CN112980986A - 鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的pcr引物组及其应用 - Google Patents

鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的pcr引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子辅助育种技术领域，特别是一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的PCR引物组及其应用，所述PCR引物组包括包括引物KBoHL2‑X、KBoHL2‑Y、KBoHL2‑Common。本发明检测待测甘蓝C04染色体46,333,244位置的基因型是T/T还是C/C,根据待测甘蓝的基因型确定甘蓝是否具有杂种致死亲本类型2的特性：T/T基因型的待测甘蓝为杂种致死亲本类型2，C/C基因型的待测甘蓝则不是杂种致死亲本类型2。将本发明的PCR引物、试剂盒或方法用于辅助育种具有操作简便易行、特异性强、稳定性好、可以实现早期选育等优点，鉴定结果与田间表型的吻合率达到100％，具有重大应用前景。

Description

鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的PCR引物组及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和植物遗传育种技术领域，涉及一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的PCR引物组及其应用。
背景技术
结球甘蓝简称甘蓝，属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)甘蓝种。甘蓝的适应性和抗逆性均较强，又具有较高的营养和保健价值，因而在中国乃至世界各地广泛栽培。杂种致死是指亲本正常生长，而杂交种出现萎蔫、黄化、植株矮小，甚至死亡的现象，杂种致死是一种重要的生殖隔离方式，对物种的形成及保持物种的纯度非常重要。近年来，植物杂种致死研究越来越多，也越来越深入，但在十字花科作物中，大部分是由于远缘杂交造成的属间杂种致死，种内杂种致死事例只在拟南芥和甘蓝上有所研究。甘蓝杂种致死则是甘蓝生长发育过程中一种极端异常现象，会给甘蓝的生产带来了损失。因此急需鉴定出携带致死基因的甘蓝。
植物杂种致死现象的发生与本身的遗传因素—致死基因有关，杂种致死的发生为研究生物体生长发育过程提供了直接的途径，对于物种形成与进化研究有重要的意义，而且在指导利用野生远缘种质资源进行作物品种改良中具有重要的作用。发现携带致死基因的材料并开发与致死基因连锁的标记，能够帮助研究人员避开使用这些材料进行育种，避免生产上的损失。
中国农业科学科学院蔬菜花卉研究所甘蓝青花菜课题组在配制杂交组合过程中发现了甘蓝杂种致死现象，并针对甘蓝杂种致死开展了遗传分析和基因定位工作。薛玉前等(2015a)对杂交组合09-211×09-222正反交及其亲本，以及正常杂交种的苗期生长变化趋势(茎粗、最大外叶长度、叶数)进行观察统计，结果表明杂种致死组合正反交的生长势明显弱于亲本材料和正常F1的生长势。通过田间杂交组合筛选和性状调查，新发现了三个含有杂种致死的材料10-260，11-204和11-176。利用5份含杂种致死基因的自交系和不含杂种致死基因的自交系87-534互相杂交，田间表型调查结果表明：甘蓝杂种致死材料分为两组，组别1(杂种致死亲本类型1)包括11-204和09-211，组别2(杂种致死亲本类型2)包括10-260，09-222和11-176，组内自交系相互杂交，后代生长正常；组间自交系相互杂交，后代出现致死现象，而5份材料与87-534的杂交组合均不出现致死现象。
薛玉前等(2015a)通过多个三元杂交组合对甘蓝杂种致死进行遗传分析，生长状况调查和卡方测验结果表明杂种致死性状是由2个互补的显性基因控制的，符合DM遗传模式的双位点遗传模式，并分别将杂种致死基因命名为BoHL1和BoHL2，并推断同组别的杂种致死基因为同一基因。进一步研究发现，杂种致死亲本类型1携带的杂种致死基因BoHL1位于C01号染色体，杂种致死亲本类型2携带的杂种致死基因BoHL2位于C04号染色体，两种类型杂交后代表现为致死。。
发明内容
发明人在研究过程中发现甘蓝C04染色体上物理位置46,333,244的一对等位基因与甘蓝杂种致死亲本类型2特性密切相关，经验证，该位置若为脱氧核糖核苷酸C的纯合体(C/C基因型)时，甘蓝为正常材料或杂种致死亲本类型1；若为脱氧核糖核苷酸T的纯合体(T/T基因型)时，则甘蓝为杂种致死亲本类型2。发明人经后续实验研究证实，该SNP变异能够准确地鉴定出或筛选出甘蓝杂种致死亲本类型2，基于此，本发明请求保护以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的PCR引物组，其特征在于：包括引物KBoHL2-X、KBoHL2-Y、KBoHL2-Common，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
