CN116121434A - 一种控制小麦zip3a锌转运功能的氨基酸位点及分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点及分子标记，包括氨基酸变异位点R227G及利用R227G设计dCAPS分子标记，检测方法包括步骤一、设计PCR引物并对二倍体和四倍体小麦cDNA进行PCR扩增得到七条ZIP3A核苷酸序列，步骤二、以TuZIP3A为模板进行定点突变后得到六条突变序列，步骤三、通过酵母异源表达得出氨基酸变异位点R227G是控制TuZIP3A锌转运的氨基酸位点；本发明通过单倍型分析、定点突变和酵母功能验证，证实了R227G是控制小麦ZIP3A锌转运功能的新的氨基酸变异位点，并开发了dCAPS分子标记用于该氨基酸变异位点的检测，有效应用于小麦高锌积累品种的辅助选择育种。
Description
技术领域
本发明涉及核苷酸位点开发技术领域，尤其涉及一个ZIP3A锌转运功能的变异位点发掘及其分子标记。
背景技术
锌是人类必需的微量营养元素，小麦是人体锌摄入的主要来源，然而，我国乃至世界各地区的耕地土壤中锌有效性不足导致小麦籽粒产量及品质下降，间接引发人体锌缺乏症，因此，选育高锌积累小麦品种对农业生产和人体健康具有重要意义；
然而目前对检测引起小麦锌转运功能改变的氨基酸变异位点的发掘以及对应分子标记的开发还远远不够，未发现能用于鉴定其锌转运功能的分子标记，使得利用分子标记辅助选择高锌积累小麦品种存在瓶颈，同时，因此，本发明提出一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点及分子标记以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于发掘小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸变异位点，并提出该位点的检测方法及分子标记，该控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点及分子标记通过锌转运位点检测的方法，通过单倍型分析、定点突变和酵母功能验证，证实了R227G是控制小麦ZIP3A锌转运功能的新的氨基酸变异位点，并开发了dCAPS分子标记用于该氨基酸变异位点的检测，有效应用于小麦高锌积累品种的辅助选择育种，大大提高选育效率。
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点，包括ZIP3A序列中氨基酸变异位点R227G。
一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、利用中国春小麦序列设计ZIP3A基因的特异PCR引物ZIP3-KpnI-F和ZIP3-EcoRI-R，再分别对1份二倍体小麦和6份四倍体小麦的cDNA进行PCR扩增后测序，得到TdiZIP3A、TdZIP3A、TduZIP3A、TtZIP3A、TtuZIP3A、TpZIP3A和TuZIP3A七条ZIP3A核苷酸序列；
步骤二、再以TuZIP3A为模板进行定点突变，得到TuZIP3A_R227G、TuZIP3A_T235I、TuZIP3A_R227G/T235I、TuZIP3A_R227Δ、TuZIP3A_T235Δ和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ六条突变序列；
步骤三、通过酵母异源表达TuZIP3A、TuZIP3A_R227G、TuZIP3A_T235I、TuZIP3A_R227G/T235I、TuZIP3A_R227Δ、TuZIP3A_T235Δ和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ蛋白，得到氨基酸变异位点R227G是控制TuZIP3A锌转运的氨基酸位点。
进一步改进在于：所述步骤一中PCR引物ZIP3-KpnI-F和ZIP3-EcoRI-R核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
进一步改进在于：所述步骤一中TdiZIP3A、TdZIP3A、TduZIP3A、TtZIP3A、TtuZIP3A和TpZIP3A核苷酸序列相同，经过氨基酸序列比对得到七条ZIP3A基因中共含有2种单倍型，存在G227R和I235T两个变异位点且均在TuZIP3A序列上。
进一步改进在于：所述步骤二中定点突变所用的引物包括T-1500-F、T-1500-R、TuZIP3A_R227G-F、TuZIP3A_R227G-R、TuZIP3A_T235I-F、TuZIP3A_T235I-R、TuZIP3A_R227G/T235I-F、TuZIP3A_R227G/T235I-R、TuZIP3A_R227Δ-F、TuZIP3A_R227Δ-R、TuZIP3A_T235Δ-F、TuZIP3A_T235Δ-R、TuZIP3A_R227Δ/T235Δ-F和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
