CN101240338A - 检测基因突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了检测基因插入或缺失突变的方法，其包括以下步骤：将靶标核酸与野生型探针和突变型探针反应，检测结合到各个探针上的靶标核酸的量，和将结合到野生型探针上的靶标核酸的量与结合到突变型探针上的靶标核酸的量进行比较。

Description

检测基因突变的方法

发明背景

本发明涉及一种检测基因插入和缺失突变的方法。

近年来，检测遗传多态性的技术发展迅速。利用固定在底物上的探针的方法就是这些技术中的一种。在该方法中，通过与探针杂交来检测靶标核酸。

遗传多态性除单碱基置换之外，还包括插入突变、缺失突变等等。关于用上述方法检测单碱基置换的报道已有许多。然而，关于用上述方法检测插入突变和缺失突变的报道却几乎没有(参见，例如，Nat Genet.14，441-7，1996和Nucleic Acid Res.33e33，2005)。

当用探针检测插入突变或缺失突变的时候，探针与靶标核酸的杂交可能发生突变位点被环状突出，因而出现非特异杂交。这引起了突变不能被准确检测的问题。所以需要发展出一种检测方法，该方法使用固定化探针能够精确检测插入突变和缺失突变。

发明简述

本发明的一个目的是提供检测基因突变的方法，所述方法通过使用探针能精确检测插入突变和缺失突变。

根据本发明的一个方面，它提供了检测基因插入突变的方法，其包括步骤为：使靶标核酸与野生型探针和突变型探针反应，检测结合到各个探针上的靶标核酸的量，和将结合野生型探针的靶标核酸的量与结合突变型探针的靶标核酸的量相比较。

附图简述

图1A是插入突变型靶标核酸与探针反应的示意图。

图1B是当突变位于中心之外时，插入突变型靶标核酸与探针反应的示意图。

图2A是野生型靶标核酸与野生型探针反应的示意图。

图2B是插入突变型靶标核酸与野生型探针反应的示意图。

图2C是野生型靶标核酸与突变型探针反应的示意图。

图2D是插入突变型靶标核酸与突变型探针反应的示意图。

图3A是野生型靶标核酸与野生型探针反应的示意图。

图3B是缺失突变型靶标核酸与野生型探针反应的示意图。

图3C是野生型靶标核酸与突变型探针反应的示意图。

图3D是缺失突变型靶标核酸与突变型探针反应的示意图。

图4是显示LAMP方法中所用引物位置的示意图。

图5显示CYP2D6基因的序列。

图6是CYP2D6＊18与野生型探针之间反应的示意图。

图7是CYP2D6与突变型探针之间反应的示意图。

图8A显示用每一探针检测CYP2D6的结果。

图8B显示用每一探针检测CYP2D6＊18的结果。

发明详述

本发明提供了检测基因插入和缺失突变的方法。根据本发明，可以确定目的基因是否为野生型或者突变型。此处所用的术语“野生型”表示高频率出现的基因型，而此处所用的术语“突变型”表示低频率出现的基因型。在本文中，作为检测对象的核酸被称作靶标核酸。其序列与野生型靶标核酸互补的探针被称作野生型探针，而其序列与突变型靶标核酸互补的探针被称作突变型探针。

常规方法中所用的探针，其突变位置在探针中心附近。例如，在NatGenet.14，441-7，1996.中，使用了20个碱基的探针，并且有一个突变位点位于从该探针3’端起第九个碱基处。在Nucleic Acid Res.33e33，2005.中，使用了25个碱基的探针，有一个突变位点定位于从该探针3’端起的第十三个碱基处。

然而，当突变位点定位在探针中心附近时，不管靶标核酸中存在或不存在突变，所述探针都将结合靶标核酸。示意图显示在图1A中。图1A显示插入突变型靶标核酸21与野生型探针10之间的反应。因为它们的序列彼此不互补，突变型靶标核酸21原本是不会结合野生型探针10。然而，如图1A所示，靶标核酸21会结合探针10，而其插入突变位点被环状突出。其中，从探针10的一端到突变位点和从探针10的另一端到突变位点的链长是大致相等的，因而使得两侧都稳定结合。结果，尽管靶标核酸21是突变型，其仍结合野生型探针10导致测定错误。在靶标核酸有缺失突变的情况下，另一方面，野生型探针可以稳定结合其靶标核酸，同时对应于靶标突变位点的位点被环状突出。

