とは異なる塩基配列を有するために、天然に存在する目的以外のDNAが校正実験の定量系に予期せず混入しても、それによりPCR増幅等に与える影響は少ない。これに起因して、この核酸標準物質を使用した場合には、目的とする核酸構築物の検出や定量が高精度に可能となる。さらに、この核酸標準物質は、天然に存在する核酸の塩基配列と一致する配列を連続して２０塩基以上有していない。このため、上述した核酸標準物質検出用プローブは、これら核酸標準物質のいかなる部分にハイブリダイズするものであっても、天然に存在する配列を同時にハイブリダイズすることが防止されている。
２．「核酸標準物質」の設計方法
　上記１．で定義した核酸標準物質を作製するためには、以下の（１）～（６）の工程の手順に従って塩基配列が設計され、得られた塩基配列に従ってDNA合成又はRNA合成をする。
（１）ＧＣ含量が３０～７０％の範囲で一定の値に設定された、３６塩基長のオリゴヌクレオチドをランダムに複数種類生成する工程、
（２）当該オリゴヌクレオチドのうち、下記（ａ）～（ｃ）に該当するオリゴヌクレオチドを除外する工程、
　（ａ）公共塩基配列データベースに登録されている既存の塩基配列と類似性を示す配列（３６塩基中１８塩基以上既知の配列と一致した配列）、
　（ｂ）当該オリゴヌクレオチド間で互いに塩基配列を比較し、他の配列と１８塩基以上一致した配列、
　（ｃ）同一の塩基が４塩基以上の連続する配列、
（３）前記工程（２）で残った複数のオリゴヌクレオチドを任意の順序で繋ぎあわせ、数千から数万塩基長のポリヌクレオチドを得る工程、
（４）前記工程（３）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列中で、下記（ｄ）～（ｇ）に該当する配列を検索し、対応する領域を除去する工程、
　（ｄ）２０塩基中１５塩基以上の一致した配列を持つ繰り返し配列、
　（ｅ）配列内で２本鎖構造（２次構造）を形成する可能性のある配列、すなわち２０塩基中１５塩基以上結合する配列（相補配列）、および１０塩基以上連続して結合する可能性のある配列（相補配列）、
　（ｆ）公共塩基配列データベースに登録されている既存の塩基配列と類似性を示す配列、すなわち１００塩基中５０塩基以上既知の配列と一致した配列、および２０塩基以上連続して他の配列と一致した配列、
　（ｇ）同じ塩基が４塩基以上連続する配列、
（５）前記工程（４）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列及び対応するアミノ酸配列が既存のデータベースのレコードと５０％以上一致しないことを確認する工程。
（６）必要に応じて、得られた長鎖の配列を任意の長さに切り分ける工程。
　つまり、このような核酸標準物質の設計方法は、一定の長さと一定のＣＧ含量を有するDNAを複数組み合わせてデザインした多数のDNAから、データベースに登録されている既存の塩基配列と類似するものを削除し、それらを結合させた後、結合配列から天然に存在する既知の塩基配列と類似する配列をさらに削除したものであり、また、選択した一定の長さの配列が高次構造をとらないことを確認し、高次構造の形成を促進すると思われる該当配列を削除し、さらに、核酸配列中に繰り返し配列を有しないことを確認するものである。
　なお、上記（ａ）、（ｆ）工程など、既存のデータベース内の塩基配列と比較する場合、RNA配列中のウラシルはチミンと読み替える。
　設計された核酸標準物質は、DNA定量装置に使用する標準DNA試料として、またRNA定量装置に使用する標準RNA試料として好適に使用できる。標準RNA試料を異なるRNA定量装置間において使用して、これを比較することにより、その感度、正確性等の性能比較を行うことができ、また、各定量装置の校正も可能となる。
　ここで、DNA定量装置としては、定量的PCR装置やDNAマイクロアレイ装置などを挙げることができる。また、RNA定量装置としては、同じくRNA分子を標的とした定量的PCR装置やDNAマイクロアレイ装置を挙げることができる。
　標準DNA試料および標準RNA試料を調整するためには、滅菌水又は緩衝液に核酸標準物質を所定量溶解した溶液として利用可能である。また、その試料には複数種類の核酸標準物質を混合して利用することもできる。
