CN115044711A - 实时荧光pcr鉴别新型冠状病毒变异株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及实时荧光PCR鉴别新型冠状病毒变异株的方法。本发明利用TaqMan探针RT‑PCR技术建立了一种快速鉴别SARS‑CoV‑2主要变异株方法，针对每个突变位点设计两种TaqMan‑MGB探针，用两种荧光染料分别标记野生型和突变型探针，在1个PCR反应管中同时检测两种基因型。本发明利用TaqMan探针RT‑PCR技术建立了一种快速鉴别SARS‑CoV‑2主要变异株方法，可实现准确、快速、廉价的检测，及时监测SARS‑CoV‑2毒株的变异情况，对传染源进行追踪溯源，为动态评估疫苗对变异株的有效性提供依据。

Description

实时荧光PCR鉴别新型冠状病毒变异株的方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及实时荧光PCR鉴别新型冠状病毒变异株的方法。
背景技术
已报道的新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS CoV 2)具有多种突变株，例如Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)。这些突变株在传播性、致病性或免疫逃逸能力方面可能强于野生型新冠病毒。如Alpha、Beta、Gamma变异株均含有N501Y突变，可降低病毒受体结合区域(receptor binding domain，RBD)关键残基的极性，从而提高与血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme，ACE2)受体的亲和力；另外，Alpha和Omicron均携带HV69-70del突变，其可能导致S蛋白构象改变，有利于病毒逃离宿主的免疫反应。Beta和Gamma变异株不具有HV69-70del突变，在Beta变异株的RBD内存在E484K和K417N突变，使其具备免疫逃逸能力。Gamma变异株除了含有E484K和K417N/T突变，还含有V1176F突变，其传染性是普通SARS-CoV-2的1.4～2.2倍。Delta变异株携带L452R、T478K突变，具有增强S蛋白与ACE受体的亲和力和降低抗体识别双重作用，可对已接种疫苗的健康人造成突破性感染。Omicron变异株在刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)有32个突变位点，其RBD具有15个突变，它的furin切割位点附近携带H655Y+N679K+P681H三个突变，研究显示furin切割位点可能帮助病毒进入呼吸道的上皮细胞，而在furin切割位点附近出现的突变可能让刺突蛋白更容易被切割，从而增强病毒的感染能力。
现用于检测病毒的分子技术有实时荧光PCR(Real-time PCR，RT-PCR)法、恒温扩增法、基因测序法、数字PCR法等。目前，针对新冠病毒变异的鉴定主要使用新一代测序方法(next generation sequencing，NGS)，该方法准确、灵敏度高，但其操作较复杂、数据分析难度大、检测成本较高、耗时长，不易实现快速检测。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于建立一种快速鉴别SARS-CoV-2主要变异株的TaqMan探针RT-PCR方法，并使得该方法的特异性、敏感性、鉴定能力达到高通量测序相当的水平。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的核苷酸探针组，所述核苷酸探针组包括阻断SARS-CoV-2靶基因片段野生株扩增的第一核苷酸探针和阻断SARS-CoV-2靶基因片段变异型扩增的第二核苷酸探针；
所述第一核苷酸探针的核苷酸序列与野生型靶基因片段完全匹配，与变异型靶基因片段在变异位置处发生错配，所述第二核苷酸探针的核苷酸序列与变异型靶基因片段完全匹配，与野生型靶基因片段在变异位置处发生错配；
所述第一核苷酸探针和第二核苷酸探针具有相同的核苷酸序列通式：(Xm)N(Xn)，其中N为变异位置的互补碱基，Xm、Xn分别表示数量为m、n的碱基序列，m、n为5～12范围内的整数。
在可选实施方式中，
所述核苷酸探针在变异位置及其两侧1～12bp范围内，至少有1～4个核苷酸经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性，优选地，所述修饰为锁核酸修饰；所述核苷酸探针的3’末端经过修饰以淬灭荧光基团、增加探针的Tm值、阻断探针在扩增过程中延伸，优选地，所述修饰为BHQ1、BHQ2、MGB修饰。
在可选实施方式中，第一核苷酸探针和第二核苷酸探针的5’端带有不同的荧光标记，所述荧光标记选自HEX、FAM、CY5、ROX、Texas Red-X、CY3、JOE或TET。
在可选实施方式中，所述SARS-CoV-2靶基因片段变异株包括Alpha、Beta、Gamma、Delta或Omicron。
在可选实施方式中，所述Alpha的突变类型包括N501Y或HV69-70del；所述Beta的突变类型包括E484K或K417N；所述Gamma的突变类型包括K417T或V1176F；所述Delta的突变类型包括L452R或T478K；所述Omicron的突变类型包括H655Y、N679K或P681H。
优选地，用于鉴别N501Y变异的探针组包括探针1和探针2；所述探针1的核苷酸序列为CAACCCACTAATGGTG(SEQ ID NO.1N501Y-PW)，所述探针2的核苷酸序列为CAACCCACTTATGGTG(SEQ ID NO.2N501Y-PM)。
优选地，用于鉴别HV69-70del变异的探针组包括探针3和探针4；所述探针3的核苷酸序列为CCATGCTATACATGTCTCTGGG(SEQ ID NO.3HV69-70del-PW)，所述探针4的核苷酸序列为TTCCATGCTATATCTGGGACC(SEQ ID NO.4HV69-70del-PM)。
优选地，用于鉴别E484K变异的探针组包括探针5和探针6；所述探针5的核苷酸序列为AAACCTTCAACACCA(SEQ ID NO.5E484K-PW)，所述探针6的核苷酸序列为AAACCTTTAACACCA(SEQ ID NO.6E484K-PM)。
优选地，用于鉴别K417N变异的探针组包括探针7和探针8；所述探针7的核苷酸序列为CAGCAATCTTTCCAG(SEQ ID NO.7K417N-PW)，所述探针8的核苷酸序列为CAGCAATATTTCCAG(SEQ ID NO.8K417N-PM)。
优选地，用于鉴别V1176F变异的探针组包括探针9和探针10；所述探针9的核苷酸序列为ATGCTTCAGTTGTAAAC(SEQ ID NO.9V1176F-PW)，所述探针10的核苷酸序列为TTAATGCTTCATTTGTA(SEQ ID NO.10V1176F-PM)。
优选地，用于鉴别L452R变异的探针组包括探针11和探针12；所述探针11的核苷酸序列为ATAATTACCTGTATAGAT(SEQ ID NO.11L452R-PW)，所述探针12的核苷酸序列为TAATTACCGGTATAGAT(SEQ ID NO.12L452R-PM)。
优选地，用于鉴别T478K变异的探针组包括探针13和探针14；所述探针13的核苷酸序列为CGGTAGCACACCTT(SEQ ID NO.13T478K-PW)，所述探针14的核苷酸序列为CGGTAGCAAACCTT(SEQ ID NO.14T478K-PM)。
