CN107200775A - 一种提高水稻柱头外露率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水稻分子育种技术领域。具体涉及一种提高水稻柱头外露率的方法。本发明利用GS3基因dCAPS标记SF28和GW5基因STS标记Indel1或Indel2或N1212，对533份栽培稻全基因组进行关联分析，定位了3个影响柱头外露的QTL，转基因验证确认GS3和GW5基因是影响水稻柱头外露的主效基因，GS3和GW5基因存在连锁不平衡，通过调控种子大小和柱头长度影响水稻的柱头外露率。

Description

一种提高水稻柱头外露率的方法
技术领域
本发明属于水稻分子育种技术领域。具体涉及一种提高水稻柱头外露率的方法。本发明利用GS3基因dCAPS标记SF28和GW5基因STS标记Indel1或Indel2或N1212，对533份栽培稻进行全基因组关联分析，定位了3个影响柱头外露的QTL，转基因验证确认GS3和GW5基因是影响水稻柱头外露的主效基因，GS3和GW5基因存在连锁不平衡，通过调控种子大小和柱头长度影响水稻的柱头外露率。
背景技术
水稻是我国的主要粮食作物，而水稻的自交机制导致杂交水稻制种效率低下。生产中杂交水稻制种是通过雄性不育系(母本)和雄性不育系恢复系(父本)人工种植，实现异花授粉结实的大田生产过程。由于制种效率低下，生产中需要大量种植雄性不育系和雄性不育系的恢复系来获得足够的杂交种子。这不仅造成了资源的浪费，还影响了杂交水稻的推广。研究表明，不育系柱头外露颖花结实是异交结实的主体也是结实稳定的基础，不育系柱头外露率越高，就越有利于异交过程的进行，制种产量自然得到提高(Tian etal.2004)。利用水稻自身的柱头外露基因来培育高柱头外露率的雄性不育系是提高杂交水稻制种产量的有效方法。
迄今，研究人员利用不同的分离群体，基于连锁分析，定位了许多影响柱头外露率的QTL。然而这些QTL对柱头外露率的效应都非常小，并且没有通过转基因来验证这些QTL的效应，所以都无法有效的运用到生产实践中。Li et al.(2014)利用中国香稻和川香29B的重组自交系定位到了两个QTL，qSE1和qSE6，在近等基因系中能够影响20％左右的柱头外露率。除了利用常规作图，还有学者利用BSA法或者关联分析进行柱头外露QTL的定位(Yan etal.2009)。最近,Liu et al.(2015)利用日本晴和Kasalath构建的染色体片段代换系将一个影响柱头长度的QTL，qSTL3。这些QTL虽然报道影响水稻柱头外露率，但是效应都很小。另一方面，没有转基因验证，并且缺乏功能性分子标记，根本无法用于水稻柱头外露率的改良。因此迫切需要挖掘主效的、经过转基因验证的并且具备有效的功能性分子标记的柱头外露基因，并将其导入到雄性不育系中以增强其柱头外露率。
近年来，随着测序技术的发展和高密度SNP标记的开发，关联分析成为挖掘植物数量性状最强力的方法。与连锁分析相比，关联分析能够从自然群体中快速挖掘出广谱和主效的QTL，并且精度高。水稻的柱头外露与番茄等植物不同，它不仅跟柱头的长度相关，还受到颖壳的形状，开花的角度还有激素水平等因素的影响。因此，柱头外露作为复杂的数量性状尤其适合运用全基因组关联分析的方法来研究其遗传基础。
目前，还没有报道柱头外露基因被用于水稻育种而在生产上应用。已有证据表明生产上一些优良的不育系因为柱头外露率低，造成制种困难的现象。通过分子标记辅助选择聚合多个影响柱头外露的基因能够显著的提高柱头外露率从而解决这一问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高水稻柱头外露率的方法，通过实验检测这些柱头外露基因的功能标记，可以在苗期就准确预测水稻植株的柱头外露水平，从而加快高柱头外露水稻家系的选择进度。
本发明利用GS3基因dCAPS标记SF28和GW5基因STS标记Indel1或Indel2或N1212，对533份栽培稻进行全基因组关联分析，定位了3个影响柱头外露的QTL，转基因验证确认GS3和GW5基因是影响水稻柱头外露的主效基因，GS3和GW5基因存在连锁不平衡，通过调控种子大小和柱头长度影响水稻的柱头外露率。
本发明鉴定了两个广泛变异且主效的柱头外露基因，并提供了功能性的分子标记。借助这些分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)可以有目的地将柱头外露基因精确导入和聚合，从而高效率快速选育柱头外露率高的雄性不育系，节约人力物力，保持水稻杂交制种的稳产和高产。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人通过利用报道基因GS3(登陆号Os03g0407400)的功能性分子标记SF28通过PCR扩增，然后经过限制性内切酶Pst 1处理以检测该基因的基因型，所述分子标记引物的序列如下所示：
