CN109234372A - 一种直接pcr法及其在甘蓝杂交种遗传育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种直接PCR法及其在甘蓝杂交种遗传育种中的应用。本发明所提供的直接PCR扩增方法是将甘蓝种子发芽4‑5天后取下胚轴直接作为模板，采用预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶通过热启动法进行PCR扩增的方法。本发明所提供的直接PCR扩增方法简单、快速、实用性强，获得的PCR检测结果准确、灵敏度高、特异性强，并且与传统的将种子发芽后取幼嫩叶片进行DNA的提取和PCR检测的方法相比，避免了提取DNA的繁杂步骤，大大地减少了检测成本和检测时间。本发明在甘蓝“苏甘20”杂交种遗传纯度鉴定方面具有很大的应用前景。

Description

一种直接PCR法及其在甘蓝杂交种遗传育种中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种直接PCR法及其在甘蓝杂交种遗传育种中的应用。

背景技术

结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)简称甘蓝，属于十字花科芸薹属甘蓝种中顶芽能形成叶球的变种，是我国重要的十字花科蔬菜之一。其营养丰富，适应性及抗逆性均较强，全国各地普遍种植，在蔬菜供应中具有举足轻重的地位。

目前，生产中推广的甘蓝品种大多数是杂交种，杂交种的生产主要是利用雄性不育系和自交不亲和系制种。但是在其制种过程中，常常由于雄性不育系能产生少量花粉以及自交不亲和系亲和指数的问题会导致母本自交产生的假杂种常混杂于F_l中，降低了种子的质量和纯度，进而给生产带来不必要的损失。因此，在杂交种用于销售和生产之前，对杂交种遗传纯度的鉴定是及其重要的。目前，杂交种真实性及纯度的鉴定方法主要有田间形态鉴定法、生化标记鉴定法和DNA分子标记鉴定法。田间形态鉴定法不仅鉴定周期长，还易受外界环境以及检测人员主观判断的影响，难以满足大规模种子纯度鉴定以及当年生产需要(石星星,纪小红,张磊,等.利用SSR标记鉴定结球甘蓝杂交种真实性及纯度.分子植物育种,2015,13(2):331-337)。生化标记鉴定法如同工酶电泳和蛋白质电泳技术其稳定性差且位点的多态性较低，难以用于杂种纯度的检测和品种鉴定。而DNA分子标记鉴定法不仅数量多、准确、快速且不受季节环境限制，已广泛应用于作物种子纯度鉴定(袁天成,司军,宋洪元,等.结球甘蓝西园六号种子纯度的SSR和SRAP鉴定.西南大学学报:自然科学版,2014,36(6):41-46)。插入缺失多态性标记(Insertion-deletion polymorphism,InDel)是在等位基因位点上一定数量的核苷酸插入或缺失而产生的长度多态性变异，是基于全基因组序列的新一代分子标记，因其在基因组中的高密度分布，具有标记特异性高、稳定性好、检测方法简单、经济等优点，目前成为甘蓝杂交种纯度鉴定的首选技术之一(朱东旭,王彦华,赵建军,等.结球甘蓝相对于大白菜连锁群特异InDel标记的建立及应用.园艺学报,2014,41(8):1699-1700)。

进行常规PCR法中制备DNA模板不仅是检测的第一步，也是保证检测结果准确与否的基础。目前主要使用CTAB法和SDS法等方法从待测样品中提取DNA作为PCR反应的模板。但DNA提取的方法操作复杂，提取时间较长，同时提取液中含有的苯酚、氯仿和异戊醇等试剂易对环境造成污染。在大规模的杂交种子纯度鉴定中，DNA模板的提取己成为检测环节中花费人力、物力和财力最多的一个环节。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种直接PCR法。

本发明的另一目的是提供该方法在甘蓝“苏甘20”杂交种遗传育种中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种直接PCR法，该方法是将甘蓝下胚轴直接作为模板，采用预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶通过热启动法进行PCR扩增的方法。

