CN112980985A - 鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的pcr引物组及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子辅助育种技术领域，公开了一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的PCR引物组及试剂盒、应用及方法，PCR引物组包括引物MBoHL1F、MBoHL1R。采用采用引物组MBoHL1F/MBoHL1R对待测甘蓝材料的基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物大小，若PCR扩增产物为1139bp，则待测甘蓝为杂种致死亲本类型1；若PCR扩增产物为944bp，则待测甘蓝不是杂种致死亲本类型1。将本发明的PCR引物、试剂盒或方法用于甘蓝辅助育种具有操作简便易行、特异性强、稳定性好、可以实现早期选育等优点，鉴定结果与田间表型的吻合率达到100％，具有重大应用前景。

Description

鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的PCR引物组及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和植物遗传育种技术领域，涉及一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的PCR引物组及应用。

背景技术

结球甘蓝简称甘蓝，属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)甘蓝种。甘蓝的适应性和抗逆性均较强，又具有较高的营养和保健价值，因而在中国乃至世界各地广泛栽培。

杂种致死是指亲本正常生长，而杂交种出现萎蔫、黄化、植株矮小，甚至死亡的现象。杂种致死作为一种合子后生殖隔离，对于物种进化具有重要意义。近年来关于植物杂种致死的报道越来越多，涉及到杂种致死现象的遗传分析，基因定位及克隆，但是杂种致死的发生机制仍未解析清楚，因此需要更多的工作解决这一疑问。十字花科作物中，大部分是由于远缘杂交造成的属间杂种致死，种内杂种致死事例只在拟南芥和甘蓝上有所研究。甘蓝杂种致死现象是至今在芸薹属中发现的唯一的杂种致死事例，会给甘蓝的生产带来损失，因此急需鉴定出携带致死基因的甘蓝，对其的深入研究有助于研究清楚杂种致死分子机制，对甘蓝育种和生产打好基础。

中国农业科学科学院蔬菜花卉研究所甘蓝青花菜课题组在配制杂交组合过程中发现了甘蓝杂种致死现象，并针对甘蓝杂种致死开展了遗传分析和基因定位工作。薛玉前等(2015a)对杂交组合09-211×09-222正反交及其亲本，以及正常杂交种的苗期生长变化趋势(茎粗、最大外叶长度、叶数)进行观察统计，结果表明杂种致死组合正反交的生长势明显弱于亲本材料和正常F₁的生长势。通过田间杂交组合筛选和性状调查，新发现了三个含有杂种致死的材料10-260，11-204和11-176。利用5份含杂种致死基因的自交系和不含杂种致死基因的自交系87-534互相杂交，田间表型调查结果表明：甘蓝杂种致死材料分为两组，组别1(杂种致死亲本类型1)包括11-204和09-211，组别2(杂种致死亲本类型2)包括10-260，09-222和11-176，组内自交系相互杂交，后代生长正常；组间自交系相互杂交，后代出现致死现象，而5份材料与87-534的杂交组合均不出现致死现象。

薛玉前等(2015a)通过多个三元杂交组合对甘蓝杂种致死进行遗传分析，生长状况调查和卡方测验结果表明杂种致死性状是由2个互补的显性基因控制的，符合DM遗传模式的双位点遗传模式，并分别将杂种致死基因命名为BoHL1和BoHL2，并推断同组别的杂种致死基因为同一基因。进一步研究发现，杂种致死亲本类型1携带的杂种致死基因BoHL1位于C01号染色体，杂种致死亲本类型2携带的杂种致死基因BoHL2位于C04号染色体，两种类型杂交后代表现为致死。

为了实现甘蓝的早期选育，在早期鉴别出甘蓝杂种致死类型，亟需开发出能够用于筛选或鉴别甘蓝杂种致死亲本类型的分子标记和方法。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的PCR引物组，包括引物MBoHL1F、MBoHL1R，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示。

本发明的再一目的是提供一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的试剂盒：包括上述的PCR引物组。

