CN105506163B - 一种鉴定控制白菜紫色性状形成的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定控制白菜紫色性状形成的SNP分子标记及其应用。A0331593020T/A位点在如下A‑F任一中的应用：A、在鉴别或辅助鉴别大白菜颜色中的应用；B、在选育紫色大白菜品种中的应用；C、大白菜育种中的应用；D、预测大白菜颜色中的应用；E、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜颜色产品中的应用；F、在制备预测大白菜颜色产品中的应用。本发明通过实验证明，利用A0331593020T/A位点及其所对应的引物无论在紫色还是在绿色材料中的选择准确率均为100％。表明该位点及其所对应的引物将有助于紫色大白菜种质资源的筛选，为大白菜紫色性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。

Description

一种鉴定控制白菜紫色性状形成的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种鉴定控制白菜紫色性状形成的SNP分子标记及其应用，尤其涉及一种鉴定白菜A03染色体上控制紫色性状QTL-BrPur的SNP分子标记及其应用。
背景技术
黄心、桔红心大白菜和紫色小白菜等品种具有色泽艳丽的商品品质、生食味甜的风味品质和高营养成分的营养品质，是白菜品质改良的重要目标。目前，黄心、桔红心大白菜和紫色小白菜品种已经普遍推广和种植，而紫色大白菜品种还处于空白。
研究显示紫色品种白菜的紫红色是由花青素类物质所致。花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，是植物中迄今为止所发现的强效自由基清除剂，具有抗氧化衰老、抗突变、抗癌与抗动脉硬化功能。紫色品种主要由国外引进，2006年前后，开始在国内市场销售，影响较大。国外推出的紫色小白菜〔Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsen et Lee〕是应用细胞质Ogu CMS不育系育成的一代杂种。在秋季栽培条件下，由于阳光充足，叶片的亮紫色表现尤为突出。但是对于控制紫色形成关键基因的研究却并不多见。
张德双利用绿色大白菜与紫色小白菜为亲本进行杂交、自交和回交，研究紫色基因的遗传规律，结果表明紫色对绿色为显性，由一对遗传基因控制，而且具有累加效应(张德双等,2011a；2011b)。汪维红等利用大白菜与紫色小白菜为亲本构建的186个单株的F2群体，通过筛选出的2个SSR和2个InDel标记将控制紫色性状的BrPur基因定位于A03号染色体上，4个分子标记与pur的遗传距离分别为17.1cM、5.8cM、5.3cM和0.4cM(汪维红等,2011)遗传距离相对较远；刘瑾等构建了一张包含BrPur基因、3个SSR和2个InDel标记的部分连锁图，标记间平均距离为1.98cM(刘瑾等，2013)；汪维红应用回交BC1群体1152个单株，发展2个Indel标记，与BrPur的遗传距离都为0.3cM，均存在一定的重组率(Wang等，2014)。
利用与目标性状共分离的分子标记进行标记辅助选择是在遗传育种中十分有效的方法，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境影响等优点，可以在幼苗期进行选择，加快育种过程。SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点。不同物种全基因组的序列测定及比较表明，SNP在基因组上的分布极其丰富；SNP突变率低，尤其处于编码区的SNP是高度稳定的，其遗传稳定性要比SSR等遗传标记高得多，遗传分析或基因诊断时的重现性、准确性都优于SSR。
基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测是英国LGC(Laboratory of the Government Chemist)有限公司开发的高通量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点，目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。该方案的核心是KASP技术，即Competitive Allele-Specific PCR。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(Insertions and Deletions，插入和缺失)。
分子标记在基于分子标记辅助选择(MAS)技术的抗性育种工作中起着越来越重要的作用。紫色大白菜在幼苗期叶片颜色易受环境影响，例如温度、光照等，利用传统的田间观察鉴定方法易出差错，若结合分子标记辅助选择(MAS)技术则可提高其准确性，加快育种进程。因此开发与大白菜紫色性状相关的分子标记显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴别待测大白菜是否为紫色大白菜。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种与大白菜紫色性状相关的SNP位点-A0331593020T/A位点，该位点位于A03染色体上第31593020位，其脱氧核苷酸为T或A。在本申请中，该位点为序列表序列4中的第300位核苷酸。
本发明根据上述SNP位点开发了A0331593020T/A位点在如下A-F任一中的应用：
A、在鉴别或辅助鉴别大白菜颜色中的应用；
B、在选育紫色大白菜品种中的应用；
C、大白菜育种中的应用；
D、预测大白菜颜色中的应用；
E、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜颜色产品中的应用；
F、在制备预测大白菜颜色产品中的应用。
本发明根据上述SNP位点还开发了检测大白菜基因组中A0331593020T/A位点的多态性或基因型的物质在如下A-F任一中的应用：
A、在鉴别或辅助鉴别大白菜颜色中的应用；
B、在选育紫色大白菜品种中的应用；
C、大白菜育种中的应用；
D、预测大白菜颜色中的应用；
E、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜颜色产品中的应用；
F、在制备预测大白菜颜色产品中的应用。
上述应用中，所述检测大白菜基因组中A0331593020T/A位点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组。
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链DNA分子。
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链DNA分子。
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。；
所述引物3为如下c1)或c2)：