　これらの核酸定量技術において、定量操作そのものに問題が無いことを判定するための基準として、上述した核酸標準物質を利用することができる。また、DNAマイクロアレイや定量的PCR等により核酸の相対定量を行う場合には、上述した核酸標準物質を内部標準物質として添加し、測定値の標準化を行うことが可能となる。
　さらに、DNAマイクロアレイ装置においては、上述した核酸標準物質を１本鎖の状態で、標的となる被検核酸試料と同一もしくは異なる基板又はビーズ表面に固定化し、被検核酸試料の各種解析を行う際の対照試料として用いることができる。全長のどの位置の塩基配列に対応する核酸を選択しても、基板表面に高密度で固定化しても天然に存在する配列を検出してしまう可能性がほとんどないため、被検核酸試料と同一基板上に固定化したチップなどでのバックグラウンド補正やDNAマイクロアレイの品質管理にも用いることができる。
３．核酸標準物質検出用プローブの設計方法
　上記１．で定義した核酸標準物質検出用プローブを作製するためには、以下のステップ１～３に従って塩基配列が設計され、得られた塩基配列に従ってDNA合成又はRNA合成をする。
＜ステップ１＞
　検出対象の核酸標準物質の塩基配列に基づいて、当該核酸標準物質の全体を網羅的にカバーするように複数のプローブ候補配列を設計する。具体的には、例えば、先ず、設計するプローブ候補配列の塩基長を所定の長さに固定しておく。次に、核酸標準物質の塩基配列に対してその一方端部を含むように上記所定の長さを割り当てて１番目のプローブ候補配列とし、その後、一塩基ずつ他方端部にずらすように上記所定の長さを割り当てて他のプローブ候補配列とし。核酸標準物質の塩基配列における他方端部を含むように上記所定の長さを割り当て最後のプローブ候補配列とする。つまり、検出対象の核酸標準物質の塩基配列がＸ塩基長であり、設計するプローブ候補配列がｎ塩基長である場合、（Ｘ－ｎ＋１）個のプローブ候補配列を設計することとなる。
　このとき、検出対象の核酸標準物質を複数に分割し、分割した各領域について上述した手法に従って複数のプローブ候補配列を設計しても良い。例えば、検出対象の核酸標準物質を３’末端側領域と５’末端側領域に２分割して、３’末端側領域及び５’末端側領域のそれぞれについて、プローブ候補配列を設計することができる。
＜ステップ２＞
　本ステップ２では、上記ステップ１で設計した複数のプローブ候補配列をオフターゲットとのクロスハイブリダイゼーション率に基づいて絞り込む。
　本ステップ２では、先ず、各プローブ候補配列について、相同性検索プログラムを適用して公知のデータベースからオフターゲットを検索する。ここで、相同性検索プログラムとしては、特に限定されないが、例えばSSEARCH、FASTA、BLAST及びPSI-BLASTといった公知のプログラムを適用することができる。また、公知のデータベースとしては、特に限定されないが、核酸配列が格納されたGenbank（NCBI）、DDBJ（日本DNAデータバンク）、EMBL（EBI）、Unigene及びTIGR Gene Indeces等のデータベースを使用することができる。
　より具体的に、プローブ候補配列の塩基配列をクエリー配列としてデータベースを検索する。検索の結果として、当該プローブ候補配列の塩基配列に対して相同性の値が高い領域を有する塩基配列を含むエントリーを特定する。なお、検索に使用するデータベースにより異なるが、当該エントリーとしては、実際に細胞内で発現したmRNA、ゲノム解析に基づく遺伝子、スプライシングバリアントの情報、snRNA、miRNA、rRNA、Mt_tRNA等のRNA情報等に関する塩基配列情報が含まれる。
　一例として、オフターゲットとしては、相同性の高い順に１００種類のエントリーを特定することができる。以下の処理において、オフターゲットに関する情報としては、特定されたエントリーに含まれる塩基配列のみでもよいため、特定されたエントリーに含まれる塩基配列を取得すればよい。