所述引物KBoHL2-X的5’端还添加有FAM标签序列成为正向引物F1，所述引物KBoHL2-Y的5’端还添加有HEX标签序列成为正向引物F2；
优选所述正向引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第二方面提供一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的PCR引物组；
优选还包括KASP检测所需的荧光探针、淬灭探针、Taq酶和dNTP；
优选包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。
第三方面，本发明提供了上述的PCR引物组、权利要求3所述的试剂盒在对甘蓝杂种致死亲本类型2进行鉴定或筛选中的应用。
第四方面，本发明提供了一种SNP分子标记在鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2中的应用，其特征在于：所述SNP分子标记多态性位点对应于甘蓝C04染色体上的物理位置46,333,244，多态性为C/T；
优选所述物理位置是基于甘蓝“TO1000”的全基因组序列确定的；
所述应用是指：
(1)通过鉴定待测SNP分子标记多态性位点鉴定或筛选甘蓝材料；
(2)基于所述SNP分子标记多态性位点上下游50-100bp区域内分别设计的上下游引物鉴定或筛选甘蓝材料；和/或
(3)基于所述SNP分子标记多态性位点上下游5-100bp且包含该位点的区间选取特异性探针鉴定或筛选甘蓝材料。
第五方面，本发明提供了一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的方法，其特征在于：检测待测甘蓝C04染色体上46,333,244物理位置的基因型是T/T还是C/C，如果检测为T/T基因型则待测甘蓝为杂种致死亲本类型2，如果检测为C/C基因型则待测甘蓝不是杂种致死亲本类型2；
优选所述物理位置是基于甘蓝“TO1000”的全基因组序列确定的。
具体方法为：提取待测甘蓝基因组DNA作为PCR扩增模板，采用权利要求1或2所述的PCR引物组或者权利要求3所述的试剂盒进行PCR扩增，检测扩增产物判断待测甘蓝C04染色体46,333,244位置的基因型是T/T还是C/C。
优选地，采用权利要求2所述的PCR引物组或者权利要求3所述的试剂盒进行PCR扩增，扩增反应结束后，采取荧光微孔板检测仪对所得扩增产物进行荧光扩增，使用SNPviewer软件读取荧光信号数据并判断基因型，若待测甘蓝的扩增产物的荧光信号数据据经SNPviwer软件分析呈现蓝色，则待测甘蓝的基因型为C/C；若待测甘蓝的扩增产物的荧光信号数据据经SNPviwer软件分析呈现红色，则所述待测甘蓝的基因型为T/T。
PCR反应体系以总体积10.14uL计为：KASP Mater mix 5uL，浓度为20ng/uL的模板DNA 5uL，PCR引物组0.14ul，PCR引物组中的每个引物在反应体系中的终浓度均为20ng/uL。
PCR扩增的条件为：第一轮降落PCR，94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火60s，共10个Touch Down循环，每个循环降低0.6℃；第二轮PCR反应，94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
本发明的鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的方法，优选利用KASP技术进行检测，其操作简单易行，只需提取待测甘蓝的基因组DNA、使用KASP专用引物进行PCR扩增、利用荧光微孔板检测仪检测扩增产物的荧光信号、使用SNPviewer读取检测数据，即可实现高效、经济的基因分型，判断出待测植株是否为甘蓝杂种致死亲本类型2。
利用本发明开发的PCR标记和引物进行甘蓝杂种致死亲本类型2的筛选和鉴定，特异性强，稳定性高，能够十分准确和高效地检测出待测甘蓝植株是否是甘蓝杂种致死亲本类型2，经实验验证，检测结果与田间的吻合率达到100％。利用本发明的方法辅助鉴定甘蓝杂种致死亲本类型2，在幼苗期就能筛选出目标株系，可用于筛选大批量样本，大大缩短了甘蓝的育种周期，提高了育种效率，具有重大的应用前景。
将本发明的PCR引物、试剂盒或方法用于甘蓝育种具有操作简便易行、特异性强、稳定性好、可以实现早期选育等优点，鉴定结果与田间表型的吻合率达到100％，具有重要的应用前景。
附图说明
图1是实施例2中利用KASP技术对不同甘蓝材料的基因分型情况，其中，
红色点(基因型T:T):“明德”、“IKAMA”、“野生型007338”、“美味早生”、“CB201”、“铁4”、“湖北1180”、“华耐YC207”、“攀登”、“嘉宝”、“旺旺”、“Globe star”、“希望720”；
蓝色点(基因型C:C):“084”、“01-20中”、“79-156”、“79-156”、“01-88”、“SG643”、“雪早”、“引162”、“650绿”、“希望795”、“绿球”；