左端引物序列(SF28F)，TATTTATTGGCTTGATTTCCTGTG，
右端引物序列(SF28R)，GCTGGTTTTTTACTTTCATTTGCC；
申请人通过另一个报道基因GW5(登陆号Os05t0187500)的功能性分子标记N1212通过PCR扩增以检测该基因的基因型，该分子标记引物的序列如下所示：
左端引物序列(N1212F)，CGTCTTGCAACCAACGCCGATGTTATAC，
右端引物序列(N1212R)，GAGCGTGTAGGGAAGGAGCTGCATGA；
申请人通过验证，证明上述两个分子标记(SF28和N1212)可以应用于选育高柱头外露率水稻家系的遗传改良。
申请人提供了一种筛选水稻柱头外露主效基因GS3的分子标记方法，其步骤为：利用柱头外露率主效基因GS3的分子标记(SF28)扩增待检水稻基因组DNA，并检测所得的扩增产物，能被标记引物SF28扩增出511bp的DNA片段并且不能被Pst1酶水解，证明水稻柱头外露率主效基因GS3的增效等位基因gs3的存在。
与此同时，申请人提供了另一种筛选水稻柱头外露率主效基因GW5的分子标记方法，其步骤为：利用柱头外露率主效基因GW5的分子标记(N1212)扩增待检水稻基因组DNA，并检测所得的扩增产物，能被标记引物N1212扩增出1963bp的DNA片段，证明着水稻柱头外露率主效基因GW5的增效等位基因GW5的存在。
进一步，申请人还提出了利用柱头外露率主效基因GS3和GW5的分子标记在水稻柱头外露率改良中的应用的方法，该方法包括用于筛选高柱头外露率水稻：在杂交分离后代中，利用上述GS3的功能性标记引物(SF28)扩增待检水稻的基因组DNA，并检测所得的扩增产物，若扩增产物的片段与上述检测结果一致且无法被Pst 1酶水解，证明杂交后代中存在柱头外露率主效基因GS3增效等位基因gs3；和通过GW5的功能性引物(N1212)扩增待检水稻的DNA，若扩增产物的片段与上述检测结果一致，证明杂交后代中存在外露率主效基因GW5的增效等位基因GW5；两个基因呈现出GW5gs3的基因型组合代表杂交分离后代具有高柱头外露率。
本发明的具体技术方案如下：
从亚洲栽培稻种质材料中筛选得到两个广谱且主效的柱头外露率位点的主效基因GS3和GW5在提高水稻柱头外露率中的应用，所述的GS3基因编码的蛋白质序列如SEQ IDNO：2所示，所述的GW5基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示。
一种柱头外露率主效基因GS3和GW5的高柱头外露率基因型组合GW5gs3在提高水稻柱头外露率改良中的应用，所述的GS3基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，所述的GW5基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示。
一种分子标记SF28在水稻柱头外露率性状辅助选择中的应用，所述的分子标记SF28核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
一种分子标记N1212在水稻柱头外露率性状辅助选择中的应用，其特征在于，所述的分子标记N1212的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
一种利用分子标记改良水稻柱头外露率性状的辅助选择的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将鉴定为性状优良的水稻两系不育系(简称两系。本领域公知常识：水稻两系不育系是指水稻光(温)敏核不育系，兼具不育系和保持系特征，一系两用)和水稻三系不育系(简称三系。本领域公知常识：水稻三系不育系是指水稻核质互作不育系，需要相应的保持系来保持不育系的不育特征)骨干不育系分别与具有高柱头外露率基因型组合GW5gs3的栽培稻明恢63杂交，分别得到(基因型)F1A和(基因型)F1B材料；
(2)以步骤(1)中得到的F1A与两系骨干不育系连续回交5代，每代利用分子标记SF28和N1212鉴定真杂种，直到获得近等基因系BC5F1A；以步骤(1)中得到的F1B与两系骨干不育系连续回交5代，每代利用分子标记SF28和N1212鉴定真杂种，直到获得近等基因系BC5F1B材料；