在所述方法中，所述下胚轴优选甘蓝种子发芽4-5天后的下胚轴。

为了达到更加理想的PCR效果，在本发明的一个实施例中，所述在直接PCR反应体系中的下胚轴优选以截取一段长度为1-1.5mm的下胚轴的形式存在的。

在实际应用中，所述一段长度为1-1.5mm的下胚轴浸没在所述20μ1PCR反应体系中，所述的直接PCR扩增反应体系(20μ1)中各成分的含量为：Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl₂1.5mM，dNTPs 0.2mM，上下游引物各0.5μM，预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶0.1U/μl。

在所述的方法中，直接PCR扩增程序为：98℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min延伸；10℃保存。

本发明所述的直接PCR法在甘蓝杂交种遗传育种中的应用；优选在甘蓝杂交种筛选、杂交种遗传纯度鉴定中的应用。

一种甘蓝“苏甘20”杂交种筛选方法，包括以甘蓝“苏甘20”杂交种子发芽后的下胚轴直接为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，按照本发明所述的直接PCR方法进行直接PCR；对扩增得到的DNA片段利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，对电泳条带结果进行分析，将同时具有父本特异性条带和母本特异性条带的单株判定为真正的杂交种，缺少其中任意一个条带的记为假杂种。

一种甘蓝“苏甘20”杂交种遗传纯度快速鉴定方法，包括以甘蓝“苏甘20”杂交种发芽后的下胚轴直接为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，按照本发明所述的直接PCR方法进行直接PCR；对扩增得到的DNA片段利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，对电泳条带结果进行分析，将同时具有父本特异性条带和母本特异性条带的单株判定为真正的杂交种，缺少其中任意一个条带的记为假杂种，计算杂交种遗传纯度。

本发明甘蓝“苏甘20”杂交种遗传纯度快速鉴定方法优选包括以下步骤：

(1)采用特异引物InDel 90，上游引物：SEQ ID NO.1和下游引物：SEQ ID NO.2，以甘蓝“苏甘20”杂交种子发芽4-5天后的下胚轴为模板，按照本发明所述的直接PCR方法进行直接PCR扩增；

(2)将扩增得到的DNA片段在浓度为6.0％的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，60ml凝胶中含有：Arc:Bis(29:1)16ml、5×TBE 12ml、TEMED 48μl、10％APS 0.75ml和ddH₂O31.2ml；60V电压预电泳30min后上样，在130V稳压下电泳1.5～2.0h，电泳结束后，用0.5％冰醋酸和10％乙醇固定液对凝胶固定15min；洗涤后用0.2％AgNO₃溶液染色15min；洗涤后用含有1.5％NaOH和1％甲醛的显色液显色后，洗涤后于灯箱上拍照；

(3)对电泳条带结果进行分析，将同时具有父本特异性条带和母本特异性条带的单株判定为真正的杂交种，缺少其中任意一个条带的记为假杂种，计算种子遗传纯度。

有益效果：

本发明建立了一套以甘蓝下胚轴直接作为模板进行PCR扩增的反应体系和扩增程序。该方法简单、快速、实用性强，获得的PCR检测结果准确、可靠，并且与传统的将种子发芽后取叶片进行DNA的提取和PCR检测的方法相比，由于采用了一种采用预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶通过热启动法进行PCR扩增的方法，使得PCR反应可以省去DNA提取的操作步骤，从而大大降低了检测时间和检测成本。本发明还筛选出能够在甘蓝杂交种中产生具有父母本特异条带且不受环境影响的InDel 90引物，用于甘蓝“苏甘20”杂交种的遗传纯度的鉴定，大大提高了杂交种纯度鉴定的效率，在甘蓝杂交种遗传纯度的鉴定中具有很大的应用前景和空间。