优选地，用于鉴别H655Y变异的探针组包括探针15和探针16；所述探针15的核苷酸序列为TGTTGACATGTTCAG(SEQ ID NO.15H655Y-PW)，所述探针16的核苷酸序列为GTTGACATATTCAGCC(SEQ ID NO.16H655Y-PM)。
优选地，用于鉴别N679K或P681H变异的探针组包括探针17和探针18；所述探针17的核苷酸序列为CTAATTCTCCTCGGC(SEQ ID NO.17N679K/P681H-PW)，所述探针18的核苷酸序列为CTAAATCTCATCGGC(SEQ ID NO.18N679K/P681H-PM)。
第二方面，本发明提供了一种用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的试剂和/或试剂盒，所述试剂和/或试剂盒包括前述实施方式任一项所述的核苷酸探针组中的至少一种、其他扩增试剂和/或扩增耗材。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N501Y变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针1和探针2。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别HV69-70del变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针3和探针4。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别E484K变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针5和探针6。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别K417N变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针7和探针8。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别V1176F变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针9和探针10。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别L452R变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针11和探针12。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别T478K变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针13和探针14。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别H655Y变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针15和探针16。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N679K或P681H变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针17和探针18。
优选地，所述探针与所述其他扩增试剂以单独包装的形式提供，或者所述探针与所述其他扩增试剂以混合的单一试剂的形式提供。
优选地，所述其他扩增试剂包括引物对、逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、无菌水；进一步可选地，所述其他扩增试剂为多种时，以单独包装的方式提供，或者所述其他扩增试剂中的至少两种以混合的单一试剂的形式提供。
优选地，所述试剂和/或试剂盒包括引物Mix、探针Mix、缓冲液和RT-PCR酶；
优选地，所述引物对由用于扩增包含所述变异型靶基因片段的变异位置的上游引物和下游引物组成，所述引物对与所述核苷酸探针在与靶基因片段结合的结合位点上无重叠或者部分重叠；进一步可选地，所述上游引物和所述下游引物的摩尔比为1：1～5，优选为1：1。
在可选实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N501Y变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：GTTACTTTCCTTTACAATCATATGGT(SEQ ID NO.19)和CAAAAGAAAGTACTACTACTCTGTATGGT(SEQ ID NO.20)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别HV69-70del变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTAC(SEQ ID NO.21)和TCATTAAATGGTAGGACAGGGTT(SEQ ID NO.22)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别E484K变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：CCGGTARCACACCTTGTA(SEQ ID NO.23)和CCATATGATTGTAAAGGAAAGT(SEQ IDNO.24)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别K417N变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：GTCAGACAAATCGCTCCA(SEQ ID NO.25)和GCCTGTAAAATCATCTGGTA(SEQ IDNO.26)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别V1176F变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TCACCAGATGTTGATTTAGG(SEQ ID NO.27)和TGAGGCGGTCAATTTCTT(SEQ IDNO.28)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别L452R变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：CTTGATTCTAAGGTTGGTGGTA(SEQ ID NO.29)和AGGTTTGAGATTAGACTTCC(SEQ IDNO.30)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别T478K变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TTCAACTGAAATCTATCAGGC(SEQ ID NO.31)和CAATTAAAACCTTBAACACCA(SEQ IDNO.32)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别H655Y变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：GGCGTGTTTATTCTACAGGTT(SEQ ID NO.33)和GCGCATATACCTGCACCA(SEQ IDNO.34)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N679K或P681H变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：ACCCATTGGTGCAGGTATAT(SEQ ID NO.35)和CAAGTGACATAGTGTAGGCAA(SEQID NO.36)。