(3)将BC5F1A自交得到BC5F2A，利用分子标记SF28和N1212鉴定出基因型为纯合基因型组合GW5gs3的单株，即为改良后的两系不育系；将BC5F1B自交得到BC5F2B，利用分子标记SF28和N1212鉴定出基因型为纯合基因型组合GW5gs3的单株，即为改良后的三系不育；
其中：
分子标记SF28的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
分子标记N1212的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
本发明的优点在于：
(1)本发明鉴定了两个主效的柱头外露率基因GS3和GW5。GS3和GW5单个基因能够提高柱头外露率20％以上，两个基因聚合能够提高柱头外露率30％以上，而前人定位的柱头外露率QTL都是微效的，效应一般小于10％。
(2)本发明鉴定的两个柱头外露率主效基因经过了遗传转化验证。利用GS3和GW5的转基因材料，申请人验证了这两个基因能够有效的提高水稻的柱头外露率。其中GS3通过控制水稻的柱托长度来影响柱头外露率，而GW5通过控制水稻颖花的宽度和厚度来影响柱头外露率。前人研究都缺乏转基因验证，并且无法知道基因的确切功能。
(3)本发明提供了柱头外露率主效基因GS3和GW5的功能性分子标记。功能性的分子标记检测水稻植株中的柱头外露率基因位点，仅在苗期就能快速鉴定出高柱头外露率的纯合基因型单株，及时淘汰低柱头外露率单株，不仅节约生产成本，而且大大提高了选择效率，极大地缩短水稻品种的育种周期。而前人研究都没有提供柱头外露率基因的功能性分子标记。
附图说明
图1：是本发明的总体技术路线图。
图2：检测得到533份亚洲栽培稻柱头外露率的频次分布图。附图标记说明：图2中的A-F图为柱头单露(图2中的A图和图2中的D图)、柱头双露(图2中的B图和图2中的E图)和柱头总露(图2中的C图和图2中的F图)两年的表型分布。
图3：全基因关联分析检测到GS3、GW5和GW2基因的曼哈顿图及Q-Q图。混合线性模型的-log10P值用来画曼哈顿图和Q-Q图。附图标记说明：图3中的A图为柱托长度；图3中的B图为柱头单露；图3中的C图为柱头双露。
图4：本发明转基因用到的起始质粒pCambia1301和超表达载体的质粒图。附图标记说明：图4中的A图是起始质粒pCambia1301的质粒图；图4中的B图是本发明构建的超表达载体的质粒图。
图5：转基因材料验证GS3、GW5和GW2基因对柱头外露率的影响。附图标记说明：图5中的A-F，三组转基因材料两年柱头外露率表型。图5中的G-L图是三组转基因材料两年柱头大小表型；横坐标分别为柱头长度(STL)、柱托长度(SYL)和柱头宽度(STW)。所有的P值都基于两尾t测验。
图6：GS3和GW5在栽培稻中的组合效应。附图标记说明：图5中的A图为四种组合的柱头单露(SSE)，柱头双露(DSE)和柱头总露(TSE)；图5中的B-C图为四种组合的千粒重、产量和实粒数；图5中的D图为8个亚群的柱头外露率水平；图5中的E图为8个亚群中四种组合的频率；图5中的F图为8个亚群的产量水平。图5中的G图为GS3和GW5间连锁不平衡结构；其中：LD由r2表示，白色代表r2＝0，灰度代表0<r2<1，黑色代表r2＝1。上三角代表未经处理的LD结构，下三角代表消除群体结构影响后的LD机构。
图7：GS3和GW5四种组合在3395份栽培稻不同亚群中的含量测定结果。
图8：GS3和GW5在水稻两系和三系不育系柱头外露率改良分子标记辅助选择育种的流程图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明的总体技术路线如下所述
本发明按照以下总体技术路线：1)基因精细定位；2)基因功能验证和效应分析(见图1)。
1)基因的精细定位是按照遗传学上常用的全基因组关联分析的方法而实施的(具体内容参见实施例1)。
首先是材料的选择。关联分析的群体一般选择自然群体，在植物中通常选择自交系或者自交系构建的F1群体。群体的材料的选择一般追求广泛的遗传多态性或目的性状的广泛变异，也有基于特定目的对区域材料或单一亚群的材料进行选择的情况。其次是目的性状的考察。表型考察首先要建立可靠的性状考察和度量的机制。对目的性状进行多年重复的考察，用以估计和降低环境的影响，增加试验的可靠性。再次是结合表型和基因型进行关联分析。目前关联分析中比较常用的模型包括简单线性模型和混合线性模型。近年来对于不同的物种，以及不同的群体结构和遗传变异等，许多群体遗传学家开发出新的统计模型。一般至少采用简单模型和混合线性模型进行关联分析，两中模型可以互相验证。最后是候选基因的预测。这一步可以通过候选基因的关联分析进一步锁定基因位置，或者根据参考基因组注释信息以及同源基因比对等方法锁定。