进一步改进在于：所述步骤二中获得的TuZIP3A_R227G、TuZIP3A_T235I和TuZIP3A_R227G/T235I突变序列与TuZIP3A相比，TuZIP3A_R227G第679位碱基由A替换为G，导致TuZIP3A_R227G第227位精氨酸(R)转换为甘氨酸(G)；TuZIP3A_T235I第704位碱基由C替换为T，导致TuZIP3A_T235I第235位苏氨酸(T)转换为异亮氨酸(I)；TuZIP3A_R227G/T235I的第679位和第704位碱基分别由A和C替换为G和T，导致TuZIP3A_R227G/T235I第227位和第235位分别转换为甘氨酸(G)和异亮氨酸(I)。
进一步改进在于：所述步骤二中获得的TuZIP3A_R227Δ、TuZIP3A_T235Δ和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ突变序列与TuZIP3A相比，TuZIP3A_R227Δ在第679-681位碱基的缺失，导致TuZIP3A_R227Δ第227位的精氨酸(R)缺失，编码359个氨基酸；TuZIP3A_T235Δ在第703-705位碱基的缺失，导致TuZIP3A_T235Δ第235位的苏氨酸(T)缺失，编码359个氨基酸；TuZIP3A_R227Δ/T235Δ在第679-681位和第703-705位碱基的缺失，导致TuZIP3A_R227Δ/T235Δ第227位和第235位的精氨酸(R)和苏氨酸(T)缺失，编码358个氨基酸。
进一步改进在于：所述步骤三中通过酵母异源表达TuZIP3A和六条突变序列蛋白时得到无锌转运功能的TuZIP3A，在使用氨基酸变异位点R227G定点突变后使其获得了锌转运功能，而T235I不改变其锌转运功能。
一种控制小麦ZIP3A锌转运氨基酸变异位点分子标记，利用氨基酸变异位点R227G设计dCAPS分子标记引物TuZIP3A-MboII-F和TuZIP3A-MboII-R，引物核苷酸序列分别如SEQID NO:17和SEQ ID NO:18所示。
本发明的有益效果为：本发明通过锌转运位点发掘，通过单倍型分析、定点突变和酵母功能验证，证实了R227G是控制小麦ZIP3A锌转运功能的新的氨基酸变异位点，并根据变异位点开发了dCAPS分子标记用于该氨基酸变异位点的分子标记，有效应用于小麦高锌积累品种的辅助选择育种，大大提高选育效率，为小麦锌富集遗传改良提供基因资源。
附图说明
图1为本发明实施例1检测方法流程图。
图2为本发明实施例1在酵母异源系统中验证不同小麦ZIP3A蛋白活性图。
图3为本发明实施例2检测所述突变位点的dCAPS分子标记图。
图4为本发明实施例2四倍体小麦dCAPS分子标记的电泳分析图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据图1和图2所示，本实施例提供了一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点，包括ZIP3A序列中氨基酸变异位点R227G。
一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、利用中国春小麦序列设计ZIP3A基因的特异PCR引物ZIP3-KpnI-F和ZIP3-EcoRI-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，见下基因克隆引物信息表，再分别对1份二倍体小麦和6份四倍体小麦(如下表1)的cDNA进行PCR扩增后测序，得到TdiZIP3A、TdZIP3A、TduZIP3A、TtZIP3A、TtuZIP3A、TpZIP3A和TuZIP3A七条ZIP3A核苷酸序列；
其中TdiZIP3A、TdZIP3A、TduZIP3A、TtZIP3A、TtuZIP3A和TpZIP3A核苷酸序列相同，一并命名为Tdi/Td/Tdu/Tt/Ttu/TpZIP3A；它们与普通小麦中国春的TaZIP3A核苷酸序列的相似性为99.82％，编码的氨基酸序列相似性为99.72％，TuZIP3与中国春TaZIP3A的核苷酸序列相似性为99.54％，氨基酸序列相似性为99.17％；
经过氨基酸序列比对得到七条ZIP3A基因中共含有2种单倍型，存在G227R和I235T两个变异位点且均在TuZIP3A序列上。
基因克隆引物信息表
表1不同小麦编号、名称、基因组组成、基因命名和序列信息