　次に、各プローブ候補配列と検出対象の核酸標準物質とがハイブリダイズする割合（結合率）が所定の値（例えば、９９％）となるときの温度（T99と表記する）を算出する。このとき、一例として、Nucleic Acid Res. 2006, 34, W665-W669に開示された下記式を使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　当該式において左辺fは結合率である。また、当該式において、ΔGTは温度Tにおける結合自由エネルギー変化であり、CPはプローブ候補配列の濃度であり、Rは気体定数であり、Tは絶対温度である。
　上述した温度を計算する際、CPとしては例えば0.5μMを代入することができ、fを99としてTの値を算出することができる。なお、上記式は、ΔGTは、検出対象の核酸標準物質の塩基配列についてNearest Neighbor法（PNAS, 1998, 95: 1460-1465）に基づいて算出することができる。なお、Nearest Neighbor法によりΔGを計算するソフトウェアとしては、hybrid-minを使用することができる（Bioinformatics, Volume II. Structure, Functions and Applications (Method in Molecular Biology) 2008, chapter 1, pages 3-31）。
　この処理により、上記ステップ１で特定した各プローブ候補配列と核酸標準物質とが、例えば９９％の結合率でハイブリダイズするときの温度（T99）を算出することができる。
　次に、本ステップ２では、上述のように特定したオフターゲットについて、上述のように算出したT99における結合率を上記式に従って算出する。なお、この段階でも、ΔGTは、オフターゲットの塩基配列についてNearest Neighbor法（PNAS, 1998, 95: 1460-1465）に基づいて算出することができる。以上のようにして、上記ステップ１で設計された複数のプローブ候補配列の全てについて、T99におけるオフターゲットとの結合率を算出する。
　次に、本ステップ２では、上記ステップ１で設計された複数のプローブ候補配列の中から、結合率が閾値（例えば、０．１％）を超えるオフターゲットが特定されたものを排除する。すなわち、本ステップ２によれば、上記ステップ１で設計された複数のプローブ候補配列を、オフターゲットとのクロスハイブリダイゼーションが極めて低い確率でしか発生しないようなプローブ候補配列のみに絞り込むことができる。
＜ステップ３＞
　本ステップ３では、ステップ２で絞り込まれたプローブ候補配列について、Tm値を算出する。Tm値は、結合率が５０％になる温度である。よって、上記式から算出することができる（f＝０．５として、Tを決める）。このとき、二分探索アルゴリズムを使用することで高速化を図ることができる。また、ステップ２で絞り込まれたプローブ候補配列についてTm値を算出する方法としては、このような方法に限定されず、従来公知の方法を採用してもよい。
　本ステップ３では、ステップ２で絞り込まれた複数のプローブ候補配列についてそれぞれTm値が算出されるため、所望のTm値（例えば、Tm＝８０℃）に近い順に複数のプローブ候補配列をソートすることができる。すなわち、本ステップ３では、ステップ２で絞り込まれた複数のプローブ候補配列のなかで、Tm値が所定の値に近いほど高順位なものとして順位づけすることができる。
　例えば、複数の核酸標準物質のそれぞれについて核酸標準物質検出用プローブを設計する場合、核酸標準物質検出用プローブとしては、温度や塩濃度が同一条件下において良好にハイブリダイズできるため、互いにTm値が近似している方が好ましい。本ステップ３によれば、複数の核酸標準物質のそれぞれについて、互いにTm値が近接したプローブ候補配列を特定することができる。なお、所望のTm値としては、例えば６０℃～９０℃の範囲で適宜設定することができる。
　なお、本ステップ３では、ステップ２で絞り込まれたプローブ候補配列について、更に、例えばHybrid-min等の公知のプログラムによってダイマーの形成割合を算出しても良い。また、なお、本ステップ３では、ステップ２で絞り込まれたプローブ候補配列について、更に、例えばHybrid-ss等の公知のプログラムによって分子内の二次構造の形成割合を算出しても良い。これらダイマーの形成割合や二次構造の形成割合について予め閾値を設定しておき、閾値を超えるものについてはプローブ候補配列から排除するようにしても良い。