2)基因的功能验证采用的是基因克隆过程中公认的遗传转化的方法实施的(具体参考实施例2)。
遗传转化的准备工作分为两步同时进行：一是受体细胞的培养；二是目的基因的制备。图位克隆过程中的遗传转化，一般选择选择受体亲本作为转化对象。在水稻中，粳稻的转化效率远高于籼稻，所以在很多情况下都是选择粳稻材料做为转化对象。首先对受体材料的糙米进行接种组织培养、待诱导分化愈伤后进行继代培养。与此同时要构建表达载体和将目的片段克隆到表达载体。接下来选择优质的愈伤进行预培养，就可以利用纯化后的载体进行农杆菌转化或其他转化方法。转化后的细胞首先要通过筛选，选择阳性的进行植株再生。再生植株要经过表型和基因型的鉴定，直到后代分离出单拷贝的阳性和阴性植株。通过对阳性阴性材料的随机区组种植和表型考察确定目的基因的效应。
基因效应分析利用多态性广泛的栽培稻种质资源，研究目的基因不同单倍型的效应。通过分析目的基因在种质材料中的单倍型，分析单个基因的效应和组合效应。另一方面要研究这些基因对农艺性状的影响。通过群体遗传学的分析，可以估计这些基因收到选择的情况，判断育种家在育种过程中是否选择过这些基因。
实施例1：柱头外露率主效基因GS3和GW5的定位
1. 533份核心种质材料的全基因组测序
本实施例收集了533份来自世界范围的多样性栽培稻材料包括地方品种和优良种质资源，其中包含200份中国微核心种质资源，132份国际水稻分子育种计划的亲本系，148份来自美国农业部水稻基因库品种，18份用于稻种SNP计划中开发SNP的品种和35份世界范围收集的国际水稻研究所提供的种质。所有的基因组DNA都是利用常规CTAB法(Murray&Thompson 1980Nucleic Acid Res 8:4321-4325)提取自植株的叶片组织。具有450-500bp大小的双末端测序文库的构建参照Illuminate标准流程。Illuminate HiSeq 2000测序平台产生大量90-bp大小的初始序列双末端序列，通过去除适应性污染和低质量序列(碱基质量保证低于50％碱基≤5)后，平均对于533份材料中每份产生了约1Gb的序列。所有文库的构建、测序和过滤都由中国深圳华大基因研究院(请写正确的全称)完成。533份世界来源的栽培稻多样性种质，通过Illuminate HiSeq 2000测序后，每份材料获得了约1GB的高质量序列，总共产生了67亿90-bp双末端序列。
2.基因型鉴定和群体结构分析
利用BCFtools获得材料的基因型后，申请情人剔除了3个高度杂合的材料和1个低基因组覆盖率的材料，剩下的529个材料用于后续研究。只有529份材料中有多态性的SNPs用于基因型的补全。基因型的补全基于谢为博提出的最临近算法(Chen et al.2014)。在之前研究中(Zhao et all.2015)，利用ADMIXTURE软件来估算群体的遗传结构，将529份材料划分为105份indica II(IndII)、98份indica I(IndI)、92份indica中间型(Ind)、46份aus(Aus)、14份中间型I型(VI)、18份中间型II型(Admix)、44份tropica japonica(TrJ)、91份temperate japonica(TeJ)和21份japonica intermediate(Jap)。构建亲缘关系树和关联分析用到的亲缘关系矩阵的估计是利用Plink软件计算。
3.柱头外露率表型鉴定
将533份核心种质材料于2012年和2013年5月到10月连续两年种植于湖北省武汉市华中农业大学试验田(地理坐标为北纬30.49度，东经114.36度)。每份材料种植3行共36株，株行距为10cm×10cm。去除两头的边际效应从中间30株中随机选择10株来测定试验的均值。谷壳颜色在谷子完全成熟的时候在田间考察。
对于花器性状的考察，申请人在植株开花的时候对每个材料选取20多朵盛开的颖花。颖尖颜色、柱头颜色和芒等性状的考察基于这些颖花。柱头相关性状的考察首先要仔细的将柱头从颖壳中剥离，然后在光学显微镜下观察并拍照。接下来利用软件Image J来考察并记录柱头长度、柱头宽度、柱托长度、柱头夹角和柱托夹角五个柱头相关性状。对于每一份材料的上述性状需要考察10个以上的柱头，用来进行均值和标准差分析。果皮颜色在种子脱壳后考察。
柱头外露率的度量计算按以下公式：