由此推断如本发明所示，突变位点可以定位于探针中心的外侧以减少非特异的结合。如图1B所示，当突变定位在探针11中心外侧时，从探针一端到突变位点的区域将短于另一区域。因而，较短区域的结合将不稳定，从而让这段区域容易从靶标核酸22上分离开来。能够由此减少非特异的结合。根据本发明，通过使用突变位点位置适当的探针，能够提高检测准确性。

可以通过例如用解链温度(Tm)来确定适合的探针如下：

首先，对用于检测插入突变的探针进行描述。

用于检测插入突变的野生型探针在这样的情况下为合适的探针，即其中从探针一端到突变位点的序列Tm值比上从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶2或更多。此处所用的关于野生型探针的突变位点，意指对应于该突变存在于靶标核酸中的位点的位点。

野生型探针12的例子显示在图2A用于检测野生型靶标核酸61，和显示在图2B用于检测插入突变型靶标核酸23。从野生型探针12一端到突变位点的具有较低Tm值的区域称为L1，野生型探针12的另一个区域称为L2。优选在此方法中使用的探针具有的L1Tm值对L2Tm值的比率范围为从1∶2或更多。更优选L1对L2的Tm值的比率是1∶3或更多。从改进检测准确性而言，优选L1的Tm值对L2的Tm值的比率范围为从1∶15或更少。

用于检测插入突变的突变型探针在这样的情形下是理想的探针，即当插入的碱基数是3个或者更少时，其中从探针一端到突变位点的序列Tm值对从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比率是1∶2或者更多。突变型探针的例子显示在图2C和2D中。在图2C中，从突变型探针31一端到突变位点的具有较低Tm值的区域称为L3，突变型探针31的另一个区域称为L4。此外，探针的插入的区域称为L5。如图2C所示，当突变型探针31结合到野生型靶标核酸61时，突变型探针31的L3+L4区域结合到核酸61。因而，当插入的碱基数是3个或者更少，具有的L3Tm值对L4Tm值的比率范围为从1∶2或更多时，此方法中所用的探针为优选的探针。更优选的是，L3对L4的Tm值的比率是1∶3或者更多。从改进检测准确性而言，优选L3Tm值对L4Tm值的比率范围为从1∶15或者更低。

当突变位点到达突变型探针的一端时，L3不复存在。当插入碱基数较大的时候，例如当插入碱基数是4个或者更多时，L3+L4区域的长度将会较短。在这种情况下，L3+L4区域的Tm值会小到使结合不稳定，因而减少探针对靶标核酸的非特异结合。然而，当插入碱基数是3个或更少时，容易出现非特异结合；因此，当插入碱基数在3个或更少时，依照本发明的探针是有利的。

然后，对检测缺失突变的探针进行描述。

用于检测缺失突变的突变型探针在这样的情况下为合适的探针，即其中从探针一端到突变位点的序列Tm值对从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶2或者更多。此处所用的关于野生型探针的突变位点，意指对应于该突变存在于靶标核酸中的位点的位点。

用于检测缺失突变的突变型探针的例子显示在图3C和3D。在图3C和3D中，从突变型探针51的一端到突变位点的具有较低Tm值的区域称为L9，突变型探针51的另一个区域称为L10。优选在此方法中使用的引物L9的Tm值对L10的Tm值的比率范围为1∶2或者更多。更优选，L9对L10Tm值的比率是1∶3或者更多。从改进检测准确性而言，优选L9Tm值对L10Tm值的比率范围为1∶15或者更低。

用于检测缺失突变的野生型探针在这样的情形下是理想的探针，即当缺失的碱基数是3个或者更少时，其中从探针一端到突变位点的序列Tm值对从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶2或者更多。野生型探针13的例子显示在图3A用于检测野生型靶标核酸62，和显示在图3B用于检测缺失突变型靶标核酸41。在图3B中，野生型探针13一端到突变位点的具有较低Tm值的区域称为L6，野生型探针13的另一个区域称为L7。另外，探针的缺失的区域称为L8。当野生型探针13结合到如图3B所示的突变型靶标核酸41时，野生型探针13的L6+L7区域结合到核酸41。因而此方法中所用的探针在此情况下为优选的探针，即当缺失的碱基数是3个或者更少时，具有的L6的Tm值对L7的Tm值的比率范围为1∶2或者更多。更优选，L6对L7Tm值的比率是1∶3或者更多。从改进检测准确性而言，优选L6Tm值对L7Tm值的比率范围为1∶15或者更低。

