CN109295179A

CN109295179A - 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒

Info

Publication number: CN109295179A
Application number: CN201811234326.5A
Authority: CN
Inventors: 张勇; 王悦; 徐小婷; 郝元峰; 何中虎
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109295179B

Abstract

本发明公开了一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒。该方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中基于AX‑89703298 SNP位点的基因型为GG纯合型还是TT纯合型，GG纯合型的小麦的微量元素含量高于TT纯合型的小麦的微量元素含量；所述“AX‑89703298 SNP位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5′末端起第33位核苷酸；所述微量元素为锌和/或铁。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒。

背景技术

小麦是世界主要粮食作物之一。在过去的50年育种工作中，产量、作物营养和健康品质改良成为重要研究方向。和其它谷物一样，小麦籽粒所含锌、铁等微量元素较低，提高小麦等主粮作物籽粒中锌铁等微量元素的含量已成为当下热门的研究课题。小麦籽粒锌、铁含量受基因型、环境及其互作的显著影响，其中环境效应最大，基因型效应次之，基因型和环境互作效应最小。因此，通过遗传改良来提高小麦籽粒中铁锌含量是可行的。通过分子标记技术发掘锌、铁性状相关基因位点并进行辅助选择可提高富锌、铁小麦新品种的选育效率。分子标记辅助育种实践中，常采用表型分析和基因标记鉴定相结合的方法。目前常用于基因型鉴定的分子标记有STS、SSR、SNP等，通量低、灵活性差，在育种应用中受到一定程度的限制。KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)是由英国LGC(Laboratory of the Government Chemist，政府化学家实验室)开发的一项经济有效、灵活的SNP分型技术，可以利用通用的荧光探针来代替针对位点的荧光探针，大大节约成本。

发明内容

本发明的目的是筛选不同微量元素含量的小麦。

本发明保护筛选不同微量元素含量小麦的方法。

本发明保护的筛选不同微量元素含量小麦的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：检测待测小麦基因组中基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型还是TT纯合型，GG纯合型的小麦的微量元素含量高于TT纯合型的小麦的微量元素含量；

所述“AX-89703298SNP位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5′末端起第33位核苷酸。

本发明保护的筛选不同微量元素含量小麦的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：

(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物F1、引物F2和引物R组成的引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

所述引物F1包括荧光标签序列甲和DNA序列a；

所述DNA序列a可为如下x1)或x2)：

x1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

x2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物F2包括荧光标签序列乙和DNA序列b；

所述DNA序列b可为如下x3)或x4)：

x3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

x4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；

所述引物R可为如下x5)或x6)：

x5)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

x6)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

(2)完成步骤(1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，进行如下判断：

如果所述PCR扩增产物产生荧光标签序列甲的荧光信号，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型；

如果所述PCR扩增产物产生荧光标签序列乙的荧光信号，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型；

GG纯合型的小麦的微量元素含量高于TT纯合型的小麦的微量元素含量。

上述方法二中，所述引物F1(从5′至3′)由所述荧光标签序列甲和所述DNA序列a组成。所述引物F2(从5′至3′)由所述荧光标签序列乙和所述DNA序列b组成。所述荧光标签序列甲和所述荧光标签序列乙的核苷酸序列不同。

所述荧光标签序列甲的核苷酸序列可如序列表中序列2自5′末端起第1至21位所示(荧光信号为蓝色)。所述引物F1(同下述引物F1-1)的核苷酸序列具体可如序列表中序列2所示。

所述荧光标签序列乙的核苷酸序列可如序列表中序列3自5′末端起第1至21位所示(荧光信号为红色)。所述引物F2(同下述引物F2-1)的核苷酸序列具体可如序列表中序列3所示。

本发明保护的筛选不同微量元素含量小麦的方法，具体可为方法三，可包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物F1-1、引物F2-1和引物R组成的引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：

如果所述PCR扩增产物中含有DNA区段甲且不含有DNA区段乙，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型；DNA区段甲的核苷酸序列如序列表中的序列9所示；DNA区段乙的核苷酸序列如序列表中的序列10所示；

如果所述PCR扩增产物中含有DNA区段乙且不含有DNA区段甲，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型；

GG纯合型的小麦的微量元素含量高于TT纯合型的小麦的微量元素含量；

所述引物F1-1可为如下x7)或x8)：

x7)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

x8)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物F2-1可为如下x9)或x10)：

x9)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

x10)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物R可为如下x5)或x6)：

x5)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

x6)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

本发明保护的筛选不同微量元素含量小麦的方法，具体可为方法四，可包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物F7、引物F8和引物R组成的引物对丙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：

