CN109504792A - 一种与水稻柱头外露相关的分子标记及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与水稻柱头外露相关的分子标记及其筛选方法和应用，该方法以高柱头外露率材料为母本，与低柱头外露率材料进行杂交；在其F3代，选择柱头外露率表现为极高与极低的植株进行混池测序，并通过ΔSNP‑index与ED分析，定位QTL，再在该QTL内，选出非同义突变位点、无义突变位点和移码突变位点；然后，通过母本与已知种质资源库中的低柱头外露率材料进行比对分析，排除部分突变位点，并进一步利用种质资源库中的材料进行关联分析，最终找到与水稻柱头的外露性状相关的分子标记。

Description

一种与水稻柱头外露相关的分子标记及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，尤其涉及一种与水稻柱头外露相关的分子标记及其筛选方法和应用。
背景技术
自然界中，根据性状各自的特点可将性状细分为质量性状和数量性状。质量性状在分离群体中表型呈现为不连续变异，这类性状一般是由单基因控制的，且不易受环境影响；而数量性状的遗传基础则较为复杂，在分离群体中表现为连续分布，这类性状往往由多基因调控，且易受环境因素的影响。
水稻的柱头外露也是多基因控制的数量性状，研究者利用现代分子技术和遗传连锁图谱也定位了很多控制柱头外露性状的QTL。据初步统计，有关水稻柱头性状的QTL已报道检测出50多个，包括柱头单外露率、柱头双外露率和柱头总外露率性状的QTL，但单个QTL的贡献率一般都在10％左右。
Miyata et al.(Miyata M,Yamamoto T T,Nitta N.Marker-assisted selectionand evaluation of the QTL for stigma exsertion under japonica rice geneticbackground[J].Theoretical&Applied Genetics,2007,114(3):539-548.)在籼粳F2群体中定位到一个控制柱头外露率的QTL，qES3，该QTL位于第3染色体，其加性效应为0.20，表型贡献率为31.63％，来源于籼稻的基因增加性状值。这也是目前为止已知的对水稻柱头外露率贡献率最高的QTL。
对比发现，Yamamoto et al.(Yamamoto,T.,Takemori,N.,Sue,N.et al.QTLanalysis of stigma exertion in rice.Rice Genetics Newsletter.2003,20,33-34.)和Miyata et al.(Miyata M,Yamamoto T T,Nitta N.Marker-assisted selection andevaluation of the QTL for stigma exsertion under japonica rice geneticbackground[J].Theoretical&Applied Genetics,2007,114(3):539-548.)在第3染色体上定位的QTL是相一致的。同时值得注意地是，该区间也是已经克隆的水稻粒长基因GS3所在的位置(Fan C,Xing Y,Mao H,et al.GS3,a major QTL for grain length and weightand minor QTL for grain width and thickness in rice,encodes a putativetransmembrane protein[J].Tag.theoretical&Applied Genetics.theoretische UndAngewandte Genetik,2006,112(6):1164.)。Takano-Kai et al.(Takano-Kai N,Doi K,Yoshimura A.GS3participates in stigma exs ertion as well as seed length inrice[J].Breeding Science,2011,61(3):244-250.)通过GS3转基因的方法证明了GS3通过抑制细胞分裂，进而缩短柱头SNBP(Stigma Non-brush-shaped Part)的长度，最终降低了柱头外露。