当突变位点达到野生型探针的一端时，同上述插入突变的情况一样，L6不复存在。当缺失碱基数较大的时候，例如当缺失碱基数是4个或者更多时，L6+L7区域的长度将会非常短。在这种情况下，L6+L7区域的Tm值会小到使结合不稳定，因而减少探针对靶标核酸的非特异结合。然而，当缺失碱基数在3个或更少时，非特异结合会容易出现；因此，当缺失碱基数在3个或更少时，依照本发明的探针是有利的。

为了在检测中使用，总体上野生型探针的Tm值优选几乎等于突变型探针的Tm值。其Tm值的差异优选在10℃之内。

可以通过任何已知的方法计算Tm值。优选使用适合处理短碱基序列的Wallace法(参见Nucleic Acid Res.6，3543-3557，1979)。在Wallace法中，Tm值是基于这样的假设而计算的，所述假设为鸟嘌呤或胞嘧啶的键合力是4℃，腺嘌呤或胸腺嘧啶的键合力是2℃。也能够使用毗邻碱基对法和GC％法作为其它方法。

在根据本发明的突变检测方法中，上述探针是被固定化在支持体上。野生型探针和突变型探针优选固定在相同的支持体上。首先，将含有靶标核酸的样本溶液与固定化的野生型和突变型探针分别反应。然后，检测结合到每个探针上的靶标核酸的量。接着，将结合到野生型探针上的靶标核酸的量与结合到突变型探针上的靶标核酸的量相比较。当结合到突变型探针上靶标核酸的量更多些时，可确定靶标核酸的基因型是突变型。另一方面，当结合到野生型探针上靶标核酸的量更多些时，便可确定靶标核酸的基因型是野生型。通过以此方式比较检测结果，就能够检测出靶标核酸的突变。

<核酸>

本说明书中所用的术语“核酸”旨在包括DNA、RNA、PNA、S-寡核苷酸(S-oligo)和甲基膦酸酯寡核苷酸(methyl phosphonate oligo)(部分的结构能够用碱基序列表示)的这类物质。

<靶标核酸>

本发明中的靶标核酸可以是自然存在的核酸或者人工合成的核酸类似物。自然存在的核酸包括个体的基因组DNA、基因组RNA和mRNA。所述个体包括，但不仅限于，人、非人的动物、植物、病毒和例如细菌、酵母和支原体这些微生物。

这些核酸提取自从个体收集而来的样本，例如血液、血清、白细胞、尿液、粪便、精液、唾液、组织、活组织检查、口黏膜、培养的细胞、咳出的痰液等等。或者，所述核酸直接提取自微生物。可以通过使用例如商业的核酸提取试剂盒QIAamp(QIAGEN)或者SMITEST(SumitomoMetal Industries，Ltd.)来实现核酸的提取。

含有提取自个体样本或微生物的核酸的溶液被称作样本溶液。样本溶液可能经过比如扩增和纯化的任何处理。将处理过的样本溶液用于本发明的检测方法。

提取的核酸将优选用已知的扩增技术进行扩增。扩增方法的实例包括但不仅限于，多聚酶链式反应(PCR)、环状结构介导的(loop mediated)等温扩增技术(LAMP法)、等温嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN法)、基于核酸序列的扩增方法(NASBA法)、链置换扩增(SDA法)和连接酶链式反应(LCR法)以及滚环扩增法(RCA法)。通过特定扩增需要检测的区域，从而限定核酸的检测区域。通过这样做甚至在仅用探针不能达到特异性时使检测可行。

为了有效结合探针，靶标核酸或扩增产物将处理为单链。使得核酸变为单链的方法的实例包括，但不仅限于，使用珠子或者酶的方法和用T7RNA聚合酶进行转录反应的方法。由LAMP法或ICAN法扩增且不需要是单链的扩增产物的样本被直接用于下一步。