黑色点(NTC):阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明，需要说明的是，实施例仅用于解释本发明而不代表限制本发明的范围。
甘蓝类材料
正常自交系：“084”、“01-20中”、“02-12”、“79-156”、“01-88”、“SG643”、“雪早”、“引162”、“650绿”、“希望795”、“绿球”；
杂种致死亲本类型2：“明德”、“IKAMA”、“野生型007338”、“美味早生”、“CB201”、“铁4”、“湖北1180”、“华耐YC207”、“攀登”、“嘉宝”、“旺旺”、“Globe star”、“希望720”；
上述甘蓝类材料本实验室(中国农业科学科学院蔬菜花卉研究所甘蓝青花菜课题组)均有保存，申请人声明，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。
主要试剂：KASP Master mix购于英国LGC公司，货号为：KBS-1016-012。
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可；未特别说明的实验条件，均为本领域常规试验条件，可参考分子克隆试验手册(Sambrook J&RussellDW,Molecularcloning:alaboratory manual,2001)。
实施例1
发明人对甘蓝杂种致死亲本类型1自交系09-211、甘蓝杂种致死亲本类型2自交系09-222的重测序结果进行比较分析，检测到甘蓝杂种致死亲本类型2自交系09-222在C04染色体46,333,244位置有一处SNP变异，通过一代测序确认了该处变异。C04：46,333,244位置代表甘蓝C04染色体上的物理位置46,333,244，该物理位置是基于甘蓝“TO1000”的全基因组序列确定的，所述甘蓝“TO1000”的全基因组序列记载在Ensembl Plants数据库(网址http://plants.ensembl.org/index.html)中。
为了验证该处变异与杂种致死亲本类型2的相关性，截取其上下游各50bp的序列(SEQ ID NO.1)，按照KASP设计原则，在Ploy Marker网站设计KASP引物，基于变异位点设计得到两条正向引物KBoHL2-X/KBoHL2-Y，同时设计一条通用反向引物KBoHL2-Commen，其核苷酸序列如下：
KBoHL2-X:5’-CTCCGGGTTTTCCCGATATCC-3’(SEQ ID NO.2)；
KBoHL2-Y:5’-TACTCCGGGTTTTCCCGATATCT-3’(SEQ ID NO.3)；
KBoHL2-Common:5’-GCCTGGACGATGGTAGCTCGAA-3’(SEQ ID NO.4)。
所述KASP引物是根据正常株和突变株在C04染色体46,333,244位置的基因型设计，正常类型为C/C，杂种致死亲本类型2为T/T。其中KBoHL2-X对应正常的基因型，KBoHL2-Y对应杂种致死亲本类型2，KBoHL2-Common是反向引物。
实施例2.本发明开发的PCR标记与杂种致死亲本类型2的相关性验证
步骤1、提取基因组DNA
用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法分别提取正常自交系(“084”、“01-20中”、“02-12”、“79-156”、“01-88”、“SG643”、“雪早”、“引162”、“650绿”、“希望795”、“绿球”)、杂种致死亲本类型2(“明德”、“IKAMA”、“野生型007338”、“美味早生”、“CB201”、“铁4”、“湖北1180”、“华耐YC207”、“攀登”、“嘉宝”、“旺旺”、“Globe star”、“希望720”)的叶片的基因组DNA。
步骤2、采取引物组KBoHL2对甘蓝材料进行基因分型检测
委托华大基因公司合成KBoHL2的三段引物，利用KASP技术鉴定引物在甘蓝基因组DNA中的扩增情况。
合成引物时，在所述正向引物KBoHL2-X的5’端加上FAM标签序列(AAATGTCAAAAGCTCTCAACGCCACTA，SEQ ID NO.5)得到正向引物F1；在所述正向引物KBoHL2-Y的5’端加上HEX标签序列(AAATGTCAAAAGCTCTCAACGCCAC，SEQ ID NO.6)得到正向引物F2。正向引物F1(SEQ ID NO.7)：
5’-AAATGTCAAAAGCTCTCAACGCCACTACTCCGGGTTTTCCCGATATCC-3’；
正向引物F2(SEQ ID NO.8)：
5’-AAATGTCAAAAGCTCTCAACGCCACTACTCCGGGTTTTCCCGATATCT-3’。
用ddH2O将合成的正向引物F1、正向引物F2和反向引物(即反向引物KBoHL2-Common)按照1:1:1的浓度比配制成KASP引物混合液(即KASP Primer mix)。以步骤1得到的各甘蓝材料的基因组DNA为模板，按照下列反应体系和反应程序进行PCR反应。其中，阴性对照采用ddH2O代替模板DNA进行PCR反应。