BSA-seq是近年来兴起的一种快速简单的性状定位的方法，它借助高通量测序对数量性状位点进行定位。此方法通过对常用的定位群体，比如F2，RIL群体中的极端表型的10～50个单株组成的池进行全基因测序，以两亲本的一个作为参考基因组对两个池进行分析，找到两个池中的SNP，计算每个SNP的SNP-index，根据ΔSNP-index和ED的分布进行QTL的预测。
BSA-seq具有以下优点：BSA-seq仅对极端表型个体进行检测，可以减少所需检测生物个体的数量，进而减少分析的费用；其次，与传统定位方法比较，可以大大降低人力与时间成本，快速获得性状定位结果；BSA-seq不受亲本的限制，多种群体均可进行性状定位研究。
发明内容
本发明提供了一种与水稻柱头外露相关的分子标记及其筛选方法和应用，通过本发明筛选方法获得的分子标记对于水稻柱头外露性状具有更佳的主效性，可用于水稻高柱头外露率水稻的筛选。
具体技术方案如下：
一种水稻柱头外露率相关分子标记的筛选方法，包括以下步骤：
(1)以高柱头外露率水稻为母本，低柱头外露率水稻为父本，进行杂交，获得F1代；F1代自交后，得到F2代分离群体；从F2代中选取柱头外露率>70％～95％的高柱头外露率植株和柱头外露率<2％～5％的低柱头外露率植株，按单株收取种子，并按单株分小区种植，获得F3代；
(2)在F3代种植的小区中，选取分离程度小的小区，对上述小区内的植株进行取样；取样时，将柱头外露率>70％～95％的高柱头外露率植株作为高柱头外露率池材料，柱头外露率<2％～5％的低柱头外露率植株作为低柱头外露率池材料；
(3)取高柱头外露率植株的叶片、低柱头外露率植株的叶片和亲本植株的叶片，分别提取叶片的基因组DNA，然后分别将高、低柱头外露率材料的DNA等量混池成高柱头外露率池和低柱头外露率池，之后进行极端性状混池重测序，获得高柱头外露率样本池、低柱头外露率样本池和亲本的测序序列；再以高柱头外露率亲本的序列为参考序列，对高柱头外露率池和低柱头外露率池通过极端性状混池重测序获得的序列进行ΔSNP-index和ED分析，得到与柱头外露率相关的QTL；
(4)从步骤(3)所述QTL中选出在双亲中存在差异的所有非同义突变位点、无义突变位点和移码突变位点；
(5)选取若干已知柱头外露率低的水稻材料，获取步骤(4)中所述的非同义突变位点、无义突变位点和移码突变位点相对应的所述水稻材料变异位点，将高柱头外露率亲本的所述变异位点与水稻材料的所述变异位点进行比对；
若高柱头外露率亲本与所述水稻材料中至少一个材料的相对应位点相同，则排除该位点，否则，保留该位点；
(6)取若干已知柱头外露率的水稻材料样本，针对步骤(5)中筛选获得的每一个位点，对所述水稻材料样本进行关联分析，以母本和父本中相应位点的信息作为聚类依据，将所述水稻材料样本分为近母本组和近父本组；统计两组水稻材料样本的柱头外露率值，计算每组水稻材料样本的平均柱头外露率值和方差；
若两组水稻材料样本之间的柱头外露率存在显著性差异，则保留该位点；反之，则排除该位点；
(7)根据步骤(6)筛选后剩余位点的类型，采用不同方法进行筛选；
(a)对于非同义突变位点的筛选：分析位点转录翻译的氨基酸是否位于蛋白的结构域或保守的基序中；若该位点转录翻译的氨基酸位于蛋白的结构域或保守的基序中，则保留该位点；反之，则排除该位点；
(b)对于无义突变位点和移码突变位点的筛选：根据步骤(6)中获得的针对于无义突变位点和移码突变位点聚类分析后的近母本组水稻材料样本的最低柱头外露率值进行筛选；
若近母本组水稻材料样本的最低柱头外露率＞10％，则保留该位点；反之，则排除该位点；最终，筛选得到水稻高柱头外露率相关的分子标记。
步骤(b)中，以最低柱头外露率＞10％作为判断依据，是因为：本领域公知，定位到的QTL对于柱头外露的贡献率一般都在10％左右，即使高柱头外露率亲本外露率为100％，一个QTL能够提高的水稻柱头外露率也就在10％左右；所以根据现有公知常识设立该判断标准。
步骤(2)中，提及的“选取分离程度小的小区”的判断依据为：