优选扩增的靶标核酸具有茎环结构，因为使其变为单链的步骤是不需要的。具有茎环结构的扩增产物在与探针的杂交中是有利的。

LAMP法(参见，例如，日本专利号3313358)优选用于靶标核酸的扩增。LAMP法是提供具有茎环结构的扩增产物的简单方法。LAMP法的原则简述于图4的示意图里。在LAMP法中，使用了识别靶标核酸的6个区的4个引物和链置换型DNA合成酶。在等温条件下(60至65℃)扩增靶标核酸。6个区按照从靶标核酸5’端起的次序叫做F3区、F2区和F1区，按照从靶标核酸3’端起的次序叫做B3c区、B2c区和B1c区。图4中分别显示了4个引物的序列。F1c、F2c、F3c、B1、B2和B3区在链上分别与F1、F2、F3、B1c、B2c和B3c区互补。在LAMP法的扩增产物中，形成环状结构，并且F2和F1之间以及B2和B1之间的区域都是单链区域。因此，探针通过利用这个区域的序列能容易的检测靶标核酸(参见，例如，Jpn.Pat.Appln.KOKAI Publication No.2005-143492)。反应时间为30到60分钟，因此靶标核酸可以被快速扩增。

<反应条件>

该结合反应，即靶标核酸和探针之间的杂交在适当条件下进行。适合的条件依据在靶标核酸中含有的碱基类型、靶标核酸的结构和探针的类型而变化。例如通过离子强度在0.01到5的范围之间变动和pH值在5到10的范围之间变动的缓冲溶液可以获得合适的条件。

可以向反应溶液中加入任意的添加剂。添加剂的实例包括例如，象右旋糖酐硫酸盐、鲑精DNA、小牛胸腺DNA、EDTA和表面活性剂这样的杂交催化剂。反应温度优选在10到90℃的范围之内。通过搅动或者摇动可以增进反应效率。具有离子强度在0.01到5的范围之间变动和pH值在5到10的范围之间变动的缓冲溶液可以用于反应后的洗涤。

<探针>

探针的链长，尽管并非限制，优选在5到50个碱基的范围内，更优选在10到40个碱基的范围内，还要更优选在15到35个碱基的范围内。

探针可以是未修饰的，或者可以是以了在支持物上固定的反应的功能团，如氨基、羧基、羟基、硫醇基和砜基，或者以例如抗生物素蛋白和生物素这些物质修饰的。

固定探针的支持物可以用硝化纤维素膜、尼龙膜、微量滴定板、玻璃、电极、磁体、珠子、塑料、胶乳、合成树脂、天然树脂或者光纤制成。

在其上固定有探针的支持物可以是DNA芯片。所述DNA芯片是指将探针以高密度固定在诸如玻璃和硅等物质上的芯片。该DNA芯片能同时检测多种基因的序列信息。

<检测方法>

一般来说，通过荧光检测法检测杂交产生的双链核酸。在此方法中，基因先用荧光标记然后用高敏感的荧光分析仪检测。此外，还有一种通过电化学原理检测双链核酸的方法。在这种方法中，将探针固定在电极上。双链核酸用电化学法来检测，所述方法用电化学活性嵌合剂与双链核酸特异性的反应(参见，例如，Jpn.Pat.Appln.KOKAI PublicationNo.10-146183)。当前检测类型的DNA芯片既不需要标记也不需要荧光检测中所用的大而昂贵的检测器。因而，此方法能够作为简单和便宜的方法而合适使用。

在下文中，将对检测方法的具体实例进行详细描述。

1.荧光检测系统

将靶标核酸用诸如荧光染料的荧光活性物质标记。荧光染料包括但不限于Cy3、Cy5、FITC和若丹明。或者，也可以使用以这些物质标记的二级探针标记靶标核酸。取决于标记类型用合适的检测器来检测荧光标记的靶标核酸。

2.通用检测系统

通过结合嵌入剂到双链核酸上以对其进行检测，所述双链核酸由靶标核酸和固定在电极上的探针组成。

此处所用的电极可以产生于，但不限于，诸如金、金合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓、钨及其合金的金属元素，或者诸如石墨和玻璃碳(glassy carbon)的碳，或其氧化物和化合物。

使用电化学活性物质作为嵌入剂。这种物质包括但不限于，Hoechst33258、吖啶橙、奎纳克林、道诺霉素、金属嵌入剂、双嵌入剂如双吖啶、三嵌入剂和多嵌入剂。这些嵌入剂可以用电化学活性金属复合物如二茂铁和viologen所修饰。

