CN109554497A - 用于甘蓝隐性核基因雄性不育性筛选的pcr引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定甘蓝隐性核基因雄性不育性的分子标记、专用引物及其应用，涉及分子生物育种技术。用于鉴定甘蓝隐性核基因雄性不育性的PCR标记，用于检测所述PCR标记的引物名称为ms3‑F/ms3‑R，利用本发明提供的试剂(引物对)辅助鉴定甘蓝雄性不育与田间的吻合率达到100％，将本发明的试剂、分子标记或方法用于甘蓝育种具有操作简便易行、特异性强、稳定性好、可以实现早期选育等优点，具有重大应用前景。

Description

用于甘蓝隐性核基因雄性不育性筛选的PCR引物、试剂盒及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种辅助鉴定甘蓝隐性核基因雄性不育性的分子标记、专用引物及其应用。

背景技术

结球甘蓝简称甘蓝，属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)甘蓝种。甘蓝的适应性和抗逆性均较强，又具有较高的营养和保健价值，因而在中国乃至世界各地广泛栽培。由于甘蓝具有较强的杂种优势，因此国内外的甘蓝优良品种大多是一代杂种，目前国内外甘蓝杂交种均为使用自交不亲和系和雄性不育系配置的。而使用自交不亲和系配置甘蓝一代杂种，有诸多缺陷，例如亲本人工蕾期授粉繁殖成本高，亲本连续自交后代易出现生活力退化以及杂种一代的杂交率很难达到100％。为了克服甘蓝通过自交不亲和系育种过程中出现的缺陷，国内外甘蓝育种人员确立了寻找新型雄性不育源、建立雄性不育育种技术体系为主攻方向，培育优质的甘蓝新品种来满足市场需求。

雄性不育系是指在雌雄同株植物中，雄蕊发育不正常，不能产生有功能的花粉，但是雌蕊发育正常，能接受正常的花粉而受精结实，并能将雄性不育性遗传给后代的植物品系。雄性不育的类型主要有细胞质雄性不育、细胞核雄性不育以及核质互作雄性不育，其中细胞核雄性不育性为核基因控制，又有隐性和显性之分。目前，显性雄性不育材料已在甘蓝育种中成功应用，而隐性不育性尚未得到实际利用，具有较大的应用潜力。

发明内容

本发明根据上述领域的需求，提供一个用于甘蓝隐性核基因雄性不育性筛选的PCR标记，其特异性强，稳定性好，能够快速有效的满足上述领域的需求。本发明要求保护的技术方案如下：

用于甘蓝隐性核基因雄性不育性筛选的PCR标记，其特征在于，所述标记的PCR引物如下：

上游引物ms3-F：5’-GAATGTATCAGGCGTGGAGG-3’

下游引物ms3-R：5’-TCACCGATTTGGTATGAGTTT-3’。

所述PCR引物扩增的甘蓝隐性核基因雄性不育性的特征条带大小为333bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

用于甘蓝隐性核基因雄性不性筛选的试剂盒，其特征在于，包含盛装有液体剂或粉剂的所述的PCR引物的试剂容器。

还包含盛装有用于进行PCR和/或电泳所需的试剂的试剂容器。

用于甘蓝隐性核基因雄性不育性筛选的方法，其特征在于，包括采用所述PCR引物或所述试剂盒进行如下步骤：

⑴以待测甘蓝样品为材料，提取样品的基因组DNA；

⑵以步骤⑴所获得的基因组DNA为模板，采用所述PCR引物进行PCR反应，获得PCR产物；

⑶电泳检测步骤⑵中获得的PCR产物，若PCR产物出现333bp的特征条带，则所述样品具有雄性不育特征；若PCR产物的片段长度为151bp，则所述样品不具有雄性不育特征。

所述PCR反应的体系为：PCR反应总体积为10μL，其中上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，全式金生物2×EasyTaqPCRSuperMix5μL，模板DNA(20ng/μL)2μL，ddH₂O 2μL。