(A)来自于F2代高柱头外露率的F3代的植株大都依然表现为高柱头外露率，也有一些表现较大的分离。我们以每个小区所调查的所有植株的外露率都高于70％的小区，在试验中定义为高柱头外露率分离程度较小的小区。
(B)来自于F2代低柱头外露率的F3代的植株却表现出较大的分离；以每个小区所调查的所有植株的外露率都低于25％的小区定义为分离程度小的小区。
步骤(6)中，所述近母本组是指针对于某一位点，与母本相应位点相同的一类水稻材料样本；所述近父本组是指对于某一位点，与父本相应位点相同的一类水稻材料样本。
作为优选，步骤(1)中，从F2代中选取柱头外露率>70％的高柱头外露率植株和柱头外露率<5％的低柱头外露率植株，按单株收取种子，并按单株分小区种植，获得F3代。
作为优选，步骤(2)中，取样时，将柱头外露率>95％的高柱头外露率植株作为高柱头外露率池材料，柱头外露率<2％的低柱头外露率植株作为低柱头外露率池材料；可提高筛选的获得分子标记的准确率。
进一步地，所述水稻材料和水稻材料样本均由华中农业大学欧阳亦聃教授提供；其中，水稻材料和水稻材料样本的所对应变异位点从http://ricevarmap.ncpgr.cn/网站中获得。
进一步地，所述水稻材料的数量不少于20个；所述水稻材料样本的总数量为200～500个。
本发明还提供了利用上述筛选方法获得的与水稻柱头外露相关的分子标记，所述分子标记位于Os03g0689400基因的第二个外显子处，碱基序列为5’-GTACTCTGAAGTCCGGT-3’，如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述与水稻柱头外露相关的分子标记的特异性引物，所述特异性引物的碱基序列如下：
qSER3.1-F：5'-TGTAGCGAAGGACGAGGGAT-3'；
qSER3.1-R：5'-CACCCGAAGGCAAGAAAGAT-3'。
本发明所述与水稻柱头外露相关的分子标记可用于在筛选高柱头外露率水稻。
本发明还提供一种筛选高柱头外露率水稻的方法，包括以下步骤：
利用权利要求5所述的引物对待测水稻品种的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；扩增产物经电泳分离后，若扩增产物中存在大小为234bp的片段，则待测水稻为高柱头外露率水稻；若扩增产物中存在大小为217bp的片段，则待测水稻为低柱头外露率水稻。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明方法以高柱头外露率的雄性不育系为母本，与低柱头外露率材料进行杂交；在其F3代，选择柱头外露率表现为极高与极低的植株进行混池测序，并通过ΔSNP-index与ED分析，定位与柱头外露率有关的QTL，再在该QTL内，选出非同义突变位点、无义突变位点和移码突变位点；然后，通过母本与已知种质资源库中的低柱头外露率材料进行比对分析排除部分突变位点，并进一步利用种质资源库中的材料进行关联分析，最终找到了与水稻柱头的外露性状相关的分子标记
(2)本发明通过上述方法找到了位于第3染色体上、大小为3.90Mb主效QTL，qSER3.1，并进一步找到了一个与柱头的外露性状有关的17-bp的InDel，在所分析的材料中，含有17-bp插入的材料具有最低的柱头外露率和平均柱头外露率分别为16.5％和39.6％；而不含17-bp插入的材料则表现最低的柱头外露率和平均柱头外露率分别为0.2％和20.6％。
附图说明
图1为实施例1提供的母本ZS616和父本DS552的高柱头外露表型；
其中，A为亲本穗子的图片，B为亲本柱头外露的放大图片。
图2为实施例1中具有不同柱头外露率植株的分布情况；
其中，A为F2代植株的柱头外露率分布；B为来源于F2代高柱头外露植株的F3代各小区植株的柱头外露率分布；C为来源于F2代低柱头外露植株的F3代各小区植株的柱头外露率分布；横坐标：stigma exsertionrate％表示柱头外露率％；纵坐标：No.of plants表示株数。
图3为实施例1中利用ΔSNP-index和ED定位到的QTL；
其中，A为ED分析定位到的QTL；B为ΔSNP-index分析定位到的QTL；C为qSER3.1放大图；横坐标：Chr 1-12表示1-12条染色体；纵坐标：ΔSNP-index；Euclidean Distance表示欧氏距离。