通过应用高于使嵌入剂能发生电化学反应的电势，能够测定由该嵌入剂衍生的反应电流值。在这样的情况下，电势在恒定速率或脉冲方式下扫描，或者可以应用恒定电压。在测量过程中，可以通过诸如稳压器、数字万用电表和函数发生器的设备来控制电流和电压。

从发明的另一方面而言，其提供了在本发明的方法中所用的野生型和突变型的探针。也提供了具有固定在其上的探针的探针固定化支持物。所述探针固定化支持物优选作为DNA芯片提供。在本发明的又一方面而言，其提供了用于在本发明检测方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含如前面所定义的野生型探针和/或突变型探针。优选的，该试剂盒还包含用于靶标核酸扩增的LAMP法中所用的引物。该试剂盒可以包含链置换型DNA合成酶、合成的底物和缓冲溶液。

实施例

对通过本发明的方法检测的具体实施例进行详细描述。使用CYP2D6＊18作为靶标基因，该CYP2D6＊18在人基因CYP2D6中有9个碱基的基因插入突变。CYP2D6基因的部分序列显示在图5中。通过PCR从杂合的样本中扩增出5.3kbp的CYP2D6基因片段，所述杂合的样本由野生型CYP2D6和插入9个碱基的突变型CYP2D6＊18组成。将此PCR产物引入pCR2.1质粒载体。通过克隆分别得到含有野生型CYP2D6或插入9个碱基的突变型CYP2D6＊18的质粒。分别使用各个质粒作为模板进行LAMP扩增。将此LAMP产物与固定在电极上的探针反应。其后，对结合到探针上的产物进行电化学检测。

(1)靶标核酸的扩增

[引物]

合成LAMP法中所用的引物。它们的序列如下所示。图5显示了引物序列在靶标核酸上对应的位置。对于F1c区，使用图5中显示序列的反义链。对于B2和B3区，使用图5中显示序列的反义链。

2D6＊18F3引物：GCCCGCATGGAGCTC

2D6＊18FIP引物：GGAAAGCAAAGACACCATGGT  (F1c)-CCTCTTCTTCACCTCCCTGC(F2)

2D6＊18B3引物：CCACATTGCTTTATTGTACATTAG

2D6＊18BIP  引物：TGAGCTTTGTGCTGTGCC  (B1c)-TCTGGCTAGGGAGCAGG(B2)

FIP引物含有F1c部分和F2部分。BIP引物含有B1c部分和B2部分。在两部分间可以有或者没有插入的任意序列。

[反应溶液]

LAMP法的反应溶液具有如下成分：

灭菌的超纯水      5.5μL

Bst DNA多聚酶     1μL

缓冲液            12.5μL

Tris·HCl，pH8.0  40mM

KCl               20mM

MgSO₄             16mM

(NH4)₂SO₄         20mM

吐温20            0.2％

甜菜碱            1.6M

dNTP              2.8mM

F3引物(10μM)     0.5μL

B3引物(10μM)     0.5μL

FIP引物(20μM)    2μL

BIP引物(20μM)    2μL

质粒模板(3pg/μl) 1μL

总量              25μL

[扩增反应]

核酸用LAMP法在63℃下扩增1小时。灭菌水代替模板作为一个阴性对照。LAMP的扩增产物用琼脂糖胶电泳验证。结果，出现一个LAMP产物典型的梯形图案。在阴性对照中观察不到扩增。这些结果说明CYP2D6能通过使用以上的引物对进行专一扩增。

(2)构建探针固定化电极

[探针]

在本实施例中，分别使用了5个针对野生型检测的探针和5个针对插入突变检测的探针。为了检测正链靶标核酸，探针是负链。使用负探针用作阴性对照，所述负探针具有与CYP2D6基因序列不相关的序列。为了固定在金电极上，上述的11个探针的3’末端均以硫醇修饰。

图6显示在野生型探针1到5和突变型靶标核酸之间的反应示意图。

-野生型探针1由18个碱基组成。可能的插入突变位点在靶标核酸上位于从5’末端开始的第八个碱基。从3’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T1)是34℃，从5’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T2)是28℃，所述Tm值由Wallace法确定。

-野生型探针2由18个碱基组成。可能的插入突变位点在靶标核酸上位于从5’末端开始的第六个碱基。从3’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T3)是42℃，从5’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T4)是20℃。

-野生型探针3由19个碱基组成。可能的插入突变位点在靶标核酸上位于从5’末端开始的第五个碱基。从3’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T5)是48℃，从5’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T6)是16℃。