总颖花数＝单露颖花数+双露颖花数+未露颖花数
柱头单露率(％)＝(单露颖花数/总颖花数)×100％
柱头双露率(％)＝(双露颖花数/总颖花数)×100％
柱头总露率(％)＝[(双露颖花数+单露颖花数/2)/总颖花数]×100％
每份材料随机选择8个主穗考察并计量柱头外露率，然后计算均值。所有柱头及其相关性状的表型和相关性参见表1。其中柱头长度、柱托长度和柱头外露率正相关，柱头宽度和柱头外露率负相关。柱头外露率中，单露、双露和总露高度相关。柱头外露率呈现偏分分布，表现为栽培稻柱头外露率普遍偏低(见图2)。
表1 533份栽培稻柱头外露率相关性状表型变异和相关系数
对角线以上为表型参数，对角线以下为相关系数。**，P<0.01；*，P<0.05。
4.全基因组关联分析
首先申请人对关联分析用到的SNPs进行过滤，剔除MAF(Minor allelefrequence)<5％和缺失值超过20的SNPs，最后得到520万高质量的SNPs用于估计群体结构和亲缘关系。申请人分别在籼稻亚群、粳稻亚群和总的群体中利用简单线性模型和混合线性模型对柱头外露率及其相关性状进行全基因组关联分析。水稻LD衰退缓慢，群体机构复杂，因此关联分析用到较多软件以互相比较，其中简单线性模型(LR)和混合线性模型(LMM)都是利用软件FaST-LMM分析(Lippert et al.2011)。对于位点的显著程度，籼稻亚群、粳稻亚群和总群阈值分别为2×10-7、3×10-7和6×10-7。在检测到的峰值中，申请人参照“日本晴”6.1参考基因组列出最显著SNPs上下100kb内的基因，便于锁定目标基因。对于柱头外露率及其相关性状申请人检测到50多个超过阈值的显著位点，许多位点在多个亚群或两年重复检测到(见表2和图3)。其中GS3在柱托长度、柱头单露和总露中检测到，GW5在单露双露和总露中都检测到。
表2柱头外露率及相关性状全基因组关联分析显著位点
a关联位点混合线性模型的P值；b关联位点线性回归模型的P值；c峰值SNPs的主要/次要位点；d次要位点频率。
实施例2：GS3和GW5的功能验证和效应分析
1.GS3和GW5的功能验证
这一步工作大部分建立在前人的工作基础之上。为了验证三个粒型基因对柱头外露率的效应，申请人用三组转基因材料。其中GW5 OX(+)和GW5 OX(-)由中国农业科学院作物科学研究所的万建民老师提供(Wan et al.2008)；GW2(cDNA)和对照由中科院上海植物生理生态研究所的林鸿宣老师提供(Song et al.2007)；GS3 OX(+)和GS3 OX(-)来源于华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室之前的研究(Mao et al.2010)。转基因用到的质粒和超表达载体的构建如图4所示。所有转基因材料于2013年和2014连续两年随机区组种植3个重复，每个重复12个单株。每个重复中间10株随机取30朵盛开的颖花用于柱头性状的考察，完全开花后每个单株选取一个主穗进行柱头外露率的考察。柱头外露率和相关性状的考察方法与前文核心种质的考察方法一致。结果表明，三组转基因植株阴性和阳性表型差异显著。GS3超表达阴性材料比阳性材料柱头外露率高66-76％；超表达GW5能提高17-24％的柱头外露率；GW2抑制材料柱头外露率高于对照5-12％(图5的A-F图)。三组转基因材料的阴性和阳性植株的柱头大小差异也很显著，且各有不同。超表达的GS3会导致柱托变短和柱头变粗；超表达GW5增加柱头、柱托长度和柱头宽度；抑制的GW2整体的柱头较对照更大(图5的G-L图)。
2.GS3和GW5对栽培稻柱头外露率和农艺性状的影响
(1)通过线性逐步回归，可以计算出多个显著位点联合解释的遗传变异率。申请人同时利用了线性回归和混合线性回归来计算影响柱头外露率的显著位点联合解释的遗传变异。在回归分析前，先要进行基因型数据化，即将每一个SNP的基因型记录为0和1两种。为了避免多重共线性对分析的影响，还需对数据进行转化以消除共线性。每一步回归利用AIC(Akaike information criterion)信息准则评价模型的拟合程度。每增加一个标记，需该标记F测验的P<0.05。回溯的过程中，显著程度最低的标记会被剔除。最后最优模型计算出R2值为所有位点解释的总的变异率。对影响柱头外露率的11个峰值SNPs进行分析发现它们利用线性回归模型和混合线性模型分别能解释柱头外露率60.1％和36.8％的遗传变异。533份材料GS3和GW5的基因型利用本发明的发明内容中叙述的功能性分子标记SF28和N1212进行鉴定。然后进行回归分析发现GW5能够解释柱头外露率24％的遗传变异，GS3能够解释20％，二者联合解释30％的遗传变异(见表3)。