步骤二、再以TuZIP3A为模板，利用引物T-1500-F、T-1500-R、TuZIP3A_R227G-F、TuZIP3A_R227G-R、TuZIP3A_T235I-F、TuZIP3A_T235I-R、TuZIP3A_R227G/T235I-F、TuZIP3A_R227G/T235I-R、TuZIP3A_R227Δ-F、TuZIP3A_R227Δ-R、TuZIP3A_T235Δ-F、TuZIP3A_T235Δ-R、TuZIP3A_R227Δ/T235Δ-F和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ-R进行定点突变，得到TuZIP3A_R227G、TuZIP3A_T235I、TuZIP3A_R227G/T235I、TuZIP3A_R227Δ、TuZIP3A_T235Δ和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ六条突变序列；
其中各个引物所对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；
获得的TuZIP3A_R227G、TuZIP3A_T235I和TuZIP3A_R227G/T235I突变序列与TuZIP3A相比，TuZIP3A_R227G第679位碱基由A替换为G，导致TuZIP3A_R227G第227位精氨酸(R)转换为甘氨酸(G)；TuZIP3A_T235I第704位碱基由C替换为T，导致TuZIP3A_T235I第235位苏氨酸(T)转换为异亮氨酸(I)；TuZIP3A_R227G/T235I的第679位和第704位碱基分别由A和C替换为G和T，导致TuZIP3A_R227G/T235I第227位和第235位分别转换为甘氨酸(G)和异亮氨酸(I)；
获得的TuZIP3A_R227Δ、TuZIP3A_T235Δ和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ突变序列与TuZIP3A相比，TuZIP3A_R227Δ在第679-681位碱基的缺失，导致TuZIP3A_R227Δ第227位的精氨酸(R)缺失，编码359个氨基酸；TuZIP3A_T235Δ在第703-705位碱基的缺失，导致TuZIP3A_T235Δ第235位的苏氨酸(T)缺失，编码359个氨基酸；TuZIP3A_R227Δ/T235Δ在第679-681位和第703-705位碱基的缺失，导致TuZIP3A_R227Δ/T235Δ第227位和第235位的精氨酸(R)和苏氨酸(T)缺失，编码358个氨基酸。
步骤三、通过酵母异源表达TuZIP3A、TuZIP3A_R227G、TuZIP3A_T235I、TuZIP3A_R227G/T235I、TuZIP3A_R227Δ、TuZIP3A_T235Δ和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ蛋白，发现无锌转运功能的TuZIP3A，在使用氨基酸变异位点R227G定点突变后使其获得了锌转运功能，而T235I不改变其锌转运功能，因此得到氨基酸变异位点R227G是控制TuZIP3A锌转运的关键氨基酸位点，如说明书附图2所示。
实施例2
根据图3和图4所示，本实施例提供一种控制小麦ZIP3A锌转运氨基酸变异位点分子标记，包括利用实施例1中验证的氨基酸变异位点R227G设计dCAPS分子标记引物TuZIP3A-MboII-F和TuZIP3A-MboII-R，引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。
对TuZIP3A和TpZIP3A的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物经一个限制性内切酶MboII酶切，在电泳中可检测到两种不同类型的条带，碱基为A的条带为140bp单一条带，碱基为G的条带包含140bp、96bp和44bp三条带如说明书附图3所示。该dCAPS标记能准确区分这些变异位点。利用该dCAPS标记对59份四倍体小麦进行基因分型，发现这59份四倍体小麦均包含氨基酸位点G227，如说明书附图4所示。
实施例3
本实施例提供了一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的具体操作步骤，包括：
1、RNA提取与cDNA合成
利用E.Z.N.A.Total RNA KitII试剂盒提取1份二倍体小麦和6份四倍体小麦根系总RNA，再利用GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA。
2、ZIP3A克隆和测序
ZIP3A基因扩增
利用高保真酶结合PCR引物ZIP3-KpnI-F和ZIP3-EcoRI-R扩增ZIP3A基因，反应体系为：25μL 2×PCR缓冲液、1μL 10mM dNTPs、2μL 10μM Primer F/R、1μL DNA聚合酶、3μLcDNA和18μL二次蒸馏水。PCR扩增程序为：95℃初始变性3min，33个扩增循环(95℃变性15秒、63℃退火15秒和72℃延伸1min)，72℃彻底延伸5min，4℃保存。再用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。