-野生型探针4由20个碱基组成。可能的插入突变位点在靶标核酸上位于从5’末端开始的第三个碱基。从3’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T7)是56℃，从5’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T8)是10℃。

-野生型探针5由20个碱基组成。可能的插入突变位点在靶标核酸上位于从5’末端开始的第一个碱基。从3’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T9)是62℃，从5’端到突变位点的寡DNA链Tm值(T10)是4℃。

对于野生型探针1，从探针5’端到突变位点的序列Tm值对从探针3’端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶1.2；对于野生型探针2是1∶2.1；对于野生型探针3是1∶3.0；对于野生型探针4是1∶5.6；且对于野生型探针5是1∶15.5。

图7显示了野生型探针1到5与野生型靶标核酸之间反应的示意图。所有野生型探针1到5的突变位点都位于5’端一侧。

-突变型探针1由19个碱基组成。插入突变位点在离5’端从第一个到第九个碱基的区域内。

-突变型探针2由17个碱基组成。插入突变位点在离5’端从第一个到第五个碱基的区域内。

-突变型探针3由18个碱基组成。插入突变位点在离5’端从第一个到第四个碱基的区域内。

-突变型探针4由20个碱基组成。插入突变位点在离5’端从第一个到第三个碱基的区域内。

-突变型探针5由21个碱基组成。插入突变位点在离5’端从第一个到第二个碱基的区域内。

各个探针的序列显示如下：

负探针：5′-GTGCTGCAGGTGCG-3′

野生型探针1：5′-GGGCTGTCCAGTGGGCAC-3′

野生型探针2：5′-GCTGTCCAGTGGGCACCG-3′

野生型探针3：5′-CTGTCCAGTGGGCACCGAG-3′

野生型4：5′-GTCCAGTGGGCACCGAGAAG-3′

野生型探针5：5′-CCAGTGGGCACCGAGAAGCT-3′

突变型探针1：5′-CAGTGGGCACAGTGGGCAC-3′

突变型探针2：5′-GGGCACAGTGGGCACCG-3′

突变型探针3：5′-GGCACAGTGGGCACCGAG-3′

突变型探针4：5′-GCACAGTGGGCACCGAGAAG-3′

突变型探针5：5′-CACAGTGGGCACCGAGAAGCT-3′

[探针固定化电极]

上述探针经由硫醇和金之间的强共价键固定在金电极上。将含有末端用硫醇修饰的探针的溶液点在金电极上并在25℃留置1小时。接着，将电极浸泡在1mM巯基己醇中然后用0.2×SSC溶液清洗。将每个探针点在两个电极上。电极与各个探针的对应显示在下面。在清洗之后，将电极用超纯水洗并且进行空气干燥以得到探针固定化电极。

[电极安排]

电极1，2：负探针

电极3，4：野生型探针1

电极5，6：突变型探针1

电极7，8：野生型探针2

电极9，10：突变型探针2

电极11，12：野生型探针3

电极13，14：突变型探针3

电极15，16：野生型探针4

电极17，18：突变型探针4

电极19，20：野生型探针5

电极21，22：突变型探针5

(3)杂交

将如上所述准备好的探针固定化电极浸泡在含LAMP产物和2×SSC盐的溶液中，然后留置在55℃杂交20分钟。接着将探针固定化电极在0.2×SSC溶液中于48℃浸泡20分钟并且洗涤。接着将探针固定化电极在磷酸盐缓冲液中浸泡10分钟，该磷酸盐缓冲液含50μM Hoechst 33258作为嵌入剂。然后测量Hoechst 33258的氧化电流响应。

(4)结果

图8A显示用野生型探针1到5和突变型探针1到5检测野生型靶标核酸的结果。照例，靶标核酸用野生型探针1到5来检测。另一方面，用突变型探针1到3几乎没有检测到信号，但是用突变型探针4检测到微弱的信号，并且用突变型探针5检测到强信号。因此，当突变由4个或者更多的碱基组成时，观察不到非特异的结合，但是当突变由3个或者更少的碱基组成时，将观察到非特异的结合。然而，当所述突变型探针其中插入碱基数为三个或更少时，以及当在靶标核酸上从探针一端到突变位点的序列Tm值对从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶2或更多(突变型探针4和突变型探针5)的时候，有显示通过使用突变型探针能抑制非特异结合。