优选地，还包括Taq酶和dNTP；

进一步优选地，还包括甘蓝基因组DNA提取试剂。

本发明的再一目的是提供上述PCR引物组、试剂盒在对甘蓝杂种致死亲本类型1进行鉴定或筛选中的应用。

本发明的再一目的是提供一种分子标记在鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的最后目的是提供一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的方法，采用前述的PCR引物组或试剂盒进行如下操作步骤：

(1)提取待测甘蓝材料的基因组DNA；

(2)采用引物组MBoHL1F/MBoHL1R对待测甘蓝材料的基因组DNA进行PCR扩增；

(3)检测PCR扩增产物大小：若PCR扩增产物为1139bp，则待测甘蓝为杂种致死亲本类型1；若PCR扩增产物为944bp，则待测甘蓝不是杂种致死亲本类型1。

所述步骤(3)中，若PCR扩增产物为944bp，则待测甘蓝为正常材料或者杂种致死亲本类型2。

所述PCR扩增的PCR反应体系中含有：模板基因组DNA0.2μL/μL，包含Mg²⁺的10×PCRbuffer缓冲液0.1μL/μL，dNTPs 0.2mM，Taq DNA聚合酶0.5U/μL，正向引物和反向引物0.4μM，其余为双蒸水。

所述PCR扩增的PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min。

优选地，所述步骤(3)中采用琼脂糖电泳检测PCR扩增产物的条带大小；

进一步优选地，采用1％的琼脂糖在150V恒功率电泳分离30分钟。

本发明开发了用于甘蓝杂种致死亲本类型1鉴别或筛选的PCR引物，其特异性强，稳定性好，在55℃不产生非特异扩增，能够十分准确地检测出待测甘蓝植株是否为杂种致死亲本类型1。在一般情况下，不同品种甘蓝材料的育性需要在花期人工观察才能确定，而采用本发明的引物MBoHL1F/R进行甘蓝杂种致死亲本类型1筛选或鉴别，在幼苗期就能够快速筛选出目标株系。因此，采用本发明的PCR标记进行甘蓝的育种辅助选择，大大缩短了育种周期、提高了育种效率。

本发明提供的用于杂种致死亲本类型1鉴别或筛选的方法，操作简单易行，只需提取待测甘蓝的基因组DNA，采用引物MBoHL1F/R进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特征条带的长短，即可判断出待测植株中是否为甘蓝杂种致死亲本类型1。

综上所述，利用本发明提供的PCR引物组、分子标记和方法进行甘蓝杂种致死亲本类型1的筛选或鉴别，操作简单易行，特异性强，稳定性好，能大大缩短育种周期，提高育种效率。

附图说明

图1是实施例2中采用本发明引物在不同甘蓝自交系中的扩增情况，其中，M为分子量标注marker。

图2是实施例3中采用本发明引物对138份甘蓝类材料基因组DNA的扩增情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明，需要说明的是，实施例仅用于解释本发明而不代表限制本发明的范围。

生物材料

甘蓝材料：09-211和10-204为杂种致死亲本类型1材料；“09-222”为杂种致死亲本类型2材料；“10-260”、“11-176”、“87-534”、“96-100”、“01-20”为正常自交系材料。

上述甘蓝类材料本实验室(中国农业科学科学院蔬菜花卉研究所甘蓝青花菜课题组)均有保存，申请人声明，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。

主要试剂：2×EasyTaqPCRSuperMix购于北京全式金生物生物技术有限公司，产品编号:AS111-11。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可；未特别说明的实验条件，均为本领域常规试验条件。实施例1.开发用于甘蓝杂种致死亲本类型1筛选的标记及其特异性引物

将甘蓝杂种致死亲本类型1材料“09-211”和“10-204”以及非杂种致死类型1材料“09-222”、“10-260”、“11-176”、“87-534”、“96-100”、“01-20”进行全基因组重测序，寻找其中的SNP和Indel差异位点，在网站http://10.122.68.27/cgi-bin/gbrowse/Oleracea/寻找和筛选存在差异位点处的DNA序列，然后在网站http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/通过差异位点的DNA序列设计引物；用亲本DNA筛选设计出的所有引物，寻找其中有差异的引物；从中筛选出符合条件的引物序列并由华大基因公司合成后使用“09-211”和“09-222”材料进行筛选，最终得到本发明引物组MBoHL1F/R：