＜ステップ４＞
　本ステップ４では、上記ステップ３までで絞り込まれたプローブ候補配列について、実際にオリゴヌクレオチドとして合成し、別途合成した核酸標準物質とのハイブリダイズ実験を行い、プローブとしての性能を評価する。
　このとき、ハイブリダイズ実験としては、DNAマイクロアレイに関する種々のプラットフォームを採用して実験を行うことが好ましい。DNAマイクロアレイとしては、例えば、アジレント・テクノロジー株式会社、東レ株式会社、三菱レイヨン株式会社、株式会社DNAチップ研究所、ロシュ・ニンブルジェン株式会社及び倉敷紡績株式会社（クラボウ社）が提供するDNAマイクロアレイ技術を使用することができる。なお、これら各社のDNAマイクロアレイについては、各社よりプロトコールを入手することができ、これらプロトコールに基づいて当業者が適宜実施することができる。
　具体的に、ハイブリダイズ実験としては、検出対象の核酸標準物質を段階的に希釈したサンプル溶液（その他にポジティブコントロールとなる遺伝子が含まれる）を準備し、評価対象のプローブ候補配列からなるオリゴヌクレオチドを固定したDNAマイクロアレイを用いる。なお、サンプル溶液としては、合成した核酸標準物質を鋳型としてPCRやRT-PCRによって増幅した核酸断片を含むものであっても良いし、合成した核酸標準物質をそのまま含むものであっても良い。また、ハイブリダイズを検出する際の標識としては、各種プラットフォームにより異なっていても良いし、または同じ標識を使用してもよい。
　ハイブリダイズ実験の結果としては、評価対象のプローブ候補配列からなるオリゴヌクレオチドに由来するシグナル値を正規化し、正規化されたシグナル値が核酸標準物質の濃度依存的に変化しているかを検証する。なお、正規化の方法は、特に限定されないが、同一のDNAマイクロアレイにおける生シグナル値からバックグラウンド値を引き、複数種類のポジティブコントロール由来シグナルのメディアン値で割るといった処理を挙げることができる。なお、バックグラウンド値とは、オリゴヌクレオチドが固定されていない領域を測定したときのシグナルである。また、ポジティブコントロールとしては、特に限定されないが、例えば、ACTB遺伝子、B2M遺伝子、GAPDH遺伝子、GUSB遺伝子、HPRT1遺伝子、PGK1遺伝子、PPIA遺伝子、RPLP0遺伝子、TBP遺伝子及びYWHAZ遺伝子の１０種類の遺伝子を挙げることができる。
　本ステップ４では、ステップ３で更に絞り込まれた複数のプローブ候補配列の中から、ハイブリダイズ実験の結果に基づいて、核酸標準物質の濃度依存的にシグナルを生じることができるものを選択することができる。特に、本ステップ４では、DNAマイクロアレイに関する複数のプラットフォームの全てにおいて、核酸標準物質の濃度依存的にシグナルを生じることができるプローブ候補配列を選択することが好ましい。
　具体的に上記ステップ１～ステップ４を実行することで、配列番号４１～５０のいずれかに示した塩基配列からなる核酸標準物質について、核酸物質検出用プローブを設計した。詳細にはこれら１０種類の核酸標準物質をそれぞれ５’末端領域及び３’末端領域に２分割し、５’末端領域及び３’末端領域のそれぞれについて２つの核酸標準物質検出用プローブを設計した。なお、配列番号４１～４５に示した５００塩基長からなる核酸標準物質については、５’末端から３００番目までを５’末端領域とし、３０１番目から３’末端までを３’末端領域とした。また、ステップ２においては、相同性検索プログラムとしてSSARCHをデフォルトの設定で使用し、データベースとしてEnsemble(rel.49)ヒトcDNA配列データベースを利用した。
　設計された核酸標準物質検出用プローブの一覧を下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　なお、上記表において、配列番号４１～５０に示した塩基配列からなる１０種類の核酸標準物質は、それぞれ順に「５００＿１」、「５００＿２」、「５００＿３」、「５００＿４」、「５００＿５」、「１０００＿１」、「１０００＿２」、「１０００＿３」、「１０００＿４」及び「１０００＿５」と表記した。表１に示すように、配列番号４１～５０に示した塩基配列からなる１０種類の核酸標準物質について、それぞれ４種類の核酸標準物質検出用プローブ（合計４０種類）を設計することができた。