PCR反应体系：体积为10.14uL，包括KASP Mater mix 5uL，KASP Primer mix0.14ul，模板DNA(20ng/uL)5uL。
其中KASP Mater mix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。荧光探针A的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(SEQ ID NO.9),其5’末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(SEQID NO.10)，其5’末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’(SEQ ID NO.11)，其3’末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’(SEQ ID NO.12)，其3’末端连接淬灭基团BHQ。KASP引物混合液包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物，其中正向引物F1、正向引物F2、反向引物在PCR扩增体系中的终浓度均为20ng/uL。
PCR扩增的条件为：第一轮降落PCR(touchdown PCR)，94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火60s，共10个Touch Down循环，每个循环降低0.6℃；第二轮PCR反应，94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
反应结束后，采取荧光微孔板检测仪对所得扩增产物进行荧光扩增，使用SNPviewer软件读取荧光信号数据并判断基因型。若待测甘蓝的扩增产物的荧光信号数据据经SNPviwer软件分析呈现蓝色，则所述待测甘蓝的基因型为C/C；若所述待测甘蓝的扩增产物的荧光信号数据据经SNPviwer软件分析呈现红色，则所述待测甘蓝的基因型为T/T；阴性对照的扩增产物的荧光信号数据经SNPviewer软件分析呈现黑色。所述T/T基因型为C04染色体46,333,244位置的脱氧核酸核苷酸为T的纯合体；所述C/C基因型核酸核苷酸为C的纯合体。
结果如图1和表1所示，将引物组KBoHL2用于甘蓝材料扩增时，所有正常自交系材料均检测为C/C基因型，所有甘蓝杂种致死亲本类型2材料均检测为T/T基因型，鉴定结果与田间表型的吻合率达到100％。
表1
Figure BDA0002944935300000081
上述实验数据表明，本发明提供的PCR标记和引物组KBoHL2能够准确鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2材料。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的PCR引物组及其应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 甘蓝C04染色体上序列
<400> 1
aaatgtcaaa agctctcaac gccactactc cgggttttcc cgatatctca tctaccatcg 60
ttcgagctac catcgtccag gcctccactg tctataacga t 101
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 引物KBoHL2-X
<400> 2
ctccgggttt tcccgatatc c 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 引物KBoHL2-Y
<400> 3
tactccgggt tttcccgata tct 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 引物KBoHL2-Common
<400> 4
gcctggacg atggtagctcg aa 22
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> FAM标签序列
<400> 5
aaatgtcaaa agctctcaac gccacta 27
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> HEX标签序列
<400> 6
aaatgtcaaa agctctcaac gccac 25
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 正向引物F1
<400> 7
aaatgtcaaa agctctcaac gccactactc cgggttttcc cgatatcc 48
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 正向引物F2