优选地，所述试剂和/或试剂盒还包括RP引物对和RP探针，所述RP引物对的核苷酸序列分别如下所示：AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO.37)和GAGCGGCTGTCTCCACAAGT(SEQID NO.38)，所述RP探针的核苷酸序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(SEQ ID NO.39)。
第三方面，本发明提供了用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的混合反应体系，所述混合反应体系包括前述实施方式任一项所述试剂和待测样本。
优选地，所述待测样本为低拷贝数样本或低变异频率样本，优选地，所述低拷贝数为每毫升2×102～1×108个拷贝。
优选地，所述待测样本每毫升包括2×102个拷贝、1×103个拷贝、1×104个拷贝、1×105个拷贝、1×106个拷贝、1×107个拷贝或者1×108个拷贝。
第四方面，本发明提供了非诊断目的的用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的方法，所述方法包括以下步骤：(1)配制前述实施方式所述混合反应体系；(2)RT-PCR反应，所述RT-PCR反应包括逆转录、变性、退火和延伸。
在可选实施方式中，前述实施方式所述的混合反应体系或方法中所述待测样本为鼻咽拭子、痰或肺泡灌洗液。
本发明利用TaqMan探针RT-PCR技术建立了一种快速鉴别SARS-CoV-2主要变异株(Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron)方法，针对每个突变位点设计两种TaqMan-MGB探针(由于HV69～70位点有6bp缺失突变，使用普通TaqMan探针即可作出鉴别)，用两种荧光染料分别标记野生型和突变型探针，在1个PCR反应管中同时检测两种基因型。经优化测试，发现除了T478K-PW探针与突变型基因有交叉，其他探针均可准确区分出野生型和突变型。针对T478K-PW探针出现的等位位点特异性问题，设计了LNA-MGB探针，发现与T478K-PW探针相比，T478K-PWL探针可准确区分出野生型和突变型，无交叉反应。同时，为了确保检测结果的准确性，体系中加入了人RP基因作为内源性内部控制，以监测样品中的核酸提取质量和PCR反应抑制物。
本发明建立的TaqMan探针RT-PCR检测体系与其他冠状病毒或常见呼吸道感染病原体无交叉，特异性强，该方法最低检测限为2×102拷贝/mL，灵敏度高。从样品提取到出结果，整个实验过程只需约2.5小时，操作简单，更易推广本方法的使用。
可见，本发明利用TaqMan探针RT-PCR技术建立了一种快速鉴别SARS-CoV-2主要变异株方法，可实现准确、快速、廉价的检测，及时监测SARS-CoV-2毒株的变异情况，对传染源进行追踪溯源，为动态评估疫苗对变异株的有效性提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1合成RNA片段的野生型和突变型基因片段序列分析；
图2为本发明实施例3中RT-PCR鉴别各种SARS-CoV-2野生型和突变型基因的结果；
图3为本发明实施例4中T478K野生型LNA-MGB探针与MGB探针的鉴别性能对比结果；
图4为本发明效果例1中特异性检测结果；
图5为本发明效果例2中RT-PCR检测靶标RNA的敏感性评价结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。此外，术语“第一”和“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在某次具体实施方式中，第一方面，本发明提供了用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的核苷酸探针组，所述核苷酸探针组包括阻断SARS-CoV-2靶基因片段野生株扩增的第一核苷酸探针和阻断SARS-CoV-2靶基因片段变异型扩增的第二核苷酸探针；
所述第一核苷酸探针的核苷酸序列与野生型靶基因片段完全匹配，与变异型靶基因片段在变异位置处发生错配，所述第二核苷酸探针的核苷酸序列与变异型靶基因片段完全匹配，与野生型靶基因片段在变异位置处发生错配；
所述第一核苷酸探针和第二核苷酸探针具有相同的核苷酸序列通式：(Xm)N(Xn)，其中N为变异位置的互补碱基，Xm、Xn分别表示数量为m、n的碱基序列，m、n为5～12范围内的整数。
在可选实施方式中，
所述核苷酸探针在变异位置及其两侧1～12bp范围内，至少有1～4个核苷酸经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性，优选地，所述修饰为锁核酸修饰；所述核苷酸探针的3’末端经过修饰以淬灭荧光基团、增加探针的Tm值、阻断探针在扩增过程中延伸，优选地，所述修饰为BHQ1、BHQ2、MGB修饰。
在可选实施方式中，第一核苷酸探针和第二核苷酸探针的5’端带有不同的荧光标记，所述荧光标记选自HEX、FAM、CY5、ROX、Texas Red-X、CY3、JOE或TET。在可选实施方式中，所述SARS-CoV-2靶基因片段变异株包括Alpha、Beta、Gamma、Delta或Omicron。
在可选实施方式中，所述Alpha的突变类型包括N501Y或HV69-70del；所述Beta的突变类型包括E484K或K417N；所述Gamma的突变类型包括K417T或V1176F；所述Delta的突变类型包括L452R或T478K；所述Omicron的突变类型包括H655Y、N679K或P681H。
优选地，用于鉴别N501Y变异的探针组包括探针1和探针2；所述探针1的核苷酸序列为CAACCCACTAATGGTG(SEQ ID NO.1N501Y-PW)，所述探针2的核苷酸序列为CAACCCACTTATGGTG(SEQ ID NO.2N501Y-PM)。
优选地，用于鉴别HV69-70del变异的探针组包括探针3和探针4；所述探针3的核苷酸序列为CCATGCTATACATGTCTCTGGG(SEQ ID NO.3HV69-70del-PW)，所述探针4的核苷酸序列为TTCCATGCTATATCTGGGACC(SEQ ID NO.4HV69-70del-PM)。
优选地，用于鉴别E484K变异的探针组包括探针5和探针6；所述探针5的核苷酸序列为AAACCTTCAACACCA(SEQ ID NO.5E484K-PW)，所述探针6的核苷酸序列为AAACCTTTAACACCA(SEQ ID NO.6E484K-PM)。
优选地，用于鉴别K417N变异的探针组包括探针7和探针8；所述探针7的核苷酸序列为CAGCAATCTTTCCAG(SEQ ID NO.7K417N-PW)，所述探针8的核苷酸序列为CAGCAATATTTCCAG(SEQ ID NO.8K417N-PM)。
优选地，用于鉴别V1176F变异的探针组包括探针9和探针10；所述探针9的核苷酸序列为ATGCTTCAGTTGTAAAC(SEQ ID NO.9V1176F-PW)，所述探针10的核苷酸序列为TTAATGCTTCATTTGTA(SEQ ID NO.10V1176F-PM)。
优选地，用于鉴别L452R变异的探针组包括探针11和探针12；所述探针11的核苷酸序列为ATAATTACCTGTATAGAT(SEQ ID NO.11L452R-PW)，所述探针12的核苷酸序列为TAATTACCGGTATAGAT(SEQ ID NO.12L452R-PM)。