４．核酸標準物質検出用プローブの使用
　上記３．にて設計された核酸標準物質検出用プローブは、所謂DNAマイクロアレイやDNAビーズアレイ等のプローブと検出対象核酸とのハイブリダイズに基づく、核酸検出システム・核酸定量システムに広く利用することができる。DNAマイクロアレイに使用する場合、核酸標準物質検出用プローブは基板の表面における所定の位置に固定される。DNAビーズアレイに使用する場合、核酸標準物質検出用プローブは所定のビーズ表面に固定される。
　また、このようなシステムにおいては、１種類の核酸標準物質検出用プローブを利用すればよいが、複数種類の核酸標準物質検出用プローブを利用しても良い。上述のように設計した４０種類の核酸標準物質検出用プローブ（配列番号１から４０）を全て又は一部使用することができる。特に、上述した４０種類の核酸標準物質検出用プローブについては、種々のプラットフォームにおいて検出感度に優れており、且つ核酸標準物質を高精度に定量できることが実証されているため、このようなシステムにおいて好適である。
　なかでも、表１におけるoligo_id欄に表示したプローブ名：５００＿１＿１（配列番号１）、５００＿５＿３（配列番号１９）、１０００＿１＿３（配列番号２３）、１０００＿５＿１（配列番号３７）及び１０００＿５＿３（配列番号３９）を除く他の核酸標準物質検出用プローブは、特に高感度に核酸標準物質を定量できることが実証（後述の実施例参照）されている。したがって、表１におけるoligo_id欄に表示したプローブ名：５００＿１＿１（配列番号１）、５００＿５＿３（配列番号１９）、１０００＿１＿３（配列番号２３）、１０００＿５＿１（配列番号３７）及び１０００＿５＿３（配列番号３９）を除く他の核酸標準物質検出用プローブを使用することがより好適である。
　なお、本発明に係る核酸標準物質検出用プローブは、検出対象の核酸がDNA及びRNAのいずれであっても高感度に検出することができる。検出対象の核酸がDNAマイクロアレイである場合にはDNA分子として核酸標準物質検出用プローブを準備すればよいし、検出対象の核酸がRNAである場合にはRNA分子として核酸標準物質検出用プローブを準備すればよい。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
DNAマイクロアレイ
　本実施例では、アジレント・テクノロジー株式会社、東レ株式会社、三菱レイヨン株式会社、株式会社DNAチップ研究所、ロシュ・ニンブルジェン株式会社及び倉敷紡績株式会社（クラボウ社）の６社のDNAマイクロアレイを用いて、各社の標準プロトコルに従って遺伝子発現解析を行った。これら６社には、配列番号１～４０に示した塩基配列を有する４０種類のオリゴヌクレオチドを有する４０種の核酸標準物質検出用プローブを備えるDNAマイクロアレイを各社特有の仕様に従って製造した。以下、本実施例の説明において、上記６社が製造した仕様の異なる６種類のDNAマイクロアレイを順不同にＡ～Ｆとして表記する。
　また、各DNAマイクロアレイは、シグナルの正規化の利用するためのポジティブコントロールとして、１０種類の遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブを備えるものとした。ポジティブコントロール用の１０種類の遺伝子は、ACTB遺伝子、B2M遺伝子、GAPDH遺伝子、GUSB遺伝子、HPRT1遺伝子、PGK1遺伝子、PPIA遺伝子、RPLP0遺伝子、TBP遺伝子及びYWHAZ遺伝子とした。
サンプルの調整
　上記４０種の核酸標準物質検出用プローブの検出能を評価するため、配列番号４１～５０に示した塩基配列からなる１０種類の核酸標準物質の希釈系列をサンプルとして調整した。なお、配列番号４１～５０に示した塩基配列からなる１０種類の核酸標準物質は、それぞれ順に「５００＿１」、「５００＿２」、「５００＿３」、「５００＿４」、「５００＿５」、「１０００＿１」、「１０００＿２」、「１０００＿３」、「１０００＿４」及び「１０００＿５」と表記している。