表3两种模型计算GS3和GW5对柱头外露率的效应
(2)将533份材料的种子成熟后按单株全收，自然风干保存三月以后用于农艺性状的考察。饱满成熟的种子用来考察粒型。粒长粒宽通过10粒种子竖排和横排进行测量3个重复，然后换算成单粒长宽。千粒重通过每个家系测量200粒种子的重量换算成千粒重。GS3和GW5组成四种组合GW5gs3、GW5GS3、gw5gs3和gw5GS3，通过方差分析比较四种组合对柱头外露率相关性状和农艺性状的影响。结果表明四种组合显著影响柱头外露率(图6中的A图)。四种组合中GW5gs3为最优势组合，它具有最高的产量和最高的柱头外露率；gw5GS3为劣势组合，它具有最低的产量和最低的柱头外露率。进一步研究发现GW5gs3具有高水平的单株实粒数和中等的粒重，因而具有最高的产量(见图6中的B图、C图)。通过分析不同亚群的柱头外露率和产量的差异，发现四种组合的含量与亚群的柱头外露率和产量具有一定的相关性(见图6中的D-F图)。
3.群体遗传学分析表明GW5gs3受到选择
(1)两个不连锁的基因的连锁不平衡(LD)的计算可以通过计算两个基因位点频率的相关性的平方(r2)来度量。然而这种长远的LD很有可能是由群体或者家系结构导致，所以申请人还需要利用亲缘关系消除群体结构的影响。比较消除前后的结果，可以判断两个基因间是否因为选择而存在长远的LD。申请人利用GS3的7kb的序列和GW5的3.3kb的序列来研究它们的连锁不平衡(见图5G)。在考虑群体结构以前，GS3和GW5之间存在一定的连锁不平衡。利用亲缘关系矩阵消除群体结构的影响后，它们之间的连锁不平衡程度还增强了。这表明这两个基因可能因为受到选择而存在连锁不平衡。
(2)通过计算基因不同单倍型的π值可以分析出基因在演化过程中受到选择的方向。结合了云之稻3000份材料的数据(Li et al.2014)和Huang et al.(2012)的数据，申请人比对出来2866份材料的GS3和GW5的基因型。结合已有材料，申请人将群体扩大到3395份材料，发现四种组合在不同亚群中的含量
表4 GS3和GW5四种组合在3395份栽培稻中不同亚群的多态性
a亚群内包含不同组合栽培稻的种类个数；bGS3和GW5不同组合的多态性水平。
差异更加明显(图7)。通过等式计算不同组合和不同基因型的π值，申请人发现GW5gs3的π值远低于其它组合(见表4)。因此GW5gs3在栽培稻中是受到选择的。目前gw5GS3这种组合在栽培稻中超过50％，因此利用GW5gs3提高水稻柱头外露率具有广阔前景。
实施例2：GS3和GW5在不育系柱头外露率改良中的应用
本发明定位到的GS3和GW5为广谱且主效的柱头外露率基因，能有效的提高生产中雄性不育系的柱头外露率，在制种过程中可以降低不育系和恢复系的种植面积、简化制种流程、节约人力物力和提高制种效率。因此将水稻种质材料(例如本实验中533份栽培稻)中具有GS3和GW5优势基因型组合(GW5gs3)的材料用于不育系柱头外露率的改良，具有十分广泛的应用前景。本实施例的技术路线可参见图8，图8是申请人设计的利用GS3和GW5优势基因型组合GW5gs3改良不育系柱头外露率的总技术流程：首先选择生产上柱头外露率不高的骨干两系和三系不育系各一个(这些“骨干不育系”都是可以得到的，在生产上具有优良性状而柱头外露率低的不育系)，和具备优势基因型组合GW5gs3的栽培稻材料(例如明恢63)进行杂交，分别得到两系不育系杂交种F1代(或称F1A)和三系不育系杂交种F1代(或称F1B)；F1A与两系骨干不育系连续回交5代获得近等基因系，每代利用分子标记SF28和N1212选择这两个位点的真杂种单株，直到BC5F1A，相对应的，F1B与三系骨干不育系连续回交5代获得近等基因系，每代利用分子标记SF28和N1212选择这两个位点的真杂种单株，直到BC5F1B；两系不育系和三系不育系的近等基因系BC5F1A和BC5F1B分别自交，获得BC5F2A和BC5F2B；利用SF28和N1212鉴定出BC5F2A中具有纯合GW5gs3基因型组合的单株，即为柱头外露率改良后的两系不育系，利用SF28和N1212鉴定出BC5F2B中具有纯合GW5gs3基因型组合的单株，即为柱头外露率改良后的三系不育系。
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SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 一种提高水稻柱头外露率的方法