所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

上述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

在标有甘蓝隐性核基因雄性不育性筛选用途的包装盒内分装入液体或粉剂的所述PCR引物。

上述制备方法，还包括以下步骤：在所述包装盒内，装入用于进行PCR和/或电泳所需的试剂。

本发明开发了用于甘蓝隐性核基因雄性不育系辅助筛选的PCR引物，其特异性强，稳定性好，在55℃不产生非特异扩增，能够十分准确地检测出待测甘蓝植株是否为隐性核基因雄性不育。在一般情况下，不同品种甘蓝材料的育性需要在花期人工观察才能确定，而采用本发明的引物ms3-F/ms3-R进行甘蓝隐性核基因雄性不育的辅助筛选，在幼苗期就能够快速筛选出目标株系。因此，采用本发明的PCR标记进行甘蓝的育种辅助选择，大大缩短了育种周期、提高了育种效率。

本发明提供了一种用于甘蓝隐性核基因雄性不育系辅助筛选的方法，该方法操作简单易行，只需提取待测甘蓝的基因组DNA，采用引物ms3-F/ms3-R进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特征条带的长短，即可判断出待测植株中是否为雄性不育。

综上所述，利用本发明提供的PCR标记和引物进行甘蓝雄性不育的筛选，操作简单易行，特异性强，稳定性好，能大大缩短育种周期，提高育种效率。

附图说明

图1表示在不同甘蓝自交系中引物的扩增情况，其中，

M：Ladder；

1、3-17可育材料分别为“01-20”、“夏强”、“亚飞”、“俄05-17”、“湖北1180”、“Kag91”、“308冬升”、“中甘21”、“中甘23”、“中甘25”、“中甘196”、“惠丰4号”、“惠丰5号”、“郊赛”、“美国紫甘蓝”、“吉宝”、“87-534”；

2为甘蓝隐性雄性不育材料“2051S”。

具体实施方式

以下结合具体实施实例进一步阐述本发明，需要说明的是，实例仅用于解释本发明而不代表限制本发明的范围。

生物材料

甘蓝材料：“01-20”、“夏强”、“亚飞”、“俄05-17”、“湖北1180”、“Kag91”、“308冬升”、“中甘21”、“中甘23”、“中甘25”、“中甘196”、“惠丰4号”、“惠丰5号”、“郊赛”、“美国紫甘蓝”、“吉宝”、“87-534”、甘蓝隐性雄性不育材料“2051S”。

以上生物材料本实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1.开发用于甘蓝隐性核基因雄性不育性辅助筛选的标记及其特异性引物：

将甘蓝隐性雄性不育材料“2051S”的亲本“01-20”以及“51S”进行全基因组重测序，寻找其中的SNP和Indel差异位点，在网站http://10.122.68.27/cgi-bin/gbrowse/Oleracea/寻找和筛选存在差异位点处的DNA序列，然后在网站http://bioinfo.ut.ee/ primer3-0.4.0/通过差异位点的DNA序列设计引物，用亲本DNA筛选设计出的所有引物，寻找其中有差异的引物；然后用筛选出来的有差异的引物对F2代材料的混合池建立连锁标记，找到并确定候选基因，根据基因的序列在亲本“01-20”以及“51s”两者中的差异设计以下引物：

上游引物ms3-F：5’-GAATGTATCAGGCGTGGAGG-3’

下游引物ms3-R：5’-TCACCGATTTGGTATGAGTTT-3’

实施例2.试剂盒及其制备

人工合成实施例1中获得的引物，直接装入离心管中，或配成10～100倍工作浓度后装入离心管中后，装入试剂盒中。

将用于进行PCR和/或电泳试剂的试剂容器装入试剂盒中。

实施例3.本发明所述PCR引物或者试剂盒筛选甘蓝隐性核基因雄性不育性的准确性验证

试剂：2×EasyTaqPCRSuperMix购于北京全式金生物

步骤1、提取基因组DNA

用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取甘蓝“01-20”、“夏强”、“亚飞”、“俄05-17”、“湖北1180”、“Kag91”、“308冬升”、“中甘21”、“中甘23”、“中甘25”、“中甘196”、“惠丰4号”、“惠丰5号”、“郊赛”、“美国紫甘蓝”、“吉宝”、“87-534”、甘蓝隐性雄性不育材料“2051S”基因组DNA。