如果所述PCR扩增产物中含有DNA区段丙且不含有DNA区段丁，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型；DNA区段丙的核苷酸序列如序列表中的序列7所示；DNA区段丁的核苷酸序列如序列表中的序列8所示；

如果所述PCR扩增产物中含有DNA区段丁且不含有DNA区段丙，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型；

所述引物F可为如下x1)或x2)：

x1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

所述引物F8可为如下x3)或x4)：

x3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

所述引物R可为如下x5)或x6)：

x5)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

本发明保护的筛选不同微量元素含量小麦的方法，具体可为方法五，可包括如下步骤：

(1)检测待测小麦的基因组DNA中是否含有DNA区段甲和DNA区段乙；DNA区段甲的核苷酸序列如序列表中的序列9所示；DNA区段乙的核苷酸序列如序列表中的序列10所示；

(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：

如果待测小麦的基因组DNA中含有DNA区段甲且不含有DNA区段乙，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型；

如果待测小麦的基因组DNA中含有DNA区段乙且不含有DNA区段甲，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型；

本发明保护的筛选不同微量元素含量小麦的方法，具体可为方法六，可包括如下步骤：

(1)检测待测小麦的基因组DNA中是否含有DNA区段丙和DNA区段丁；DNA区段丙的核苷酸序列如序列表中的序列7所示；DNA区段丁的核苷酸序列如序列表中的序列8所示；

(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：

如果待测小麦的基因组DNA中含有DNA区段丙且不含有DNA区段丁，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型；

如果待测小麦的基因组DNA中含有DNA区段丁且不含有DNA区段丙，则待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型；

本发明还保护一种试剂盒；该试剂盒可包括检测待测小麦基因组中基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型还是TT纯合型的物质；所述“AX-89703298SNP位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5′末端起第33位核苷酸。

上述试剂盒中，所述“检测待测小麦基因组中基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型还是TT纯合型的物质”可为所述引物对甲、所述引物对乙或所述引物对丙。

本发明还保护分子标记，该分子标记可如序列表的序列1所示。

本发明还保护(z1)或(z2)或(z3)或(z4)或(z5)或(z6)或(z7)：

(z1)所述试剂盒或所述分子标记在筛选不同微量元素含量的小麦中的应用；

(z2)所述试剂盒或所述分子标记在制备筛选不同微量元素含量的小麦的产品中的应用；

(z3)所述试剂盒或所述分子标记在鉴定小麦的微量元素含量中的应用；

(z4)所述试剂盒或所述分子标记在制备鉴定小麦的微量元素含量的产品中的应用；

(z5)所述试剂盒或所述分子标记在鉴定小麦基因组中基于AX-89703298SNP位点的基因型中的应用；

(z6)所述试剂盒或所述分子标记在制备鉴定小麦基因组中基于AX-89703298SNP位点的基因型的产品中的应用；

(z7)所述试剂盒或所述分子标记在小麦育种中的应用。

上述任一所述微量元素可为锌和/或铁。

上述任一所述高于可为在统计学上的高于。

试验证明，基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型的小麦的锌含量在统计学上显著高于基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型的小麦的锌含量，基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型的小麦的铁含量在统计学上显著高于基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型的小麦的铁含量。由此可见，通过检测基于AX-89703298SNP位点的基因型可以筛选出不同锌含量和/或铁含量的小麦。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为50K芯片中的SNP标记构建的遗传连锁图及AX-89703298SNP位点在遗传连锁图中的位置。

图2为K-AX-89703298引物组检测254个家系基于AX-89703298SNP位点的基因型结果。

图3为K-AX-89703298引物组检测50个小麦主栽品种基于AX-89703298SNP位点的基因型结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的京冬8号和矮抗58均记载于如下文献中：Zhang Y，Song Q，Yan J，et al.Mineral element concentrations in grains of Chinese wheat cultivars[J].Euphytica，2010，174(3)：303-313。京冬8号是北京市农林科学院培育的高产、稳产、多抗的小麦品种，也是北部冬麦区骨干亲本之一。矮抗58是河南科技学院茹振钢教授培育的高产广适型小麦品种。