<130>
<141> 2017-01-17
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<170> PatentIn version 3.1
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<223>
<220>
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<222> (1)..(699)
<223>
<400> 1
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Met Ala Met Ala Ala Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Ala Pro Pro
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gac cca tgc ggc cgc cac cgc ctc cag ctc gcc gtc gac gcg ctc cac 96
Asp Pro Cys Gly Arg His Arg Leu Gln Leu Ala Val Asp Ala Leu His
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cgc gag atc gga ttc ctc gag ggt gaa ata aat tca atc gaa ggg atc 144
Arg Glu Ile Gly Phe Leu Glu Gly Glu Ile Asn Ser Ile Glu Gly Ile
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cac gct gcc tcc aga tgc tgc aga gag gtt gac gaa ttc atc gga aga 192
His Ala Ala Ser Arg Cys Cys Arg Glu Val Asp Glu Phe Ile Gly Arg
50 55 60
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Thr Pro Asp Pro Phe Ile Thr Ile Ser Ser Glu Lys Arg Ser His Asp
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cat tct cac cac ttc ttg aag aag ttt cgc tgt ttg tgc aga gca agt 288
His Ser His His Phe Leu Lys Lys Phe Arg Cys Leu Cys Arg Ala Ser
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gcg tgc tgc ctc agc tac ctc tcc tgg atc tgc tgc tgc agc agc gcc 336
Ala Cys Cys Leu Ser Tyr Leu Ser Trp Ile Cys Cys Cys Ser Ser Ala
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gcc ggc ggc tgc tca tcc tcc tcc tcc tcc tcc ttc aac ctc aag agg 384
Ala Gly Gly Cys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Asn Leu Lys Arg
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Pro Ser Cys Cys Cys Asn Cys Asn Cys Asn Cys Cys Ser Ser Ser Ser
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tcc tca tgt ggg gcg gcg tta acg aag agt ccg tgt cgc tgc cgc cgc 480
Ser Ser Cys Gly Ala Ala Leu Thr Lys Ser Pro Cys Arg Cys Arg Arg