DNA提取方法参见Murray MG,Thompson WF(1980)Rapid isolation of highmolecularweight plant DNA.Nucleic Acids Res 8:4321-4325。

步骤2、鉴定引物ms3-F/ms3-R在甘蓝材料中的扩增情况

为鉴定引物在甘蓝中的扩增情况，委托华大基因公司合成引物ms3-F和ms3-R。以步骤1得到的基因组DNA为模板，按照下列反应体系和反应程序进行PCR反应。

所述PCR反应的体系为：PCR反应总体积为10μL，其中上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，2×EasyTaqPCRSuperMix5μL，模板DNA(20ng/μL)2μL，ddH₂O 2μL。

所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳检测，150V恒压30min，经紫外光凝胶成像仪拍照。

结果如图1所示：将引物ms3-F/ms3-R用于甘蓝自交系材料扩增时，所有甘蓝样品均未检出特征条带，仅有“87-534”甘蓝隐性雄性不育材料“2051S”发生非特异扩增，出现333p特征条带。

上述实验数据表明，本发明提供的引物ms3-F/ms3-R能够准确鉴定或筛选甘蓝隐性雄性不育材料。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 用于甘蓝隐性核基因雄性不育性筛选的PCR引物、试剂盒及其应用

<130> P180615-SCH

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 用于甘蓝雄性不育筛选的PCR标记上游引物

<400> 1

gaatgtatca ggcgtggagg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 用于甘蓝雄性不育筛选的PCR标记下游引物

<400> 2

tcaccgattt ggtatgagtt t 21

<210> 3

<211> 333

<212> DNA

<213> 甘蓝

<220>

<223> 用于甘蓝雄性不育筛选的PCR标记

<400> 3

gaatgtatca ggcgtggagg aggttagaga taacgtggat ttgaccaaaa cgacgacgtt 60

agctacaacc tctacgcatc ggaagatgct acgtctctct catggtcagg gccggccctg 120

agccaagcct aatgaaacat tcgtctcagg cccccgaaat ttttgaaaaa atttacatgg 180

atataagccc ccaaatttgt aaaaaaaaaa attcagcccc caaattattg aattccttct 240

tggctcgtct acagccccca aaatctcagg gccggccctg ctcatggtaa gtggtaaatc 300

acaaaaaaaa aaaaactcat accaaatcgg tga 333

Claims (8)

1.用于甘蓝隐性核基因雄性不育性筛选的PCR标记，其特征在于，所述标记的PCR引物如下：

上游引物ms3-F：5’-GAATGTATCAGGCGTGGAGG-3’

下游引物ms3-R：5’-TCACCGATTTGGTATGAGTTT-3’

所述PCR引物扩增的甘蓝隐性核基因雄性不育性的特征条带大小为333bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.用于甘蓝隐性核基因雄性不性筛选的试剂盒，其特征在于，包含盛装有液体剂或粉剂的权利要求1所述的PCR引物的试剂容器。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含盛装有用于进行PCR和/或电泳所需的试剂的试剂容器。

4.用于甘蓝隐性核基因雄性不育性筛选的方法，其特征在于，包括采用权利要求1所述的PCR引物和/或权利要求2或3所述的试剂盒进行如下步骤：

(1)以待测甘蓝样品为材料，提取样品的基因组DNA；

(2)以步骤⑴所获得的基因组DNA为模板，采用所述PCR引物进行PCR反应，获得PCR产物；

(3)电泳检测步骤⑵中获得的PCR产物，若PCR产物出现333bp的特征条带，则所述样品具有雄性不育特征；若PCR产物的片段长度为151bp，则所述样品不具有雄性不育特征。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的体系为：PCR反应总体积为10μL，其中10μmol/L的上下游引物各0.5μL，北京全式金生物2×EasyTaqPCRSuperMix5μL，20ng/μL的模板DNA 2μL，ddH₂O 2μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

7.权利要求2或3所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

在标有甘蓝雄性不育性筛选用途的包装盒内分装入液体或粉剂的所述PCR引物。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还应包括以下步骤：

在所述包装盒内，装入用于进行PCR和/或电泳所需的试剂。