扩增产物回收
利用Trelief DNA Gel Extraction Kit试剂盒回收扩增产物。
回收产物连接
利用pMD 19-T载体与目的片段连接，连接体系为：5μL Solution I，1μL pMD 19-TVector、2μL目的片段和2μL二次蒸馏水；16℃连接30min。
连接产物转化
①取50μL冰上融化的TreliefTM 5αChemically Competent Cell加入10μL连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min；
②在42℃混进下热激90秒，然后再冰埋3min；
③加入300μL LB液体培养基，在37℃150r/min条件下培养60min；
④取200μL菌液均匀涂于LB固体培养基中并倒置，在37℃条件下培养12小时。
阳性检测和测序
挑取单菌落作为模板，利用2×Taq Master Mix的PCR混合液进行PCR扩增，反应体系为：25μL 2×Taq Master Mix、2μL 10μM Primer F/R、单菌落模板和20μL二次蒸馏水；扩增程序为：95℃预变性3min，28扩增循环(95℃变性15秒、63℃退火15秒和72℃延伸2min)，72℃彻底延伸5min，4℃保存，再用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，将阳性克隆子送至Tsingke进行测序。
ZIP3A序列特征分析
利用在线工具ExPASy-Translate翻译软件将将核苷酸序列翻译为氨基酸序列，利用EnsemblPlants数据库与小麦中国春基因组序列进行同源比对，确定ZIP3A的基因结构和染色体位置。
3、TuZIP3A定点突变
质粒提取
将序列正确的阳性克隆子接种到5mLLB液体培养基中，在37℃条件下培养12小时，再利用TreliefPlasmidMiniKit试剂盒提取质粒。
酵母表达载体构建
以提取的质粒为模板，参照2中“ZIP3A基因扩增”的方法扩增并检测，参照2中“扩增产物回收”的方法回收扩增片段。利用FastDigest KpnI和FastDigest EcoRI酶切目的基因和pYES2质粒。酶切体系为：1.5μg目的基因/pYES2质粒、2μL FastDigest KpnI、2μLFastDigest EcoRI和3μL FastDigest缓冲液，加二次蒸馏水补至30μL，混匀并短暂离心，37℃条件下酶切15min，再80℃条件下灭活5min，并在4℃保存。
利用T4连接酶连接目的基因与pYES2质粒。连接体系为：5μL目的基因(线性)、2μLpYES2质粒(线性)、0.5μLT4连接酶、1μL 10×T4 Ligase Buffer，和1.5μL二次蒸馏水，混匀并短暂离心，16℃过夜连接。
参照2中“连接产物转化”的方法转化大肠杆菌，参照2中的“阳性检测和测序”方法筛选阳性克隆子并测序验证，对序列正确的阳性克隆子参照上述“质粒提取”的方法摇菌并提取质粒。
定点突变
利用Mut Express II Fast Mutagenesis Kit试剂盒实现质粒定点突变。利用在线软件Vazyme单点突变生成扩增引物，如下表2，具体操作步骤如下：
1)以上述“酵母表达载体构建”中提取的质粒为模板，下表2中的引物，按照2中“ZIP3A基因扩增”的扩增体系和程序进行PCR扩增；
2)取50μL扩增产物加入1μL DpnI，混匀后短暂离心，37℃恒温反应1h；
3)参照2中“回收产物连接”的方法利用1％琼脂糖凝胶检测并回收目标产物；
4)加入50-400ng回收产物、4μL5×CE II Buffer和2μL Exnase II，添加二次蒸馏水补至20μL，混匀并短暂离心，37℃恒温反应30min；
5)参照2中“连接产物转化”的方法转化大肠杆菌；
6)参照2中“阳性检测和测序”的方法筛选阳性克隆子并测序验证；
7)参照上述“质粒提取”的方法过夜培养序列正确的阳性克隆子并提取质粒。
表2定点突变引物信息
4、酵母功能验证
酵母感受态制备
利用S.C.Easy Comp Transformation Kit试剂盒制备酵母感受态细胞。
转化
1)取30μL酵母感受态细胞于1.5mL无菌离心管中，加入5μL构建的酵母表达载体质粒(pYES2-ZIP3A和pYES2)，混匀；
2)加入500μL Solution III，混匀；
3)在30℃恒温水浴1h，过程中每15min涡旋振荡；
4)菌液均匀涂于SD-Ura固体培养基(含2％葡萄糖，含氨苄)，倒置，30℃恒温培养2-4d。
阳性检测
参照2中“阳性检测和测序”的方法，挑取单菌落筛选阳性克隆子。
转化酵母金属转运活性检测
1)单个阳性克隆子接种于10mL SD-Ura液体培养基(含2％葡萄糖，含氨苄)，30℃250r/min过夜培养，使OD600＝0.600-0.800；取500μL加到干净的10mL SD-Ura液体培养基(含2％葡萄糖，含氨苄)，30℃250r/min培养3-6h，使OD600＝0.500-0.600；调整所用酵母细胞悬浮液至OD600＝0.500；