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Arg Ser Cys Cys Cys Arg Arg Cys Cys Cys Gly Gly Val Gly Val Arg
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gcg tgc gcg agc tgc agc tgc tcc ccg ccg tgc gcg tgc tgc gcg ccg 576
Ala Cys Ala Ser Cys Ser Cys Ser Pro Pro Cys Ala Cys Cys Ala Pro
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Pro Cys Ala Gly Cys Ser Cys Arg Cys Thr Cys Pro Cys Pro Cys Pro
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Cys Trp Arg Trp Met Gln Gln Glu Arg Cys Ala Gly Asp Asp Thr Arg
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<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(24)
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<400> 8
gagcgtgtag ggaaggagct gcatga 26

Claims (5)

1.从亚洲栽培稻种质材料中筛选得到的两个广谱、主效的柱头外露率位点的主效基因GS3和GW5在提高水稻柱头外露性状育种中的应用，其特征在于，所述的GS3基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，所述的GW5基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示。
2.柱头外露率主效基因GS3和GW5的高柱头外露率基因型组合GW5gs3在提高水稻柱头外露率性状改良中的应用，其特征在于，所述的GS3基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，所述的GW5基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示。
3.一种分子标记SF28在水稻柱头外露率辅助选育中的应用，其特征在于，所述的分子标记SF28核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
4.一种分子标记N1212在水稻柱头外露率辅助选育中的应用，其特征在于，所述的分子标记N1212的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
5.利用分子标记改良水稻柱头外露率性状的辅助选择的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将鉴定为性状优良的水稻光(温)敏核不育系(两系)和水稻核质互作不育系(三系)的骨干不育系分别与具有高柱头外露率基因型组合GW5gs3的栽培稻明恢63杂交，分别得到基因型为F1A和F1B的材料；
(2)以步骤(1)中得到的F1A与两系骨干不育系连续回交5代，每代利用分子标记SF28和N1212鉴定真杂种，直到获得近等基因系BC5F1A；以步骤(1)中得到的F1B与两系骨干不育系连续回交5代，每代利用分子标记SF28和N1212鉴定真杂种，直到获得近等基因系BC5F1B；
(3)将BC5F1A自交得到BC5F2A，利用分子标记SF28和N1212鉴定出基因型为纯合基因型组合GW5gs3的单株，即为改良后的两系不育系；将BC5F1B自交得到BC5F2B，利用分子标记SF28和N1212鉴定出基因型为纯合基因型组合GW5gs3的单株，即为改良后的三系不育系；
其中：
分子标记SF28的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
分子标记N1212的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
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