优选地，用于鉴别T478K变异的探针组包括探针13和探针14；所述探针13的核苷酸序列为CGGTAGCACACCTT(SEQ ID NO.13T478K-PW)，所述探针14的核苷酸序列为CGGTAGCAAACCTT(SEQ ID NO.14T478K-PM)。
优选地，用于鉴别H655Y变异的探针组包括探针15和探针16；所述探针15的核苷酸序列为TGTTGACATGTTCAG(SEQ ID NO.15H655Y-PW)，所述探针16的核苷酸序列为GTTGACATATTCAGCC(SEQ ID NO.16H655Y-PM)。
优选地，用于鉴别N679K或P681H变异的探针组包括探针17和探针18；所述探针17的核苷酸序列为CTAATTCTCCTCGGC(SEQ ID NO.17N679K/P681H-PW)，所述探针18的核苷酸序列为CTAAATCTCATCGGC(SEQ ID NO.18N679K/P681H-PM)。
第二方面，本发明提供了一种用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的试剂和/或试剂盒，所述试剂和/或试剂盒包括前述实施方式任一项所述的核苷酸探针组中的至少一种、其他扩增试剂和/或扩增耗材。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N501Y变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针1和探针2。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别HV69-70del变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针3和探针4。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别E484K变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针5和探针6。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别K417N变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针7和探针8。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别V1176F变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针9和探针10。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别L452R变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针11和探针12。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别T478K变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针13和探针14。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别H655Y变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针15和探针16。
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N679K或P681H变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针17和探针18。
优选地，所述探针与所述其他扩增试剂以单独包装的形式提供，或者所述探针与所述其他扩增试剂以混合的单一试剂的形式提供。
优选地，所述其他扩增试剂包括引物对、逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、无菌水；进一步可选地，所述其他扩增试剂为多种时，以单独包装的方式提供，或者所述其他扩增试剂中的至少两种以混合的单一试剂的形式提供。
优选地，所述试剂和/或试剂盒包括引物Mix、探针Mix、缓冲液和RT-PCR酶。
优选地，所述引物对由用于扩增包含所述变异型靶基因片段的变异位置的上游引物和下游引物组成，所述引物对与所述核苷酸探针在与靶基因片段结合的结合位点上无重叠或者部分重叠；进一步可选地，所述上游引物和所述下游引物的摩尔比为1：1～5，优选为1：1。
在可选实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N501Y变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：GTTACTTTCCTTTACAATCATATGGT(SEQ ID NO.19)和CAAAAGAAAGTACTACTACTCTGTATGGT(SEQ ID NO.20)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别HV69-70del变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTAC(SEQ ID NO.21)和TCATTAAATGGTAGGACAGGGTT(SEQ ID NO.22)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别E484K变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：CCGGTARCACACCTTGTA(SEQ ID NO.23)和CCATATGATTGTAAAGGAAAGT(SEQ IDNO.24)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别K417N变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：GTCAGACAAATCGCTCCA(SEQ ID NO.25)和GCCTGTAAAATCATCTGGTA(SEQ IDNO.26)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别V1176F变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TCACCAGATGTTGATTTAGG(SEQ ID NO.27)和TGAGGCGGTCAATTTCTT(SEQ IDNO.28)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别L452R变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：CTTGATTCTAAGGTTGGTGGTA(SEQ ID NO.29)和AGGTTTGAGATTAGACTTCC(SEQ IDNO.30)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别T478K变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TTCAACTGAAATCTATCAGGC(SEQ ID NO.31)和CAATTAAAACCTTBAACACCA(SEQ IDNO.32)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别H655Y变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：GGCGTGTTTATTCTACAGGTT(SEQ ID NO.33)和GCGCATATACCTGCACCA(SEQ IDNO.34)。