图4为实施例1中17-bp以及GS3在477份材料中的关联分析；
其中，A为全部所用材料按17-bp插入进行分类的箱线图；B为全部所用材料按GS3基因型进行分类的箱线图；C为GS3基因型材料中按17-bp插入进行分类的箱线图；D为GS3基因型材料中按17-bp插入进行分类的箱线图；E为含有17-bp插入的材料中按GS3基因型进行分类的箱线图；F为不含17-bp插入的材料中按GS3基因型进行分类的箱线图。
图5为实施例1中筛选获得的17-bp InDel在Os03g0689400基因中的位置以及其序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
水稻雄性不育系柱头外露对制种的产量起着非常重要的作用。在发明以高柱头外露率(94.5％)雄性不育系ZS616为母本(图1)，与低柱头外露率材料DS552(2.4％)进行杂交。在其F3代，选择柱头外露率表现为极高与极低的植株进行混池测序，来定位与柱头外露率有关的QTL。通过ΔSNP-index与ED分析，我们鉴定到一个位于第3染色体上、大小为3.90Mb的主效QTL，qSER3.1。在qSER3.1内，总共存在307个SNP(非同义突变和无义突变)和27个移码突变。通过ZS616与华中农业大学水稻种质资源库中的低柱头外露率材料进行比对分析，绝大多数的SNP(294)和indel(25)可被排除掉。进一步利用华中农业大学水稻种质资源库的全部材料进行关联分析，发现了一个17-bp的indel很可能与柱头的外露性状有关。在所分析的材料中，含有17-bp插入的材料中最低柱头外露率和平均柱头外露率分别为16.5％和39.6％；而不含17-bp插入的材料的最低柱头外露率和平均柱头外露率分别为0.2％和20.6％。综上，本试验鉴定出了一个主效的水稻柱头外露率的QTL。
一、试验材料
高柱头外露率(94.5％)材料ZS616，可购于浙江大学舒庆尧课题组；低柱头外露率(2.3％)材料DS552，可购于浙江大学舒庆尧课题组。
二、试验方法
(1)以高柱头外露率(94.5％)材料雄性不育系ZS616作为母本，低柱头外露率(2.3％)材料DS552作为父本，将ZS616与DS552杂交，种植杂交种，再自交，获得F2分离群体。
调查F2代水稻的外露率，在调查时，F2代水稻的外露率呈现连续分布。从所调查的F2代中选取高柱头外露率的单株20株(柱头外露率<5％)，低柱头外露率的单株20株(柱头外露率>70％)；单株收取种子，然后单株分小区种植，获得F3代。
(2)在F3代的种植小区中选取分离程度较小的小区，对上述小区进行取样；
选取分离程度小的小区判断依据为：
(A)来源于F2代高柱头外露率植株的F3代的植株大都依然表现为高柱头外露率，也有一些小区发生较大的分离。我们以每个小区所调查的所有植株的外露率都高于70％的小区，在试验中定义为高柱头外露率分离程度较小的小区。
(B)来源于F2代低柱头外露率植株的F3代的植株却表现出较大的分离；以每个小区所调查的所有植株的外露率都低于25％的小区定义为分离程度小的小区。
其中，高柱头外露率分离较小的小区有10个，低柱头外露率分离较小的小区6个，高柱头外露率分离较小的每个小区取2株(柱头外露率>95％)，低柱头外露率分离较小的每个小区取4株(柱头外露率<2％)；
将高柱头外露率的植株作为之后高柱头外露率池(H-pool)的材料，低柱头外露率的植株作为之后低柱头外露率池(L-pool)的材料。
(3)取亲本ZS616植株、DS552植株以及高柱头外露率植株、低柱头外露率植株的叶片，分别提取叶片的基因组DNA，然后分别将高、低柱头外露率材料的DNA等量混池成高柱头外露率池和低柱头外露率池，之后再进行极端性状混池重测序(BSA-seq)，获得亲本ZS616、DS552以及高柱头外露率池和低柱头外露率池的测序序列；再以母本ZS616的序列作为参考序列，对高柱头外露率池和低柱头外露率池中的序列进行ΔSNP-index和ED分析，通过ΔSNP-index分析方法定位到了6个QTL，ED分析方法得到了1个QTL，取其交集，得到了1个3.90Mb大小的主效QTL，命名为qSER3.1。