c1)序列3所示的单链DNA分子。
c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。
上述物质可以是引物组或含有引物组的试剂或试剂盒。
本发明根据上述SNP位点还开发一种鉴别或辅助鉴别待测大白菜是否为紫色大白菜的方法，包括如下步骤：检测待测大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型，若所述待测大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型为TT或TA，则所述待测大白菜为紫色大白菜或候选紫色大白菜；若所述待鉴别大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型为AA，则所述待鉴别大白菜为非紫色大白菜或非候选紫色大白菜。
上述方法中，所述检测待鉴别大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型的方法为如下(1)或(2)：
(1)测序；
(2)用引物对待测大白菜进行等位基因特异性PCR；
所述引物由引物1、引物2和引物3组成。
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链DNA分子。
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链DNA分子。
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物3为如下c1)或c2)：
c1)序列3所示的单链DNA分子。
c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。
上述方法中，所述非紫色大白菜为绿色大白菜，或非候选紫色大白菜为候选绿色大白菜。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法在下述1)-4)任一中的应用：
1)在鉴别或辅助鉴别大白菜颜色中的应用；
2)在选育紫色大白菜品种中的应用；
3)大白菜育种中的应用；
4)预测大白菜颜色中的应用。
上述方法中，所述等位基因特异性PCR的模板为待测大白菜的基因组DNA。
本发明根据上述SNP位点还开发了一种大白菜的育种方法，包括检测待测大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型，选择基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型为CC的待测大白菜作为亲本进行育种。
上述方法中，所述TT是A0331593020T/A位点为T的纯合型，所述AA是A0331593020T/A位点为A的纯合型，所述TA是A0331593020T/A位点为T和A的杂合型。
本发明根据上述SNP位点还开发了一组鉴别或辅助鉴别大白菜是否为紫色大白菜的引物组，由引物1、引物2和引物3组成。
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链DNA分子。
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链DNA分子。
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物3为如下c1)或c2)：
c1)序列3所示的单链DNA分子。
c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。
上述引物组中，所述序列1所示的单链DNA分子、所述序列2所示的单链DNA分子与所述序列3所示的单链DNA分子的摩尔比为12∶12∶30。
本发明根据上述SNP位点还开发了含有上述引物组的鉴别或辅助鉴别大白菜是否为紫色大白菜的试剂或试剂盒。
本发明所涉及的大白菜颜色为绿色或紫色。
实验证明，利用本发明所提供的分子标记(SNP位点)A0331593020T/A位点及其所对应的引物无论在紫色还是在绿色材料中的选择准确率均为100％。由此表明，本发明所提供的分子标记(SNP位点)A0331593020T/A位点及其所对应的引物将有助于紫色大白菜种质资源的筛选，可用于分子标记辅助选择育种，为大白菜紫色性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。
附图说明
图1为A0331593020T/A位点在518份待测白菜材料中的基因分型鉴定图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小白菜“09N-742”(Wang et al.,Mapping the BrPur gene for purple leafcolor on linkage group A03 of Brassica rapa.Euphytica(2014)199:293–302.)公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
大白菜“09-680”(Wang et al.,Mapping the BrPur gene for purple leafcolor on linkage group A03 of Brassica rapa.Euphytica(2014)199:293–302.)公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、分子标记的获得
为了更好更快地筛选获得紫色大白菜资源，促进分子标记辅助选择育种实践的进行,通过对1份紫色小白菜材料(09N-742)和1份绿色大白菜材料(09-680)的重测序数据分析发现，在A03染色体第31593020位的碱基有一个T/A突变的SNP位点((序列表序列4中第300位核苷酸))，该SNP位点命名为A0331593020T/A位点。根据A0331593020T/A位点，设计如下可用于KASP技术的特异的引物作为分子标记：上游引物A0331593020T/A-FF、上游引物A0331593020T/A-FV和下游引物A0331593020T/A-R。
上述A0331593020T/A-FF、A0331593020T/A-FV和A0331593020T/A-R引物委托英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司获得。
A0331593020T/A-FF、A0331593020T/A-FV和A0331593020T/A-R引物序列特征如下：
上游引物A0331593020T/A-FF：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCTGAAGATAAGCTTAGCAGCAa(序列1)；
上游引物A0331593020T/A-FV：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCTGAAGATAAGCTTAGCAGCAt(序列2)；