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N679K或P681H变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：ACCCATTGGTGCAGGTATAT(SEQ ID NO.35)和CAAGTGACATAGTGTAGGCAA(SEQID NO.36)。
优选地，所述试剂和/或试剂盒还包括RP引物对和RP探针，所述RP引物对的核苷酸序列分别如下所示：AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO.37)和GAGCGGCTGTCTCCACAAGT(SEQID NO.38)，所述RP探针的核苷酸序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(SEQ ID NO.39)。
第三方面，本发明提供了用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的混合反应体系，所述混合反应体系包括前述实施方式任一项所述试剂和待测样本。
优选地，所述待测样本为低拷贝数样本或低变异频率样本，优选地，所述低拷贝数为每毫升2×102～1×108个拷贝。
优选地，所述待测样本每毫升包括2×102个拷贝、1×103个拷贝、1×104个拷贝、1×105个拷贝、1×106个拷贝、1×107个拷贝或者1×108个拷贝。
第四方面，本发明提供了非诊断目的的用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的方法，所述方法包括以下步骤：(1)配制前述实施方式所述混合反应体系；(2)进行RT-PCR反应，所述PCR反应包括逆转录、变性、退火和延伸。
在可选实施方式中，前述实施方式所述的混合反应体系或方法中所述待测样本为鼻咽拭子、痰或肺泡灌洗液。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
以下实施例使用的主要样本、仪器和试剂如下：
1.样本
野生型SARS-CoV-2灭活病毒为军事医学研究院微生物流行病研究所提供；SARS-CoV-2国家参考品(批号：370099-202001)购自中国食品药品检定研究院；SARS-CoV-2变异株室间质量评价样本(编号：NCCL-I-42-02-2021)由国家卫生健康委临床检验中心(NCCL)提供。
2.主要仪器与试剂
CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；新羿生物数字PCR仪购自北京新羿生物科技公司；In vitro Transcription T7试剂盒和One Step PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司；QIAamp MinElute Virus Spin试剂盒购自德国凯杰公司。
实施例1
按照如下方法合成五种突变株RNA片段：
人工合成含有Alpha(含N501Y、HV69-70del)、Beta(E484K、K417N)、Gamma(K417T、V1176F)、Delta(L452R、T478K)和Omicron(H655Y、N679K、P681H)DNA片段，其上游均含有T7启动子序列(TAATACGACTCACTATA SEQ ID No.41)，测序验证。使用体外转录试剂盒按说明书将其转录为RNA，具体步骤为：按顺序依次添加10×Transcription Buffer 2μL，ATPSolution(50mM)、GTP Solution(50mM)、CTP Solution(50mM)、UTP Solution(50mM)各2μL，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μL，T7 RNA Polymerase(50U/μl)2μL，RNase free dH2O 6.5μL，DNA(50ng/μL)1μL，总体系为20μL。将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应2h。转录完成后，向其加入20U/20μl反应液的RNase free DNaseI，混匀，37℃反应30min。使用RNA纯合试剂盒按照说明书操作进行提取RNA。数字PCR仪定量提取的SARS-CoV-2RNA，用RNase free dH2O将其依次稀释到实验所需要的浓度，-80℃保存备用。合成序列结果如图1所示。
实施例2
针对不同突变设计如下引物对和探针序列，并委托通用生物系统(安微)有限公司合成并纯化。
Figure BDA0003687674030000161
Figure BDA0003687674030000171
实施例3
应用实施例2合成得到的引物对和探针，按照以下RT-PCR条件方法，对实施例1得到的不同突变进行鉴定：
反应体系为(60μL)：2×One Step RT-PCR BufferⅢ为30μL，TaKaRa Ex Taq HS为1.2μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ为1.2μL，SARS-CoV-2上下引物、野生型和突变型探针、RP-F/RP-R、RP-P探针按表1浓度配置，模板为25μL，加无DNA/RNA酶水补充至60μL。反应程序为：42℃20min，95℃2min，95℃10s，55℃30s，45个循环，每个循环退火时收集荧光信号。利用野生株基因和上述构建的突变基因片段验证RT-PCR鉴定SARS-CoV-2变异位点的能力，发现该方法除了T478K-PW探针与突变型基因有交叉，其他探针均可准确区分出野生型和突变型，且内参基因RP均有典型的扩增曲线(图2)，表明该方法可用于鉴别SARS-CoV-2野生型和突变型基因。
实施例4
对鉴别T478K的探针进行锁核酸修饰，而后重复实施例3优化后的RT-PCR方案，修饰后探针序列如下：
Figure BDA0003687674030000181
注：“+”前面的碱基为LNA碱基。
利用野生株基因和上述构建的突变基因片段验证LNA-MGB探针RT-PCR鉴定SARS-CoV-2变异位点的能力，发现与T478K-PW探针相比，T478K-PWL探针可准确区分出野生型和突变型，无交叉反应，且内参基因RP均有典型的扩增曲线(图3)，修饰前曲线symbol为O形，修饰后曲线symbol为X型，表明该方法比MGB探针具有更强的鉴别SARS-CoV-2野生型和突变型基因的能力。
效果例1
采用如下方法对本发明提供的引物对和探针的特异性进行检测：
将中国食品药品检定研究院提供的人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、禽流感H7N9、H5N1、乙型流感、甲型流感H1N1(2009)、H3N2、EB病毒(EBV)、人类副流感病毒(HPIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、嗜肺军团杆菌(LP)、肺炎克雷伯菌(KP)、肺炎链球菌(SP)、流感嗜血杆菌(HI)、腺病毒(ADV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、百日咳杆菌(BP)以及健康人咽拭子提取的核酸作为模板，同时以无DNA/RNA酶水作为阴性对照，利用优化好的反应体系和条件进行RT-PCR扩增，评估该方法的特异性。结果如图4显示，只有阳性对照出现扩增曲线，22种阴性参考品和阴性对照均无扩增曲线，表明所建立的方法具有较强的特异性。