图8B显示检测插入突变型靶标核酸的结果。照例，靶标核酸用突变型探针1到5来检测。另一方面，通过插入突变位点位于几乎探针中央的突变型探针1(Tm比值1∶1.2)检测到强的信号。在野生型探针1和突变型探针1之间信号方面没有可识别的区别，因而说明存在许多非特异结合。

插入突变位点稍接近末端位置的野生型探针2(Tm比值1∶2.1)与突变型探针2存在差异，则可以将突变检测出来。野生型探针3(Tm比值1∶3.0)和野生型探针4(Tm比值1∶5.6)的突变位点更为接近末端位置，其与突变型探针3和4有重大差异。野生型探针5的突变位点置于末端位置，与突变型探针5(Tm比值1∶15.5)也有差别。

因而，其显示出当突变位点位于探针中心之外时，能够消除非特异信号。明确的，有事实表明，当野生型探针在靶标核酸上从探针一端到突变位点的序列Tm值对从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶2或更多的时候，能够消除野生型探针和突变型靶标核酸的非特异结合。

在上面的实施例中，进行了检测插入突变的实验，但很容易认识到关于缺失突变，有相反作用的探针将抑制非特异结合，因此确保能准确检测突变。

例如，缺失突变型靶标核酸和野生型探针的结合能够与野生型靶标核酸和用于插入突变的突变型探针的结合以同样的方式被理解。另外，野生型靶标核酸和用于缺失突变的突变型探针之间的结合也能与插入突变型靶标核酸和野生型探针之间的结合以同样的方式被理解。由此得出结论，检测缺失突变时，通过使用突变型探针和野生型探针将减少非特异结合和准确的检测缺失突变，所述突变型探针其从探针一端到突变位点的序列Tm值对从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶2或更多，且当缺失碱基数为三个或更少时，所述野生型探针其从探针一端到突变位点的序列Tm值对从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶2或更多。

对于本领域技术人员，将很容易想到附加的有利条件和修改。因此，从更广阔的方面而言，本发明不限于此处所述的具体的细节和典型的实施方案。因此，可以进行多方面的修改而不背离所附权利要求及其等效物所定义的一般发明概念的精神或范围。

序列表

<110>株式会社  东芝

<120>检测基因突变的方法

<130>07S0978

<140>

<141>

<150>JP 2007-031318

<151>2007-02-09

<160>31

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>F3引物

<400>1

gcccgcatgg agctc                     15

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>FIP引物(F1c)

<400>2

ggaaagcaaa gacaccatgg t              21

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>FIP引物(F2)

<400>3

cctcttcttc acctccctgc             20

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>B3引物

<400>4

ccacattgct ttattgtaca ttag        24

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>BIP引物(B1c)

<400>5

tgagctttgt gctgtgcc               18

<210>6

<21>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>BIP引物(B2)

<400>6

tctggctagg gagcagg                17

<210>7

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>负探针

<400>7

gtgctgcagg tgcg                   14

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>野生型探针-1

<400>8

gggctgtcca gtgggcac             18

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型探针-1

<400>9

cagtgggcac agtgggcac           19

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>野生型探针-2

<400>10

gctgtccagt gggcaccg            18

<210>11

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型探针-2

<400>11

gggcacagtg ggcaccg             17

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>野生型探针-3

<400>12

ctgtccagtg ggcaccgag               19

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型探针-3

<400>13

ggcacagt gg gcaccgag              18

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>野生型探针-4

<400>14

gtccagtggg caccgagaag             20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型探针-4

<400>15

gcacagtggg caccgagaag             20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>野生型探针-5