(4)利用之前GATK软件分析出的变异位点，从qSER3.1区域中选出所有的非同义突变位点，无义突变位点和移码突变位点(InDel)，共得到297个非同义突变位点、10个无义突变位点和27个移码突变位点。
(5)取37个柱头外露率低于<2％的水稻材料，在http://ricevarmap.ncpgr.cn/网站上，获取37个水稻材料qSER3.1中与步骤(4)筛选获得的与297个非同义突变、10个无义突变和27个移码突变相对应的变异位点(简称SNP或InDel)；再将其与母本ZS616相对应的SNP或InDel进行比对；若母本ZS616中各SNP或InDel与上述37个水稻材料中的一个或多个材料所对应的SNP或InDel相同，则排除该SNP或InDel，否则保留该SNP或InDel；经过上述筛选，剩余23个SNP和2个InDel。
(6)针对于步骤(5)中筛选获得的每一个SNP或InDel，对477份水稻材料做关联分析，以母本ZS616和父本DS552各自相应位点作为聚类依据，将477份水稻材料(由华中农业大学欧阳亦聃教授提供，来源于华中农业大学水稻种质资源库，该材料中的柱头外露率来自于文献Zhou H,LiP,Xie W,et al.Genome-wide association analyses reveal thegenetic basis of stigmaexsertion in rice[J].Molecular Plant,2017,10(4):634-644.)分为两组，分别为与母本ZS616接近的一组(近母本组)和与父本DS552接近的一组(近父本组)；计算每组水稻材料的平均柱头外露率和方差，进而进行两组水稻材料柱头外露率的显著性分析；若两组水稻材料的柱头外露率存在显著性差异，则保留该SNP或InDel；反之，则排除该SNP或InDel；经过上述筛选，排除两个SNP，剩余21个SNP和2个InDel。
(7)对剩余的21个SNP和2个InDel采用不同的方法进行筛选；
(a)对于SNP的筛选，分析剩余的SNP是否发生于结构域或保守的基序中，若不存在于结构域或保守的基序中则排除该SNP，否则，保留SNP。经过上述筛选，将21个SNP全部排除，说明上述21个SNP可能均为与柱头外露率不相关的分子标记。
(b)对于InDel的筛选，根据步骤(6)中针对于InDel进行聚类获得的两组水稻材料的最低柱头外露率值进行InDel的筛选；若与近母本组水稻材料的最低柱头外露率＞10％，则确定该InDel为与柱头外露率相关的分子标记；否则，则确定该InDel为与柱头外露率不相关的分子标记。经过上述筛选，发现其中给一个InDel(17-bp)为与柱头外露率相关的分子标记。分析发现：ZS616与DS552在Os03g0689400基因间存在一个InDel，也基本处于qSER3.1的中间位置；ZS616表现为一个17-bp的插入，高柱头外露率池与ZS616一致，低柱头外露率池与DS552一致，故可以利用该17-bp的插入在关联区域内开发与柱头外露极为关联的InDel标记。
(8)针对上述17-bp的InDel标记，设计相应的引物序列，如下：
qSER3.1-F：5'-TGTAGCGAAGGACGAGGGAT-3'；
qSER3.1-R：5'-CACCCGAAGGCAAGAAAGAT-3'。
利用这对引物对华中农业大学水稻种质库的477份材料进行PCR，含有17-bp插入的材料对应的PCR产物为234bp，不含17-bp插入的PCR产物为217bp。
所述PCR扩增的反应体系如下：50ng/μL的DNA，1μL；Taqmix，10μL；10μM的上游引物，0.5μL；10μM的下游引物，0.5μL；无菌水8μL。
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共38个循环；72℃延伸5min，4℃hold。
将扩增得到的PCR产物，在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，每个孔上样量为1μL。