2)取20μL OD600＝0.500的细胞悬浮液，稀释5个浓度梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，依次取5μL点于SD-Ura固体培养基(含2％葡萄糖，含氨苄)和SD-Ura固体培养基(含2％半乳糖，含氨苄)，培养基用ZnSO4(0、6或8mM)进行处理；30℃培养2-4d，采集图像进行分析；
3)取50μL OD600＝0.500的细胞悬浮液加到10mL SD液体培养基(含2％半乳糖，含氨苄)，OD600值约为0.001，培养基用ZnSO4(0或2mM)进行处理；30℃250r/min培养48h，利用酶标仪测定0h、12h、24h、36h和48h的OD600值；
4)取200μL OD600＝0.500的细胞悬浮液加到50mL SD液体培养基(含2％半乳糖，含氨苄)，OD600值约为0.001，培养基用2mM ZnSO4进行处理；30℃250r/min培养48h，收集菌体；100μM EDTA溶液清洗3次，二次蒸馏水润洗3次，80℃烘干至恒重，称重；
5)将烘干后的菌体加入5mL混合酸加[HClO4/HNO3(v/v＝4/1)]消化12h，在240℃电热板上加热消解4-5h，待溶液呈无色透明尚有1mL时终止。待液体冷却后用1％HNO3定容并过滤；
6)利用电感耦合等离子体质谱仪测定消煮后样品锌浓度。
实施例4
本实施例提供一种控制小麦ZIP3A锌转运氨基酸变异位点dCAPS标记开发及验证，包括：
DNA提取
参照Doyle and Doyle的CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：
1)按照下表3的配方配置2×CTAB提取液；
2)液氮研磨1-2g-80℃冷冻保存的小麦叶片，加入800μL2×CTAB提取液(65℃预热)，振荡混匀；
3)65℃水浴1-2h，过程中每10min进行一次振荡混匀；
4)加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，上下颠倒至乳白色，12000r/min离心10min，上清液转入干净的2mL离心管中；
5)加入等体积预冷的异丙醇，-20℃静置1-2h；
6)利用离心机以5000r/min离心3min，弃上清液；
7)70％酒精清洗2次，无水乙醇清洗1次，置于通风橱风干；
8)加入50μL ddH2O溶解DNA；
9)1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外-可见光分光光度计检测DNA浓度，-20℃保存备用。
表3 2×CTAB提取液配方
dCAPS引物扩增
利用在线软件dCAPS Finder分析SNP位点，进行引物开发和内切酶的选择，同时设计相应的下游引物，引物由Tsingke合成。
分别以提取的Δzrc1-TuZIP3A质粒和矮秆波兰小麦基因组DNA为模板，扩增引物见下表4，参照2中“ZIP3A基因扩增”的方法进行PCR扩增并用5％琼脂糖凝胶检测扩增效果。参照2中“扩增产物回收”的方法回收符合扩增条件要求的产物并检测浓度。
表4 dCAPS引物信息
酶切
采用限制性内切酶MboII对回收产物进行酶切，酶切反应体系和程序见下表5。利用5％琼脂糖凝胶对酶切结果进行电泳检测。限制性内切酶酶切特征见下表6。
表5酶切反应体系和程序
表6限制性内切酶酶切特征
SNP验证
参照实施例3的2中的“扩增产物回收-回收产物连接-连接产物转化-阳性检测和测序”的方法进行回收、连接、转化、阳性检测和测序。利用DNAMAN比对序列并检测SNP位点。
SNP分型
1)参照上述“DNA提取”的方法提取59份四倍体小麦的基因组DNA；
2)以59份四倍体小麦的DNA为模板，参照上述“dCAPS引物扩增”的方法，利用开发的dCAPS标记对其进行扩增、检测并回收；
3)参照上述“酶切”的方法进行酶切并检测。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点，其特征在于包括ZIP3A序列中氨基酸变异位点R227G。
2.根据权利要求1所述的一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、利用中国春小麦序列设计ZIP3A基因的特异PCR引物ZIP3-KpnI-F和ZIP3-EcoRI-R，再分别对1份二倍体小麦和6份四倍体小麦的cDNA进行PCR扩增后测序，得到TdiZIP3A、TdZIP3A、TduZIP3A、TtZIP3A、TtuZIP3A、TpZIP3A和TuZIP3A七条ZIP3A核苷酸序列；
步骤二、再以TuZIP3A为模板进行定点突变，得到TuZIP3A_R227G、TuZIP3A_T235I、TuZIP3A_R227G/T235I、TuZIP3A_R227Δ、TuZIP3A_T235Δ和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ六条突变序列；