Wheat Trait Breed 50K SNP Array为本发明的发明人将试验材料(小麦)提供给北京博奥晶典生物技术有限公司，由后者开发而成。在下文中，Wheat Trait Breed 50KSNP Array简称50K芯片。

10×KASP Master Mix为LGC公司的产品。

实施例1、AX-89703298SNP位点的发现

1、将京冬8号(作为母本)和矮抗58(作为父本)进行杂交，获得京冬8号和矮抗58的杂交F1代(简称杂交F1代)。将杂交F1代自交，获得F2群体；采用单粒传法直至自交得到RILs群体。该RILs群体由254个家系组成。

2、在土壤施锌足量条件下(施锌情况：25Kg/Ha)，2017年分别在河北石家庄和河北高邑种植步骤1构建的RILs群体，收获相应的小麦籽粒并手工脱粒。

3、取待测小麦籽粒(京冬8号籽粒、矮抗58籽粒或步骤2得到的小麦籽粒)，按照文献(Zarcinas et al.1987)中记载的方法采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定锌含量和铁含量(试验重复三次取平均值)。

小麦籽粒的检测结果见表1中第2、3、5和6列。

4、采用50K芯片对步骤1构建的RILs群体的各个家系的基因组DNA进行全基因组扫描，然后用IciMapping4.1软件(网址为：http://www.isbreeding.net/)和JoinMap软件(网址为：https://www.kyazma.nl)制作遗传连锁图谱。

5、以步骤3中RILs群体中各个家系的籽粒在2个环境下锌平均含量(表1中第4列)和铁平均含量(表1中第7列所示)为表型数据，结合50K芯片对RILs群体的各个家系的基因组DNA进行全基因组扫描提供的基因型数据，采用QTL作图软件IciMapping 4.1(网址为：http://www.isbreedin_g.net/)中的完备区间作图法(Inclusive Composite IntervalMappin_g，ICIM)估算QTL。设置参数如下：“permutation”为1000次，软件自动赋值LOD(Lo_garithm of Odds)，步长设为0.5cM，“control marker”和“Window size”使用默认值，回归方式采用“Forward and backward method”；寻找QTL时，把LOD值峰值设为3.0，QTL的置信区间划分时采用LOD≥2.5。每个QTL的区间距不超过20cM，用逐步回归估算表型变异。LOD值大于2.5的QTL被认为是具有显著效应。LOD值大于2.5的QTL被认为是具有显著效应。

表1.京冬8号/矮抗58RILs群体254个家系的表型与基因型

注：2017HB(Zn)¹为在2017年河北石家庄254个家系2个重复的微量元素锌含量的平均值；2017GY(Zn)²为在2017年河北高邑254个家系2个重复的微量元素锌含量的平均值；平均值³为254个家系的微量元素锌含量两个环境平均值；2017HB(Fe)⁴为在2017年河北石家庄254个家系2个重复的微量元素铁含量的平均值；2017GY(Fe)⁵为在2017年河北高邑254个家系2个重复的微量元素铁含量的平均值；平均值⁶为254个家系的微量元素铁含量两个环境平均值；基因型⁷为50K芯片检测的基因型结果，-为未知基因型。

结果表明，京冬8号的锌含量和铁含量均显著高于矮抗58，重组自交系(RILs)群体内的锌含量和铁含量呈正态分布，表现出超亲分离。步骤1构建的RILs群体中定位到1个效应大且稳定的QTL。根据该QTL进一步发现1个SNP位点，命名为AX-89703298SNP位点(位置见图1)。AX-89703298SNP位点为小麦基因组中序列表中序列1自5′末端起第33位核苷酸。

AX-89703298SNP位点的基本信息见表2(由于基因组DNA为由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子，因此一般将编码蛋白质的DNA分子，也就是具有起始密码子至终止密码子的DNA分子，命名为DNA分子的正义链；将与正义DNA分子反向互补的DNA分子命名为DNA分子的反义链。AX-89703298SNP位点的等位基因的基因型均为正义链DNA的基因型)。

表2.AX-89703298SNP位点的基本信息

SNP位点名称	染色体	等位基因的基因型
			AX-89703298SNP位点	4D	GG纯合型、TT纯合型、GT杂合型

实施例2、采用K-AX-89703298引物组检测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型

一、K-AX-89703298引物组的制备

根据AX-89703298SNP位点在小麦4D染色体上的位置，设计并制备K-AX-89703298引物组。K-AX-89703298引物组由引物KASP-897A：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTAACCATTGGATAGGGCGAC-3′(单下划线为FAM荧光标签序列)(序列表中序列2)、引物KASP-897B： (双下划线为HEX荧光标签序列)(序列表中序列3)和引物KASP-897C：5′-CCCAGCTTCAGCCCATGA-3′(序列表中序列4)组成。