上游引物：MBoHL1F：5’-TAAACAAGGCTGGATAACAATAC-3’(SEQ ID NO.1)，

下游引物：MBoHL1R：5’-TCACCGGTCTGCTTCTTGAC-3’(SEQ ID NO.2)。

实施例2.本发明PCR引物鉴定杂种致死亲本类型1的相关性验证

步骤1、提取基因组DNA

用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取甘蓝“09-222”、“10-260”、“11-176”、“87-534”、“96-100”、“01-20”、“09-211”、“10-204”的叶片的基因组DNA。

DNA提取方法参见Murray MG,Thompson WF(1980)Rapid isolation of highmolecular weightplant DNA.NucleicAcids Res 8:4321-4325。

步骤2、鉴定引物MBoHL1F/R在甘蓝材料中的扩增情况

为鉴定引物在甘蓝中的扩增情况，委托华大基因公司合成引物MBoHL1F/R。以步骤1得到的基因组DNA为模板，按照下列反应体系和反应程序进行PCR反应。

所述PCR反应的体系为：PCR反应总体积为10μL，其中上、下游引物(浓度10μmol/L)MBoHL1F、MBoHL1R各0.5μL，2×EasyTaqPCRSuperMix 5μL，模板DNA(20ng/μL)2μL，ddH₂O 2μL。

所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测，150V恒压30min，经紫外光凝胶成像仪拍照。

结果如图1所示：将引物MBoHL1F/R用于甘蓝自交系材料扩增时，甘蓝杂种致死亲本类型1材料“09-222”、“10-260”发生非特异扩增，出现1139bp条带(其核苷酸如SEQ IDNO.3所示)，其它甘蓝样品均出现944bp条带。实验结果表明，本发明提供的引物MBoHL1F/R能够准确鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1材料。

实施例3.本发明的PCR引物筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的准确性验证

步骤1、提取基因组DNA

用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取甘蓝138份甘蓝类材料(106份甘蓝，10份青花菜，11份白菜，11份芥蓝)的基因组DNA，详见表1。

DNA提取方法参见Murray MG,Thompson WF(1980)Rapid isolation of highmolecular weightplant DNA.NucleicAcids Res 8:4321-4325。

步骤2、鉴定引物MBoHL1F/R在甘蓝材料中的扩增情况

为鉴定引物在甘蓝中的扩增情况，委托华大基因公司合成引物MBoHL1F/R。以步骤1得到的基因组DNA为模板，按照下列反应体系和反应程序进行PCR反应。

所述PCR反应的体系为：PCR反应总体积为10μL，其中上、下游引物(浓度10μmol/L)MBoHL1F、MBoHL1R各0.5μL，2×EasyTaqPCRSuperMix 5μL，模板DNA(20ng/μL)2μL，ddH₂O2μL。

所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测，150V恒压30min，经紫外光凝胶成像仪拍照。

结果如表1和图2所示：在图2中，将泳道从上往下标记为第A、B、C、D、E、F行，从左边起的第一列(图2中标记为“M”)为分子量标准marker，第二列(图2中标记为C列)为甘蓝杂种致死亲本类型1材料“09-211”的扩增条带，为1139bp。第A、B、C、D、E、F行的泳道1-23(图2中标记

)为138份试测材料，其中，第F行的第11泳道“F11”发生非特异扩增，出现1139bp条带，说明F11为甘蓝杂种致死亲本类型1材料，其它样品均出现944bp条带。

田间表型鉴定证实F11为甘蓝杂种致死亲本类型1材料，其余试测材料均为正常材料或甘蓝杂种致死亲本类型2材料。上述实验数据表明，本发明提供的引物MBoHL1F/R能够准确鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1材料，准确度为100％。