　先ず、表２に示す組成の６種類の混合液を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　なお、希釈には、チューブ内面への吸着を防ぐために、Human Reference RNA（50ng/uL）を用いた。Human Reference RNA（50ng/uL）は市販製品であるHURR (pool) （1241.78ng/uL）から作製した（24.2 uLのHURRに575.8 uLのD.W.を混合した）。
　次に、これら６種類の混合液を所定量分取して混合することによって、6種類（S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6) の標準物質原液を作製した。標準物質原液に含まれる１０種類の核酸標準物質の濃度を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　次に、得られた6種類の標準物質原液（S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6)に対して、22.55ul（28ug）のHURR (pool) （1241.78ng/uL）を加え、1反応あたり6.56ul（１マイクログラム）を使用するように濃度を調製して６種類のサンプルを作製した。
DNAマイクロアレイ測定
　上述のように作製したサンプルを用いて各社のプロトコルによって４０種の核酸標準物質検出用プローブにおけるシグナルを測定した。測定したシグナルは以下の方法によって正規化して比較した。すなわち、核酸標準物質検出用プローブにおけるシグナル値からバックグラウンド値を引き、１０種類のポジティブコントロールにおけるシグナル値のメディアン値で割ることで、核酸標準物質検出用プローブにおけるシグナル値を正規化した。
結果
　DNAマイクロアレイＡを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を図１に示す。図１には、核酸標準物質５００＿１について準備した４種類の核酸標準物質検出用プローブ５００＿１＿１、５００＿１＿２、５００＿１＿３及び５００＿１＿４の検出能をグラフとして示した。なお、図１において、横軸は核酸標準物質の濃度の対数、縦軸は正規化後のシグナル値のメディアン値の対数である。
　同様に、核酸標準物質「５００＿２」、「５００＿３」、「５００＿４」、「５００＿５」、「１０００＿１」、「１０００＿２」、「１０００＿３」、「１０００＿４」及び「１０００＿５」を検出した結果を図２～１０に示した。
　また、６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆを用いて核酸標準物質５００＿１を検出した結果を図１１－１～図１１－７に示す。図１１－１には、６種類のDNAマイクロアレイＡ～Ｆ全てにおける、核酸標準物質５００＿１について準備した４種類の核酸標準物質検出用プローブ５００＿１＿１、５００＿１＿２、５００＿１＿３及び５００＿１＿４について検出能をグラフとして示した。また、図１１－１に示したグラフの中から、DNAマイクロアレイＡ～Ｆに関する結果をそれぞれ抜き出し図１１－２～図１１－７に分割して示した。なお、図１１－１～図１１－７において、横軸は核酸標準物質の濃度の対数、縦軸は正規化後のシグナル値のメディアン値の対数である。
　同様に、核酸標準物質「５００＿２」、「５００＿３」、「５００＿４」、「５００＿５」、「１０００＿１」、「１０００＿２」、「１０００＿３」、「１０００＿４」及び「１０００＿５」を検出した結果をそれぞれ、図１２－１、図１３－１、図１４－１、図１５－１、図１６－１、図１７－１、図１８－１、図１９－１及び図２０－１に示した。また、これらについても、図１１－１～図１１－７と同様に、DNAマイクロアレイＡ～Ｆに関する結果をそれぞれ抜き出して分割して示した。