二、采用K-AX-89703298引物组检测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型

待测样本为步骤1构建的RILs群体中各个家系的叶片、京冬8号的叶片、矮抗58的叶片或“京冬8号和矮抗58的杂交F1代的叶片”。

1、提取待测样本的基因组DNA。

2、分别以待测样本的基因组DNA为模板，采用步骤一制备的K-AX-89703298引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系为10μL，由1μL10×KASP Master Mix、引物KASP-897A水溶液、引物KASP-897B水溶液、引物KASP-897C水溶液和待测样本的基因组DNA组成。反应体系为中，引物KASP-897A和引物KASP-897B的浓度为0.13μM，引物KASP-897C的浓度为0.34μM，待测样本的基因组DNA为75ng。

反应程序：94℃15min；94℃20s，65-55℃1min(每个循环降0.6℃)，10个循环；94℃20s，55℃60s，26个循环。

3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX、ROM光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，然后采用Kluster Caller软件(网址为：http://agripheno.com)对PCR扩增产物进行检测和分型：如果某待测样本显示蓝色荧光信号，则该待测样本基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型；如果某待测样本显示红色荧光信号，则该待测样本基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型；如果某待测样本显示绿色荧光信号，则该待测样本基于AX-89703298SNP位点的基因型为GT杂合型。

需要说明的是：1、若PCR扩增结束后荧光信号弱、分群较分散、影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，57℃1min，3个循环)，直至结果满意为止；2、KASP检测要求至少检测24个待测样本(含两个空白对照)，否则可能影响分群判读，造成较大误差。

按照上述步骤2-3，将步骤2中待测样本的基因组DNA替换为水，其它均不变，作为清水对照。

KASP检测结果见图2。结果表明，京冬8号基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型；矮抗58基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型；京冬8号和矮抗58的杂交F1代基于AX-89703298SNP位点的基因型为GT杂合型；50K芯片对254个家系的基因组DNA进行全基因组扫描获得基于AX-89703298SNP位点的基因型和采用K-AX-89703298引物组检测254个家系基于AX-89703298SNP位点的基因型(表1中第8列所示)完全一致。由此可见，步骤一制备的K-AX-89703298引物组可以用于检测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型。

实施例3、K-AX-89703298引物组检测50份国内主栽品种基于AX-89703298SNP位点的基因型

待测小麦为50个小麦主栽品种。50个小麦主栽品种的名称见表3中第1列。

1、检测待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型

(1)提取待测小麦叶片的基因组DNA。

(2)分别以待测小麦的基因组DNA为模板，采用K-AX-89703298引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系为10μL，由1μL 10×KASP Master Mix、引物KASP-897A水溶液、引物KASP-897B水溶液、引物KASP-897C水溶液和待测小麦的基因组DNA组成。反应体系为中，引物KASP-897A和引物KASP-897B的浓度为0.13μM，引物KASP-897C的浓度为0.34μM，待测样本的基因组DNA为75ng。

(3)完成步骤(2)后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX、ROM光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，然后采用KlusterCaller软件对PCR扩增产物进行检测和分型：如果某待测小麦显示蓝色荧光信号，则该待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型；如果某待测小麦显示红色荧光信号，则该待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为TT纯合型；如果某待测小麦显示绿色荧光信号，则该待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型为GT杂合型。

需要说明的是：1、若PCR扩增结束后荧光信号弱、分群较分散、影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，57℃1min，3个循环)，直至结果满意为止；2、KASP检测要求至少检测24个待测小麦(含两个空白对照)，否则可能影响分群判读，造成较大误差。

按照上述步骤(2)-(3)，将步骤(2)中待测样本的基因组DNA替换为水，其它均不变，作为清水对照。

KASP检测结果见图3。

待测小麦基于AX-89703298SNP位点的基因型统计结果见表3中第2列。由于待测小麦品种均为栽培种，默认为是高度纯合的植物材料，所以基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型或TT纯合型。

2、检测待测小麦籽粒的锌含量和铁含量

实验重复三次取平均值。每次重复的步骤如下：

取待测小麦籽粒，按照文献(Zarcinas et al.1987)中记载的方法采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定锌含量和铁含量(实验重复三次取平均值)。