<400>16

ccagtgggca ccgagaagct               20

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型探针-5

<400>17

cacagtgggc accgagaagc t             21

<210>18

<211>260

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<223>野生型CYP2D6

<400>18

gccgtgcatg cctcggggag cccctggccc gcatggagct cttcctcttc ttcacctccc     60

tgctgcagca cttcagcttc tcggtgccca ctggacagcc ccggcccagc caccatggtg    120

tctttgcttt cctggtgagc ccatccccct atgagctttg tgctgtgccc cgctagaatg    180

gggtacctag tccccagcct gctccctagc cagaggctct aatgtacaat aaagcaatgt    240

ggtagttcca actcgggtcc                                                260

<210>19

<211>269

<212>DNA

<213>智人

<220>

<223>突变型CYP2D6

<400>19

gccgtgcatg cctcggggag cccctggccc gcatggagct cttcctcttc ttcacctccc     60

tgctgcagca cttcagcttc tcggtgccca ctgtgcccac tggacagccc cggcccagcc    120

accatggtgt ctttgctttc ctggtgagcc catcccccta tgagctttgt gctgtgcccc    180

gctagaatgg ggtacctagt ccccagcctg ctccctagcc agaggctcta atgtacaata  240

aagcaatgtg gtagttccaa ctcgggtcc                                    269

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>智人

<220>

<223>突变型靶标序列

<400>20

cagcttctcg gtgcccactg tgcccactgg acagccccgg  40

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>智人

<220>

<223>野生型-1探针

<400>21

gggctgtcca gtgggcac                          18

<210>22

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>野生型-2探针

<400>22

gctgtccagt gggcaccg                          18

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>野生型-3探针

<400>23

ctgtccagtg ggcaccgag                         19

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>野生型-4探针

<400>24

gtccagtggg caccgagaag                             20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>野生型-5探针

<400>25

ccagtgggca ccgagaagct                             20

<210>26

<211>31

<212>DNA

<213>智人

<220>

<223>野生型靶标序列

<400>26

cagcttctcg gtgcccactg gacagccccg g                31

<210>27

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型-1探针

<400>27

cagtgggcac agtgggcac                              19

<210>28

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型-2探针

<400>28

gggcacagtg ggcaccg            17

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型-3探针

<400>29

ggcacagtgg gcaccgag           18

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型-4探针

<400>30

gcacagtggg caccgagaag         20

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>突变型-5探针

<400>31

cacagtgggc accgagaagc t       21

Claims (14)

1.检测基因插入突变的方法，其包括步骤：

使靶标核酸与野生型探针和突变型探针反应，

检测结合到所述各个探针上的靶标核酸的量，和

将结合到野生型探针上的靶标核酸的量与结合到突变型探针上的靶标核酸的量进行比较，

其表征为，野生型探针与野生型靶标核酸的序列具有序列互补性，并且从探针一端到突变位点的序列Tm值对从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶2或更多。

2.根据权利要求1的方法，其表征为，突变型探针与突变型靶标核酸的序列具有序列互补性，并且当插入碱基数为三个或更少时，从探针一端到插入碱基的序列Tm值对从探针另一端到插入碱基的序列Tm值的比值是1∶2或更多。

3.根据权利要求1的方法，其表征为，靶标核酸具有茎环结构，并且如果靶标核酸有突变，该突变位于环状结构部分。

4.根据权利要求3的方法，其表征为，靶标核酸是通过LAMP法扩增的产物。

5.根据权利要求1的方法，其表征为，野生型探针和突变型探针的Tm值之间的差别为10℃或更小。

6.根据权利要求1的方法，其表征为，探针被固定在支持物上。

7.根据权利要求1的方法，其表征为，用电化学活性的核酸识别体检测与探针结合的靶标核酸。

8.检测基因缺失突变的方法，其包括步骤：

使靶标核酸与野生型探针和突变型探针反应，

检测与各个探针结合的靶标核酸的量，和

将结合到野生型探针上的靶标核酸的量与结合到突变型探针上的靶标核酸的量进行比较，

其表征为，突变型探针与突变型靶标核酸的序列具有序列互补性，并且从探针一端到缺失碱基的序列Tm值对从探针另一端到缺失碱基的序列Tm值的比值是1∶2或更多。

9.根据权利要求8的方法，其表征为，野生型探针与野生型靶标核酸的序列具有序列互补性，并且当缺失的碱基数为三个或更少时，从探针一端到突变位点的序列Tm值对从探针另一端到突变位点的序列Tm值的比值是1∶2或更多。

10.根据权利要求8的方法，其表征为，靶标核酸具有茎环结构，并且如果靶标核酸有突变，该突变位于环状结构部分。

11.根据权利要求10的方法，其表征为，靶标核酸是通过LAMP法扩增的产物。

12.根据权利要求8的检测方法，其表征为，野生型探针和突变型探针的Tm值之间的差别为10℃或更小。

13.根据权利要求8的方法，其表征为，探针被固定在支持物上。

14.根据权利要求8的方法，其表征为，用电化学活性的核酸识别体检测与探针结合的靶标核酸。

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