(9)因为GS3是已知的对柱头外露率有贡献的基因，且位于已知的对柱头外露率最高的QTL，qES3内部，所以又根据基因GS3、17-bp的类型进行分类，发现含有gs3类型(这种类型的基因，水稻籽粒变长，柱头外露率增加)而不含17-bp插入的材料的最小值为0.2％，但含有GS3类型和17-bp插入的材料，其柱头外露率最小值为16.5％。表明qSER3.1对于水稻的柱头外露更具有主效性。
三、试验结果
(1)通过对ZS616/DS552的F2分离群体的调查，表明柱头外露为一数量性状，由多基因控制；在F3群体中，我们发现来源于F2低柱头外露率植株的F3植株分离较为明显，而那些来源于F2高柱头外露率植株的F3植株分离程度较小，表明柱头的外露率至少有一些隐性基因在调控。
(2)通过ΔSNP-index的分析方法我们得到了6个QTL，分别为qSER3.2、qSER4.1、qSER5.1、qSER6.1、qSER8.1、qSER11.1；ED分析得到了一个主效QTL，qSER3.1。qSER3.1与qSER3.2在物理位置上有一定的重叠。综合以上两种方法，取其交集，得到了一个主效QTL，qSER3.1。
(3)在qSER3.1区域内，ZS616与DS552之间共存在33,796SNP和7,356个InDel。只不过绝大部分的SNP和InDel主要位于基因间或非编码区。在以上这些SNP和InDel中，总共有297个非同义突变、10个无义突变，27个移码突变。这些突变常常可以导致基因功能的丧失。
(4)通过将307个SNP和27个InDel与37个低柱头外露的材料所对应的位点进行比较，还分别剩下23个SNP和2个InDel。然后，将这23个SNP与2个InDel在华中农业大学水稻种质资源库中的477份材料进行关联分析。分析发现，其中2个SNP(vg0326764072和vg0326802216)所对应的平均柱头外露率在ZS616和DS552之间不存在显著性，故排除。
(5)在这21个导致氨基酸变化的SNP中，其中有8个SNP发生于预测的结构域中，但都不是发生于这些结构域的保守基序中。根据这2个InDel(vg0327519487和vg0326001563)所对应的不同类型的变异情况在477份材料中进行分类。
发现：
vg0326001563：
ZS616类型vs DS552 1.5％vs 0.2％
vg0327519487：
ZS616类型(已去除杂合情况)vs DS552 16.5％vs 0.2％。
(6)因为GS3是已知的对柱头外露率有贡献的基因，且位于已知的对柱头外露率最高的QTL，qES3内部，所以又根据基因GS3、17-bp的类型进行分类，发现含有gs3(这种类型的基因，水稻籽粒变长，柱头外露率增加)不含17-bp插入的材料的最小值为0.2％，但含有GS3和17-bp插入的材料，其柱头外露率最小值为16.5％。表明qSER3.1对于水稻的柱头外露更具有主效性。
序列表
<110> 浙江大学
无锡哈勃生物种业技术研究院有限公司
<120> 一种与水稻柱头外露相关的分子标记及其筛选方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
gtactctgaa gtccggt 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tgtagcgaag gacgagggat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cacccgaagg caagaaagat 20

Claims (8)

1.一种水稻柱头外露率相关分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以高柱头外露率水稻为母本，低柱头外露率水稻为父本，进行杂交，获得F1代；F1代自交后，得到F2代分离群体；从F2代中选取柱头外露率>70％～95％的高柱头外露率植株和柱头外露率<2％～5％的低柱头外露率植株，按单株收取种子，并按单株分小区种植，获得F3代；
(2)在F3代种植的小区中，选取分离程度小的小区，对上述小区内的植株进行取样；取样时，将柱头外露率>70％～95％的高柱头外露率植株作为高柱头外露率池材料，柱头外露率<2％～5％的低柱头外露率植株作为低柱头外露率池材料；