效果例2
以1×108拷贝/mL～1×103拷贝/mL、2×102拷贝/mL RNA为模板，以无DNA/RNA酶水为阴性对照，利用优化后的RT-PCR进行扩增，确定其敏感性。结果显示，建立的RT-PCR方法对目的RNA的最低检出限均为2×102拷贝/mL(图5)，A～J分别对应501Y，HV69-70del，417N，484K，417T，1176F，452R，478K，655Y，679K+681H突变型扩增曲线，每个图中扩增曲线由左至右分别为1×108拷贝/mL、1×107拷贝/mL、1×106拷贝/mL、1×105拷贝/mL、1×104拷贝/mL、1×103拷贝/mL和2×102拷贝/mL，表明本研究所建立方法的敏感性较高。
效果例3
对NCCL提供的5份样本按照本研究建立的实验体系进行盲测，验证该方法的可靠性。在NCCL的5份样本中，检出3份Delta阳性，1份野生型，1份阴性，均与NCCL反馈的结果一致，表明本实验体系具备鉴别SARS-CoV-2变异株的能力。NCCL反馈的结果如下：
Figure BDA0003687674030000191
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 实时荧光PCR鉴别新型冠状病毒变异株的方法
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别N501Y-PW探针
<400> 1
caacccacta atggtg 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别N501Y-PM探针
<400> 2
caacccactt atggtg 16
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别HV69-70del-PW探针
<400> 3
ccatgctata catgtctctg gg 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别HV69-70del -PM探针
<400> 4
ttccatgcta tatctgggac c 21
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别E484K-PW探针
<400> 5
aaaccttcaa cacca 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别E484K-PM探针
<400> 6
aaacctttaa cacca 15
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别K417N-PW探针
<400> 7
cagcaatctt tccag 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别K417N-PM探针
<400> 8
cagcaatatt tccag 15
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别V1176F-PW探针
<400> 9
atgcttcagt tgtaaac 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别V1176F-PM探针
<400> 10
ttaatgcttc atttgta 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别L452R-PW探针
<400> 11
ataattacct gtatagat 18
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别L452R-PM探针
<400> 12
taattaccgg tatagat 17
<210> 13
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别T478K-PW探针
<400> 13
cggtagcaca cctt 14
<210> 14
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别T478K-PM探针
<400> 14
cggtagcaaa cctt 14
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别H655Y-PW探针
<400> 15
tgttgacatg ttcag 15
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别H655Y-PM探针
<400> 16
gttgacatat tcagcc 16
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别N679K/P681H-PW探针
<400> 17
ctaattctcc tcggc 15
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别N679K/P681H-PM探针
<400> 18
ctaaatctca tcggc 15
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别N501Y变异引物1
<400> 19
gttactttcc tttacaatca tatggt 26
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别N501Y变异引物2
<400> 20
caaaagaaag tactactact ctgtatggt 29
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别HV69-70del变异引物1
<400> 21
tcttaccttt cttttccaat gttac 25
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别HV69-70del变异引物2
<400> 22
tcattaaatg gtaggacagg gtt 23
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别E484K变异引物1
<400> 23
ccggtarcac accttgta 18
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别E484K变异引物2
<400> 24
ccatatgatt gtaaaggaaa gt 22
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别K417N变异引物1
<400> 25
gtcagacaaa tcgctcca 18
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别K417N变异引物2
<400> 26
gcctgtaaaa tcatctggta 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别V1176F变异引物1
<400> 27
tcaccagatg ttgatttagg 20
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别V1176F变异引物2
<400> 28
tgaggcggtc aatttctt 18