附图说明

图1对种子发芽4-5天后幼苗不同部位以及不同长度进行体系优化的PCR电泳图谱。泳道1：下胚轴(0.5-1mm)；泳道2：胚根(0.5-1mm)；泳道3：子叶(0.5-1mm)；泳道4：下胚轴(1-1.5mm)；泳道5：胚根(1-1.5mm)；泳道6：(1-1.5mm)子叶；泳道7：下胚轴(1.5-2mm)；泳道8：胚根(1.5-2mm)；泳道9：子叶(1.5-2mm)。

图2特异性引物Indel 90检测甘蓝“苏甘20”杂交种遗传纯度的PCR电泳图谱。泳道L：DL2000的分子量标准；泳道F：母本；泳道M：父本；泳道F’：母本(提取的DNA样品，对照)；泳道M’：父本(提取的DNA样品，对照)；泳道1-50：“苏甘20”杂交种；其中第28和45泳道只扩增出母本特异条带。

具体实施方式

实施例1

1、种子催芽

将甘蓝“苏甘20”杂交种放在培养皿里加水催芽，催芽4-5天后长出幼苗待用。

2、直接PCR扩增

分别截取一段长度为0.5-1mm、1-1.5mm和1.5-2mm的下胚轴、胚根和子叶在20μ1PCR反应体系(成分含量为：Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl₂ 1.5mM，dNTPs 0.2mM，上下游引物各0.5μM，预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶0.1U/μl)。采用的直接PCR扩增程序为：98℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min延伸；10℃保存。其中含有预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶的PCR预混合溶液商品名为Quick Taq HS DyeMix，厂家：东洋纺(上海)生物科技有限公司。

3、扩增产物检测

扩增产物检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，将PCR扩增产物在浓度为6.0％的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离。60ml凝胶中含有：Arc:Bis(29:1)16ml、5×TBE 12ml、TEMED48μl、10％APS 0.75ml和ddH₂O 31.2ml。60V电压预电泳30min后上样，在130V稳压下电泳1.5～2.0h，电泳结束后，用0.5％冰醋酸和10％乙醇固定液对凝胶固定15min；洗涤后用0.2％AgNO₃溶液染色15min；洗涤后用含有1.5％NaOH和1％甲醛的显色液显色后，洗涤后于灯箱上拍照记录。

4、PCR体系优化

对甘蓝“苏甘20”杂交种发芽4-5天后幼苗不同部位以及不同长度进行PCR体系优化。如图1电泳图谱条带所示，幼苗不同部位中以下胚轴作为模板的PCR效果最好，其次是胚根，次之是子叶；幼苗不同长度中以长度为1-1.5mm作为模板的PCR效果最好，其次是0.5-1mm，次之是1.5-2mm。

实施例2

1、InDel引物设计与合成

研究所用InDel引物均基于甘蓝基因组测序(http://ocri-genomics.org/bolbase/)而设计，送南京一道生物科技有限公司进行合成。

2、种子催芽

将甘蓝“苏甘20”杂交种及其父本、母本的种子分别放在培养皿里加水催芽，催芽4-5天后长出幼苗待用。

3、直接PCR扩增

分别截取一段长度为1mm的下胚轴浸没在20μ1PCR反应体系，反应体系同实施例1。4、扩增产物检测

扩增产物检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，方法同实施例1。

5、特异InDel引物的筛选

筛选出能够在父本和母本扩增出具有多态性的特异条带，并且在杂交种“苏甘20”中能够扩增出双亲互补条带的特异引物InDel 90(上游引物：5’AGCTTTTGAACAGCGCTTGC 3’(SEQ ID NO.1)和下游引物：5’TCCCCTTTTAAGACCAACACA 3’(SEQ ID NO.2))，则将该引物确定为候选引物用于杂交种“苏甘20”的纯度鉴定。

6、种子遗传纯度鉴定

使用InDel 90引物对甘蓝“苏甘20”杂交种发芽后的下胚轴进行直接PCR反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。只有同时具有父、母本特异性条带的幼苗单株判定为真正的杂交种，只要缺失其中任何一个特异条带的幼苗单株均判定为假杂种。