　図１～２０に示したように、本実施例で準備した４０種類の核酸標準物質検出用プローブは、それぞれ検出対象の核酸標準物質を高精度に検出できることが明らかとなった。また、図１～２０に示したように、これら４０種類の核酸標準物質検出用プローブに起因するシグナル値と核酸標準物質の濃度とは線形の関係を示している。したがって、これら４０種類の核酸標準物質検出用プローブと核酸標準物質の希釈系列とを使用することによって、例えば細胞内に発現するmRNAを定量する場合など、サンプル中に含まれる検出対象の核酸を非常に正確に定量することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (11)

  1. 　配列番号１～４０のうちいずれかに示す塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含む標準物質検出用プローブ。
  2. 　上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２～１８、２０～２２、２４～３６、３８及び４０からなる群から選ばれる塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなることを特徴とする請求項１記載の核酸標準物質検出用プローブ。
  3. 　上記オリゴヌクレオチドは、６０塩基から構成されることを請求項１又は２記載の核酸標準物質検出用プローブ。
  4. 　請求項１乃至３いずれか一項記載の核酸標準物質検出用プローブを有する核酸検出システム。
  5. 　上記核酸標準物質検出用プローブを基板上に固定したマイクロアレイであることを特徴とする請求項４記載の核酸検出システム。
  6. 　検出対象の核酸標準物質の塩基配列に基づいて、所定の塩基長を有する複数の検出用プローブ候補配列を特定するステップと、
    　上記ステップで特定した各検出用プローブ候補配列のオフターゲットを検索し、検出用プローブ候補配列を有するオリゴヌクレオチドとオフターゲットとの結合率を算出し、上記ステップで特定した複数の検出用プローブ候補配列のなかから、算出した結合率が閾値を超えるオフターゲットが特定されたものを排除するステップと、
    　上記ステップで排除されなかった検出用プローブ候補配列のそれぞれについてTm値を算出し、算出したTm値に基づいて核酸標準物質検出用プローブを選抜するステップを有する、核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
  7. 　検出用プローブ候補配列のそれぞれについてダイマーの形成割合及び/又は分子内の二次構造の形成割合を算出するステップを更に有し、算出したダイマーの形成割合及び/又は二次構造の形成割合が所定の閾値を超えるものを排除するステップを更に有することを特徴とする請求項６記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
  8. 　上記オフターゲットは、特定した各検出用プローブ候補配列の塩基配列に基づいて、塩基配列情報が格納されたデータベースを検索して特定することを特徴とする請求項６記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
  9. 　上記検出用プローブ候補配列を有するオリゴヌクレオチドとオフターゲットとの結合率は、検出用プローブ候補配列と検出対象の核酸標準物質とが所定の割合でハイブリダイズするときの温度における結合率として算出することを特徴とする請求項６記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
  10. 　Tm値に基づいて核酸標準物質検出用プローブを選抜するステップでは、複数の検出用プローブ候補配列のなかでTm値が所定の値に近いほど高順位なものとして核酸標準物質検出用プローブを選抜することを特徴とする請求項６記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
  11. 　検出対象の核酸標準物質の希釈系列と選抜した核酸標準物質検出用プローブとのハイブリダイズ実験を行い、選抜した核酸標準物質検出用プローブの検出能を検証するステップを更に有することを特徴とする請求項６記載の核酸標準物質検出用プローブの設計方法。
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