表1

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的PCR引物组及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> MBoHL1F

<400> 1

taaacaaggc tggataacaa tac 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> MBoHL1R

<400> 2

tcaccggtat gcttcttgac 20

<210> 3

<211> 1139

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> 鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的分子标记序列

<400> 3

taaacaaggc tggataacaa taccatagct tttttttttt aatttgaaac acaacccatt 60

atggccggtc ctgggcaaag cctaacgaaa cattggcgtt aggcctccaa aaattttgga 120

aaaaattaca tagaaaaaag ctcccaaaat ttgtttttta ggcccctaaa tttaccaaaa 180

aattttttag ctgaaatttt ttaaaaaccg cctgcagccc cctaaatctc agggccggcc 240

ccgagttacc catatcttct tcaactcaca attgtcttta cgaaatttag aaccaaacca 300

ttatttcttc atgtcaattt taaacattac ttttaaacca tactgatcaa atcgattaaa 360

agggaaattt cattttcaaa ttaaaggaaa tatccaagaa cttctgttta aaaaacttgc 420

aaaaatggtg gaacctacac tacatgatag ctttttctgt ggttcacgta ttttctatga 480

aaagataaca ttatttccat tattaagctt aaagtttctc ccttgctagt gtgaacattg 540

tcagtcaata tcgtcagcct tttctcttta gatacacaaa gcctctttgt aaatcattac 600

tctctagatc tcataaaatc tctgtgttct atagatcttc tctccagcgt agtaatggat 660

ctttaccttc tccttgtgat agttgctacg cttttgtgta gtagaatctt ttcttttgtt 720

tatggaaagt tcagagttca agaaaacaaa ataattgctt attctccttc atcaccatct 780

ccaccatctc ccaagtcaac tttgcctcgt aactgcatac acgatgtctt ccctagcttc 840

cacggaaaag atgtccgtaa atcctttctc agtcatcttc tgaaggagtg tgggatcaaa 900

ggaatcaacc tgttcatcga taacgagatc actagaggag agtttatcgg ccctgagctc 960

aagaaggcaa tccagggatc aagaattgcg attgtgttgc tctcgaaaag atacgcttct1020

tcctcttggt gtctcgatga gttagtggag attatgaagt gtaaggaaga gttaggtcaa1080

accgtgattc ccgttttcta taaagtggat ccaactgatg tcaagaagca gaccggtga 1139

Claims (10)

1.鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的PCR引物组，其特征在于：包括引物MBoHL1F、MBoHL1R，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

2.一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的PCR引物组。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括Taq酶和dNTP；

优选还包括甘蓝基因组DNA提取试剂。

4.权利要求1或2所述的PCR引物组、权利要求3所述的试剂盒在对甘蓝杂种致死亲本类型1进行鉴定或筛选中的应用。

5.一种分子标记在鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1中的应用，其特征在于：所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型1的方法，其特征在于：采用权利要求1或2所述的PCR引物组或权利要求3所述的试剂盒进行如下操作步骤：

(1)提取待测甘蓝材料的基因组DNA；

(2)采用引物组MBoHL1F/MBoHL1R对待测甘蓝材料的基因组DNA进行PCR扩增；

(3)检测PCR扩增产物大小：若PCR扩增产物为1139bp，则待测甘蓝为杂种致死亲本类型1；若PCR扩增产物为944bp，则待测甘蓝不是杂种致死亲本类型1。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，若PCR扩增产物为944bp，则待测甘蓝为正常材料或者杂种致死亲本类型2。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的PCR反应体系中含有：模板基因组DNA 0.2μL/μL，包含Mg²⁺的10×PCRbuffer缓冲液0.1μL/μL，dNTPs 0.2mM，Taq DNA聚合酶0.5U/μL，正向引物和反向引物0.4μM，其余为双蒸水。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用琼脂糖电泳检测PCR扩增产物的条带大小；

优选采用1％的琼脂糖在150V恒功率电泳分离30分钟。

Images