待测小麦籽粒的锌含量检测结果见表3中第3列。

待测小麦籽粒的铁含量检测结果见表3中第4列。

表3.50份主栽品种由K-AX-89703298引物组检测的基因型和锌、铁含量平均值

用国际通用SAS9.2统计软件PROC TTEST模型对实施例3中50个家系中的GG纯合型、TT纯合型、小麦籽粒铁含量和锌含量进行t检验。结果见表4。

表4.50份主栽品种锌铁含量t检验

结果表明，基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型的小麦的锌含量在统计学上显著高于TT纯合型的小麦的锌含量，基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型的小麦的铁含量在统计学上显著高于TT纯合型的小麦的铁含量。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒

<160> 10

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<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

<220>

<221> misc_feature

<222> （33）

<223> n is g or t

<400> 1

cccagcttca gcccatgacc cagttgttat tcntcgccct atccaatggt tag 53

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tctaaccatt ggatagggcg ac 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tctaaccatt ggatagggcg aa 42

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

cccagcttca gcccatga 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 5

ctaaccattg gatagggcga c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ctaaccattg gatagggcga a 21

<210> 7

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 7

cccagcttca gcccatgacc cagttgttat tcgtcgccct atccaatggt tag 53

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

cccagcttca gcccatgacc cagttgttat tcttcgccct atccaatggt tag 53

<210> 9

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

cccagcttca gcccatgacc cagttgttat tcgtcgccct atccaatggt tagagcatga 60

acttggtcac cttc 74

<210> 10

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

cccagcttca gcccatgacc cagttgttat tcttcgccct atccaatggt tagaatccgt 60

tgactccgac cttc 74

Claims

1.一种筛选不同微量元素含量小麦的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基因组中基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型还是TT纯合型，GG纯合型的小麦的微量元素含量高于TT纯合型的小麦的微量元素含量；

2.一种筛选不同微量元素含量小麦的方法，包括如下步骤：

所述引物F1包括荧光标签序列甲和DNA序列a；

所述DNA序列a为如下x1)或x2)：

x1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

所述引物F2包括荧光标签序列乙和DNA序列b；

所述DNA序列b为如下x3)或x4)：

x3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

所述引物R为如下x5)或x6)：

x5)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

3.一种筛选不同微量元素含量小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物F1-1、引物F2-1和引物R组成的引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：

所述引物F1-1为如下x7)或x8)：

x7)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述引物F2-1为如下x9)或x10)：

x9)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述引物R为如下x5)或x6)：

x5)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

4.一种筛选不同微量元素含量小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物F7、引物F8和引物R组成的引物对丙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：

所述引物F7为如下x1)或x2)：

x1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

所述引物F8为如下x3)或x4)：

x3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

所述引物R为如下x5)或x6)：

x5)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

5.一种筛选不同微量元素含量小麦的方法，包括如下步骤：

(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：

6.一种筛选不同微量元素含量小麦的方法，包括如下步骤：

(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：

7.一种试剂盒，包括检测待测小麦基因组中基于AX-89703298SNP位点的基因型为GG纯合型还是TT纯合型的物质；所述“AX-89703298SNP位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5′末端起第33位核苷酸。

8.分子标记，如序列表的序列1所示。

9.(z1)或(z2)或(z3)或(z4)或(z5)或(z6)或(z7)：

(z1)权利要求7所述试剂盒或权利要求8所述分子标记在筛选不同微量元素含量的小麦中的应用；

(z2)权利要求7所述试剂盒或权利要求8所述分子标记在制备筛选不同微量元素含量的小麦的产品中的应用；

(z3)权利要求7所述试剂盒或权利要求8所述分子标记在鉴定小麦的微量元素含量中的应用；

(z4)权利要求7所述试剂盒或权利要求8所述分子标记在制备鉴定小麦的微量元素含量的产品中的应用；

(z5)权利要求7所述试剂盒或权利要求8所述分子标记在鉴定小麦基因组中基于AX-89703298SNP位点的基因型中的应用；

(z6)权利要求7所述试剂盒或权利要求8所述分子标记在制备鉴定小麦基因组中基于AX-89703298SNP位点的基因型的产品中的应用；

(z7)权利要求7所述试剂盒或权利要求8所述分子标记在小麦育种中的应用。

10.如权利要求1至6任一所述的方法、权利要求7所述的试剂盒或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述微量元素为锌和/或铁。