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别L452R变异引物1
<400> 29
cttgattcta aggttggtgg ta 22
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别L452R变异引物2
<400> 30
aggtttgaga ttagacttcc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 兼备T478K变异引物1
<400> 31
ttcaactgaa atctatcagg c 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别T478K变异引物2
<400> 32
caattaaaac cttbaacacc a 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别H655Y变异引物1
<400> 33
ggcgtgttta ttctacaggt t 21
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别H655Y变异引物2
<400> 34
gcgcatatac ctgcacca 18
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别N679K或P681H变异引物1
<400> 35
acccattggt gcaggtatat 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴别N679K或P681H变异
<400> 36
caagtgacat agtgtaggca a 21
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RP引物1
<400> 37
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RP引物2
<400> 38
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RP探针
<400> 39
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 40
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>锁核酸修饰
<222>（7）...（9）
<223> 鉴别T478K-PWL修饰探针
<400> 40
cggtagcacacc 12
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7启动子序列
<400> 41
taatacgact cactata 17

Claims (10)

1.用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的核苷酸探针组，其特征在于：
所述核苷酸探针组包括阻断SARS-CoV-2靶基因片段野生株扩增的第一核苷酸探针和阻断SARS-CoV-2靶基因片段变异型扩增的第二核苷酸探针；
所述第一核苷酸探针的核苷酸序列与野生型靶基因片段完全匹配，与变异型靶基因片段在变异位置处发生错配，所述第二核苷酸探针的核苷酸序列与变异型靶基因片段完全匹配，与野生型靶基因片段在变异位置处发生错配；
所述第一核苷酸探针和第二核苷酸探针具有相同的核苷酸序列通式：(Xm)N(Xn)，其中N为变异位置的互补碱基，Xm、Xn分别表示数量为m、n的碱基序列，m、n为5～12范围内的整数。
2.根据权利要求1所述的核苷酸探针组，其特征在于，所述核苷酸探针在变异位置及其两侧1～12bp范围内，至少有1～4个核苷酸经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性，优选地，所述修饰为锁核酸修饰；所述核苷酸探针的3’末端经过修饰以淬灭荧光基团、增加探针的Tm值或阻断探针在扩增过程中延伸，优选地，所述修饰为BHQ1、BHQ2或MGB修饰。
3.根据权利要求1所述的核苷酸探针组，其特征在于，第一核苷酸探针和第二核苷酸探针的5’端带有不同的荧光标记，所述荧光标记选自HEX、FAM、CY5、ROX、Texas Red-X、CY3、JOE或TET。
4.根据权利要求1～3任一项所述的核苷酸探针组，其特征在于，所述SARS-CoV-2靶基因片段变异株包括Alpha、Beta、Gamma、Delta或Omicron。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸探针组，其特征在于，所述Alpha的突变类型包括N501Y或HV69-70del；所述Beta的突变类型包括E484K或K417N；所述Gamma的突变类型包括K417T或V1176F；所述Delta的突变类型包括L452R或T478K；所述Omicron的突变类型包括H655Y、N679K或P681H；
优选地，用于鉴别N501Y变异的探针组包括探针1和探针2；所述探针1的核苷酸序列为CAACCCACTAATGGTG，所述探针2的核苷酸序列为CAACCCACTTATGGTG；
优选地，用于鉴别HV69-70del变异的探针组包括探针3和探针4；所述探针3的核苷酸序列为CCATGCTATACATGTCTCTGGG，所述探针4的核苷酸序列为TTCCATGCTATATCTGGGACC；
优选地，用于鉴别E484K变异的探针组包括探针5和探针6；所述探针5的核苷酸序列为AAACCTTCAACACCA，所述探针6的核苷酸序列为AAACCTTTAACACCA；
优选地，用于鉴别K417N变异的探针组包括探针7和探针8；所述探针7的核苷酸序列为CAGCAATCTTTCCAG，所述探针8的核苷酸序列为CAGCAATATTTCCAG；
优选地，用于鉴别V1176F变异的探针组包括探针9和探针10；所述探针9的核苷酸序列为ATGCTTCAGTTGTAAAC，所述探针10的核苷酸序列为TTAATGCTTCATTTGTA；
优选地，用于鉴别L452R变异的探针组包括探针11和探针12；所述探针11的核苷酸序列为ATAATTACCTGTATAGAT，所述探针12的核苷酸序列为TAATTACCGGTATAGAT；
优选地，用于鉴别T478K变异的探针组包括探针13和探针14；所述探针13的核苷酸序列为CGGTAGCACACCTT，所述探针14的核苷酸序列为CGGTAGCAAACCTT；
优选地，用于鉴别H655Y变异的探针组包括探针15和探针16；所述探针15的核苷酸序列为TGTTGACATGTTCAG，所述探针16的核苷酸序列为GTTGACATATTCAGCC；
优选地，用于鉴别N679K或P681H变异的探针组包括探针17和探针18；所述探针17的核苷酸序列为CTAATTCTCCTCGGC，所述探针18的核苷酸序列为CTAAATCTCATCGGC。
6.一种用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述试剂和/或试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的核苷酸探针组中的至少一种、其他扩增试剂和/或扩增耗材；
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N501Y变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针1和探针2；