步骤三、通过酵母异源表达TuZIP3A、TuZIP3A_R227G、TuZIP3A_T235I、TuZIP3A_R227G/T235I、TuZIP3A_R227Δ、TuZIP3A_T235Δ和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ蛋白，得到氨基酸变异位点R227G是控制TuZIP3A锌转运的氨基酸位点。
3.根据权利要求2所述的一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的检测方法，其特征在于：所述步骤一中PCR引物ZIP3-KpnI-F和ZIP3-EcoRI-R核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求2所述的一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的检测方法，其特征在于：所述步骤一中TdiZIP3A、TdZIP3A、TduZIP3A、TtZIP3A、TtuZIP3A和TpZIP3A核苷酸序列相同，经过氨基酸序列比对得到七条ZIP3A基因中共含有2种单倍型，存在G227R和I235T两个变异位点且均在TuZIP3A序列上。
5.根据权利要求2所述的一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的检测方法，其特征在于：所述步骤二中定点突变所用的引物包括T-1500-F、T-1500-R、TuZIP3A_R227G-F、TuZIP3A_R227G-R、TuZIP3A_T235I-F、TuZIP3A_T235I-R、TuZIP3A_R227G/T235I-F、TuZIP3A_R227G/T235I-R、TuZIP3A_R227Δ-F、TuZIP3A_R227Δ-R、TuZIP3A_T235Δ-F、TuZIP3A_T235Δ-R、TuZIP3A_R227Δ/T235Δ-F和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
6.根据权利要求2所述的一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的检测方法，其特征在于：所述步骤二中获得的TuZIP3A_R227G、TuZIP3A_T235I和TuZIP3A_R227G/T235I突变序列与TuZIP3A相比，TuZIP3A_R227G第679位碱基由A替换为G，导致TuZIP3A_R227G第227位精氨酸(R)转换为甘氨酸(G)；TuZIP3A_T235I第704位碱基由C替换为T，导致TuZIP3A_T235I第235位苏氨酸(T)转换为异亮氨酸(I)；TuZIP3A_R227G/T235I的第679位和第704位碱基分别由A和C替换为G和T，导致TuZIP3A_R227G/T235I第227位和第235位分别转换为甘氨酸(G)和异亮氨酸(I)。
7.根据权利要求2所述的一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的检测方法，其特征在于：所述步骤二中获得的TuZIP3A_R227Δ、TuZIP3A_T235Δ和TuZIP3A_R227Δ/T235Δ突变序列与TuZIP3A相比，TuZIP3A_R227Δ在第679-681位碱基的缺失，导致TuZIP3A_R227Δ第227位的精氨酸(R)缺失，编码359个氨基酸；TuZIP3A_T235Δ在第703-705位碱基的缺失，导致TuZIP3A_T235Δ第235位的苏氨酸(T)缺失，编码359个氨基酸；TuZIP3A_R227Δ/T235Δ在第679-681位和第703-705位碱基的缺失，导致TuZIP3A_R227Δ/T235Δ第227位和第235位的精氨酸(R)和苏氨酸(T)缺失，编码358个氨基酸。
8.根据权利要求2所述的一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点的检测方法，其特征在于：所述步骤三中通过酵母异源表达TuZIP3A和六条突变序列蛋白时得到无锌转运功能的TuZIP3A在使用氨基酸变异位点R227G定点突变后使其获得了锌转运功能，而T235I不改变其锌转运功能。
9.一种控制小麦ZIP3A锌转运氨基酸变异位点分子标记，包括利用权利要求1中所述的氨基酸变异位点R227G设计dCAPS分子标记引物TuZIP3A-MboII-F和TuZIP3A-MboII-R，引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。
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