<400> 8
aaatgtcaaa agctctcaac gccactactc cgggttttcc cgatatct 48
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 荧光探针A
<400> 9
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 荧光探针B
<400> 10
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 淬灭探针A
<400> 11
agcatgaact tggtcacctt c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> 淬灭探针B
<400> 12
aatccgttga ctccgacctt c 21

Claims (10)

1.鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的PCR引物组，其特征在于：包括引物KBoHL2-X、KBoHL2-Y、KBoHL2-Common，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于：所述引物KBoHL2-X的5’端还添加有FAM标签序列成为正向引物F1，所述引物KBoHL2-Y的5’端还添加有HEX标签序列成为正向引物F2；
优选所述正向引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的PCR引物组；
优选还包括KASP检测所需的荧光探针、淬灭探针、Taq酶和dNTP；
优选包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。
4.权利要求1或2所述的PCR引物组、权利要求3所述的试剂盒在对甘蓝杂种致死亲本类型2进行鉴定或筛选中的应用。
5.一种SNP分子标记在鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2中的应用，其特征在于：所述SNP分子标记多态性位点对应于甘蓝C04染色体上的物理位置46,333,244，多态性为C/T；所述物理位置是基于甘蓝“TO1000”的全基因组序列确定的；
所述应用是指：
(1)通过鉴定待测SNP分子标记多态性位点鉴定或筛选甘蓝材料；
(2)基于所述SNP分子标记多态性位点上下游50-100bp区域内分别设计的上下游引物鉴定或筛选甘蓝材料；和/或
(3)基于所述SNP分子标记多态性位点上下游5-100bp且包含该位点的区间选取特异性探针鉴定或筛选甘蓝材料。
6.一种鉴定或筛选甘蓝杂种致死亲本类型2的方法，其特征在于：检测待测甘蓝C04染色体上46,333,244物理位置的基因型是T/T还是C/C，如果检测为T/T基因型则待测甘蓝为杂种致死亲本类型2，如果检测为C/C基因型则待测甘蓝不是杂种致死亲本类型2；
优选所述物理位置是基于甘蓝“TO1000”的全基因组序列确定的。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，具体方法为：提取待测甘蓝基因组DNA作为PCR扩增模板，采用权利要求1或2所述的PCR引物组或者权利要求3所述的试剂盒进行PCR扩增，检测扩增产物判断待测甘蓝C04染色体46,333,244位置的基因型是T/T还是C/C。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：采用权利要求2所述的PCR引物组或者权利要求3所述的试剂盒进行PCR扩增，扩增反应结束后，采取荧光微孔板检测仪对所得扩增产物进行荧光扩增，使用SNPviewer软件读取荧光信号数据并判断基因型，若待测甘蓝的扩增产物的荧光信号数据据经SNPviwer软件分析呈现蓝色，则待测甘蓝的基因型为C/C；若待测甘蓝的扩增产物的荧光信号数据据经SNPviwer软件分析呈现红色，则所述待测甘蓝的基因型为T/T。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：PCR反应体系以总体积10.14uL计为：KASPMater mix 5uL，浓度为20ng/uL的模板DNA 5uL，PCR引物组0.14ul，PCR引物组中的每个引物在反应体系中的终浓度均为20ng/uL。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：PCR扩增的条件为：第一轮降落PCR，94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火60s，共10个Touch Down循环，每个循环降低0.6℃；第二轮PCR反应，94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
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