下游引物A0331593020T/A-R：
CTTTCTAACGTAGTTCTTTTTGCTCCGA(序列3)。
上述上游引物最后一位碱基t/a对应A03染色体上第31593020位的SNP位点，即序列表序列4中第300位核苷酸。
实施例2、A0331593020T/A位点在鉴定的紫色和绿色材料中的应用
1、DNA提取
常规CTAB法分别提取表1中518种待测白菜材料的基因组DNA。
518份材料为亲本09N-742与09-680的杂交后代BC6F2的各株系，具体方法如下：将紫色亲本09N-742和绿色亲本材料09-680杂交获得F1；再以绿色亲本09-680为回交亲本回交6代，获得由518个单株组成的BC6F2(群体。
琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4-10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μl备用，得到待测DNA。
2、基于竞争性等位基因特异性PCR
按照英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行实验，以下试剂除特殊说明为均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，Manual Part#15004070Rev.B进行。KASP反应在384微孔板或1536微孔板(Cat.No.04729749001,Roche)中进行，反应体系为3ul或1ul。
具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待测DNA模板(4ng/μl)1.5ul，60℃烘干。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站向每个反应孔中加入Master mix(KBS-1016-002或Cat.No.KBS-1016-011，Laboratory of the GovernmentChemist)与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比6:6:15混合，各引物终浓度为10μM)，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61°C-55℃，1分钟(复性&延伸：以touch down程序扩增10个循环，每循环降低0.6°C)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMGPHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全。
结果如图1所示，结果显示分型效果良好，A0331593020T/A位点的引物组(A0331593020T/A-FF、A0331593020T/A-FV和A0331593020T/A-R)能够特异区分该位点为纯合AA、或纯合TT或杂合T/A的材料。
若待测白菜A0331593020T/A位点的核苷酸为AA纯合，则待测白菜为绿色；若待测白菜A0331593020T/A位点的核苷酸为TT纯合或T/A杂合，则待测白菜为紫色。
结果如表1所示，在390份表型为紫色的材料中，分子标记鉴定A0331593020T/A位点为TT纯合的材料有113份，杂合T/A位点的有277份。在128份表型为绿色的材料中，A0331593020T/A位点为AA纯合的材料有128份，本发明方法的鉴定准确度为100％。
表1 为518份BC6F2群体材料在A0331593020T/A位点的基因分型及表型统计表
由此可以看出，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜的颜色(紫色或绿色)性状。

Claims (8)

1.检测大白菜基因组中A0331593020T/A位点的多态性或基因型的物质在如下A-E任一中的应用：
A、在鉴别或辅助鉴别大白菜颜色中的应用；
B、在选育紫色大白菜品种中的应用；
C、预测大白菜颜色中的应用；
D、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜颜色产品中的应用；
E、在制备预测大白菜颜色产品中的应用；
所述A0331593020T/A位点为序列表序列4中第300位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测大白菜基因组中A0331593020T/A点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组；
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
3.一种鉴别或辅助鉴别待测大白菜是否为紫色大白菜的方法，包括如下步骤：检测待测大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型，若所述待测大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型为TT或TA，则所述待测大白菜为紫色大白菜或候选紫色大白菜；若所述待鉴别大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型为AA，则所述待鉴别大白菜为非紫色大白菜或非候选紫色大白菜；
所述A0331593020T/A位点为序列表序列4中第300位核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测待鉴别大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型的方法为如下（1）或（2）：
（1）测序；
（2）用引物对待测大白菜进行等位基因特异性PCR；
所述引物由引物1、引物2和引物3组成；
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
5.权利要求3或4所述的方法在下述1）-3）任一中的应用：
1）在鉴别或辅助鉴别大白菜颜色中的应用；
2）在选育紫色大白菜品种中的应用；
3）预测大白菜颜色中的应用。
6.大白菜的育种方法，包括检测待测大白菜基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型，选择基因组A0331593020T/A位点的多态性或基因型为TT的待测大白菜作为亲本进行育种；
所述A0331593020T/A位点为序列表序列4中第300位核苷酸。
7.鉴别或辅助鉴别大白菜是否为紫色大白菜的引物组，由引物1、引物2和引物3组成；
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
8.含有权利要求7所述引物组的鉴别或辅助鉴别大白菜是否为紫色大白菜的试剂或试剂盒。
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