(3)取高柱头外露率植株的叶片、低柱头外露率植株的叶片和亲本植株的叶片，分别提取叶片的基因组DNA，然后分别将高、低柱头外露率材料的DNA等量混池成高柱头外露率池和低柱头外露率池，之后进行极端性状混池重测序，获得高柱头外露率样本池、低柱头外露率样本池和亲本的测序序列；再以高柱头外露率亲本的序列为参考序列，对高柱头外露率池和低柱头外露率池通过极端性状混池重测序获得的序列进行ΔSNP-index和ED分析，得到与柱头外露率相关的QTL；
(4)从步骤(3)所述QTL中选出在双亲中存在差异的所有非同义突变位点、无义突变位点和移码突变位点；
(5)选取若干已知柱头外露率低的水稻材料，获取步骤(4)中所述的非同义突变位点、无义突变位点和移码突变位点相对应的所述水稻材料变异位点，将高柱头外露率亲本的所述变异位点与水稻材料的所述变异位点进行比对；
若高柱头外露率亲本与所述水稻材料中至少一个材料的相对应位点相同，则排除该位点，否则，保留该位点；
(6)取若干已知柱头外露率的水稻材料样本，针对步骤(5)中筛选获得的每一个位点，对所述水稻材料样本进行关联分析，以母本和父本中相应位点的信息作为聚类依据，将所述水稻材料样本分为近母本组和近父本组；统计两组水稻材料样本的柱头外露率值，计算每组水稻材料样本的平均柱头外露率值和方差；
若两组水稻材料样本之间的柱头外露率存在显著性差异，则保留该位点；反之，则排除该位点；
(7)根据步骤(6)筛选后剩余位点的类型，采用不同方法进行筛选；
(a)对于非同义突变位点的筛选：分析位点转录翻译的氨基酸是否位于蛋白的结构域或保守的基序中；若该位点转录翻译的氨基酸位于蛋白的结构域或保守的基序中，则保留该位点；反之，则排除该位点；
(b)对于无义突变位点和移码突变位点的筛选：根据步骤(6)中获得的针对于无义突变位点和移码突变位点聚类分析后的近母本组水稻材料样本的最低柱头外露率值进行筛选；
若近母本组水稻材料样本的最低柱头外露率＞10％，则保留该位点；反之，则排除该位点；最终，筛选得到水稻高柱头外露率相关的分子标记。
2.如权利要求1所述的水稻柱头外露率相关分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，从F2代中选取柱头外露率>70％的高柱头外露率植株和柱头外露率<5％的低柱头外露率植株，按单株收取种子，并按单株分小区种植，获得F3代。
3.如权利要求1所述的水稻柱头外露率相关分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，取样时，将柱头外露率>95％的高柱头外露率植株作为高柱头外露率池材料，柱头外露率<2％的低柱头外露率植株作为低柱头外露率池材料。
4.如权利要求1所述的水稻柱头外露率相关分子标记的筛选方法，其特征在于，所述水稻材料的数量不少于20个；所述水稻材料样本的总数量为200～500个。
5.如权利要求1～4任一项所述的筛选方法获得的与水稻柱头外露相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于Os03g0689400基因的第二个外显子处，碱基序列如SEQ IDNO.1所示。
6.如权利要求5所述的与水稻柱头外露相关的分子标记的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的碱基序列，如下：
qSER3.1-F：5'-TGTAGCGAAGGACGAGGGAT-3'；
qSER3.1-R：5'-CACCCGAAGGCAAGAAAGAT-3'。
7.如权利要求5所述的与水稻柱头外露相关的分子标记在筛选高柱头外露率水稻中的应用。
8.一种筛选高柱头外露率水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用权利要求5所述的引物对待测水稻品种的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；扩增产物经电泳分离后，若扩增产物中存在大小为234bp的片段，则待测水稻为高柱头外露率水稻；若扩增产物中存在大小为217bp的片段，则待测水稻为低柱头外露率水稻。
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