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别HV69-70del变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针3和探针4；
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别E484K变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针5和探针6；
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别K417N变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针7和探针8；
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别V1176F变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针9和探针10；
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别L452R变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针11和探针12；
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别T478K变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针13和探针14；
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别H655Y变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针15和探针16；
优选地，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N679K或P681H变异，所述试剂和/或试剂盒包括探针17和探针18；
优选地，所述探针与所述其他扩增试剂以单独包装的形式提供，或者所述探针与所述其他扩增试剂以混合的单一试剂的形式提供；
优选地，所述其他扩增试剂包括引物对、逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs和无菌水；进一步可选地，所述其他扩增试剂为多种时，以单独包装的方式提供，或者所述其他扩增试剂中的至少两种以混合的单一试剂的形式提供；
优选地，所述试剂和/或试剂盒包括引物Mix、探针Mix、缓冲液和RT-PCR酶；
优选地，所述引物对由用于扩增包含所述变异型靶基因片段的变异位置的上游引物和下游引物组成，所述引物对与所述核苷酸探针在与靶基因片段结合的结合位点上无重叠或者部分重叠；进一步可选地，所述上游引物和所述下游引物的摩尔比为1：1～5，优选为1：1。
7.根据权利要求6所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N501Y变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：GTTACTTTCCTTTACAATCATATGGT和CAAAAGAAAGTACTACTACTCTGTATGGT；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别HV69-70del变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTAC和TCATTAAATGGTAGGACAGGGTT；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别E484K变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：CCGGTARCACACCTTGTA和CCATATGATTGTAAAGGAAAGT；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别K417N变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：GTCAGACAAATCGCTCCA和GCCTGTAAAATCATCTGGTA；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别V1176F变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TCACCAGATGTTGATTTAGG和TGAGGCGGTCAATTTCTT；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别L452R变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：CTTGATTCTAAGGTTGGTGGTA和AGGTTTGAGATTAGACTTCC；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别T478K变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TTCAACTGAAATCTATCAGGC和CAATTAAAACCTTBAACACCA；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别H655Y变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：GGCGTGTTTATTCTACAGGTT和GCGCATATACCTGCACCA；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于鉴别N679K或P681H变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：ACCCATTGGTGCAGGTATAT和CAAGTGACATAGTGTAGGCAA；
优选地，所述试剂和/或试剂盒还包括RP引物对和RP探针，所述RP引物对的核苷酸序列分别如下所示：AGATTTGGACCTGCGAGCG和GAGCGGCTGTCTCCACAAGT，所述RP探针的核苷酸序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。
8.用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的混合反应体系，其特征在于，所述混合反应体系包括权利要求6或7所述试剂和待测样本；
优选地，所述待测样本为低拷贝数样本或低变异频率样本，优选地，所述低拷贝数为每毫升2×102～1×108个拷贝；
优选地，所述待测样本每毫升包括2×102个拷贝、1×103个拷贝、1×104个拷贝、1×105个拷贝、1×106个拷贝、1×107个拷贝或者1×108个拷贝。
9.非诊断目的的用于鉴别SARS-CoV-2靶基因片段变异株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)配制权利要求8所述混合反应体系；(2)进行RT-PCR反应，所述RT-PCR反应包括逆转录、变性、退火和延伸。
10.根据权利要求8所述的混合反应体系，或者根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待测样本为鼻咽拭子、痰或肺泡灌洗液。
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