根据条带分析结果，计算杂交种的遗传纯度(％)。供检种子遗传纯度(％)＝[(供检幼苗数－假杂交幼苗数)/供检幼苗数]×100％。

如图2所示，50株供检幼苗中有48株能够同时扩增出母本特异条带和父本特异条带，有2株(第28泳道和第45泳道)则只能扩增出其中一条，为假杂种；按照上述公式计算得甘蓝“苏甘20”杂交种的遗传纯度为96％。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种直接PCR法及其在甘蓝杂交种遗传育种中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcttttgaa cagcgcttgc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccctttta agaccaacac a 21

Claims (10)

1.一种直接PCR扩增方法，其特征在于所述方法是将甘蓝下胚轴直接作为模板，采用预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶通过热启动法进行PCR扩增的方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述甘蓝下胚轴为甘蓝种子发芽4-5天后的下胚轴。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述甘蓝下胚轴在直接PCR反应体系中是以截取一段长度为1-1.5mm的下胚轴的形式存在的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述甘蓝下胚轴在直接PCR反应体系中的含量为每20μ1所述PCR反应体系中含有一段长度1-1.5mm的所述下胚轴。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的直接PCR扩增反应体系为：Tris-HCl10mM，KCl 50mM，MgCl₂ 1.5mM，dNTPs 0.2mM，上、下游引物各0.5μM，预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶0.1U/μl；所述的直接PCR扩增程序为：98℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min延伸；10℃保存。

6.权利要求1-5中任一所述的方法在甘蓝杂交种遗传育种中的应用；优选在甘蓝杂交种筛选、杂交种遗传纯度鉴定中的应用。

7.SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物在甘蓝“苏甘20”杂交种遗传纯度鉴定中的应用。

8.一种甘蓝“苏甘20”杂交种筛选方法，其特征在于包括：以甘蓝“苏甘20”杂交种子发芽后的下胚轴直接为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，按照权利要求1-5中任一项所述的方法进行直接PCR；对扩增得到的DNA片段利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，对电泳条带结果进行分析，将同时具有父本特异性条带和母本特异性条带的单株判定为真正的杂交种，缺少其中任意一个条带的记为假杂种。

9.一种甘蓝“苏甘20”杂交种遗传纯度快速鉴定方法，其特征在于包括：以甘蓝“苏甘20”杂交种子发芽后的下胚轴直接为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，按照权利要求1-5中任一项所述的方法进行直接PCR；对扩增得到的DNA片段利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，对电泳条带结果进行分析，将同时具有父本特异性条带和母本特异性条带的单株判定为真正的杂交种，缺少其中任意一个条带的记为假杂种，计算种子遗传纯度。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采用特异引物InDel 90，上游引物：SEQ ID NO.1和下游引物：SEQ ID NO.2，以甘蓝“苏甘20”杂交种子发芽4-5天后的下胚轴为模板，按照权利要求1-5中任一项所述的方法进行直接PCR扩增；

(2)将扩增得到的DNA片段在浓度为6.0％的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，60ml凝胶中含有：Arc:Bis(29:1)16ml、5×TBE 12ml、TEMED 48μl、10％APS 0.75ml和ddH₂O 31.2ml；60V电压预电泳30min后上样，在130V稳压下电泳1.5～2.0h，电泳结束后，用0.5％冰醋酸和10％乙醇固定液对凝胶固定15min；洗涤后用0.2％AgNO₃溶液染色15min；洗涤后用含有1.5％NaOH和1％甲醛的显色液显色后，洗涤后于灯箱上拍照；

(3)对电泳条带结果进行分析，将同时具有父本特异性条带和母本特异性条带的单株判定为真正的杂交种，缺少其中任意一个条带的记为假杂种，计算种子遗传纯度。