CN111118208B - 小麦籽粒锌含量QTL qZn-5A的分子标记 - Google Patents

Abstract

本申请属于小麦分子育种技术领域，具体涉及小麦籽粒中锌元素含量相关QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用的专利申请。SNP1014标记位于小麦5A染色体上，其第36位碱基为一个36A‑36C的多态性位点，具有A/C多态性，当该位点为AA时，小麦籽粒中锌元素含量较高，当该位点为CC时，小麦籽粒中锌元素含量相对较低。发明人利用高密度SNP芯片基因型鉴定结果，结合鉴定数量性状中常用的关联分析方法，对小麦籽粒中锌元素积累表型与基因型之间的关联性进行了分析，最终筛选、鉴定获得了与小麦籽粒锌元素积累相关性状紧密连锁的遗传位点，而基于此可开发相应的功能标记，从而可为富锌小麦新品种培育奠定一定技术基础。

Description

小麦籽粒锌含量QTL qZn-5A的分子标记

技术领域

本申请属于小麦分子育种技术领域，具体涉及小麦籽粒中锌元素含量相关QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用的专利申请。

背景技术

小麦（Triticum aestivum L.）是世界上最重要的谷类作物之一，其产品提供人类饮食中20%的能量和蛋白质。但是营养统计表明，全世界约有20亿人口无法从日常饮食中摄取到足够的矿质元素，导致存在着较为普遍的营养不良现象。其中，锌元素的摄入不足即是较为典型的矿质元素摄入不足的代表。研究表明，人体内锌元素摄入不足时可对人类健康带来严重影响，典型如：可造成婴幼儿发育障碍、智力低下及适龄女性生育能力降低等问题。也因此，培育富含营养元素小麦新品种是缓解矿质元素摄入不足问题的一种重要技术途径。

现有研究表明，小麦籽粒中锌元素含量是一种复杂的数量性状，受多基因控制。因此，为培育富含锌元素的小麦新品种，如果利用传统育种手段对富锌小麦种质资源进行筛选，势必存在选择效率低、周期长、稳定性差等缺陷。分子标记辅助育种是解决该技术难题的有效手段。但需要注意的是，利用分子标记育种技术来提高小麦籽粒锌元素含量的前提是获得与小麦籽粒中锌元素积累有利的实用型分子标记。为此，开展小麦籽粒中锌元素积累的QTL定位及分子标记开发研究，对提升小麦营养健康品质和加速富锌小麦新品种选育工作具有积极的作用。

发明内容

本申请的主要目的在于提供两个与小麦籽粒中锌元素含量相关QTL紧密连锁的SNP分子标记qZnC.hnaas-3B（SNP2471）和qZnC.hnaas-5A（SNP1014），为富锌小麦品种的培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

与小麦籽粒中锌元素含量性状QTL qZnC.hnaas-3B（简写为：QTL qZn-3B）紧密连锁的SNP分子标记SNP2471，位于小麦3B染色体上，以“中国春”参考基因组v1.1版本参考序列为准，具体在第376,625,452位核苷酸处，其具体核苷酸序列为：

AGGTTTCCATATTATACACTGGTGCTTCCAAATCT[A/G]ATTTTTTTGGTTCAATGAAATAATAACTGCTTCAT，

其中第36位碱基（即“[A/G]”表示形式）为一个36A-36G的多态性位点，具有A/G多态性；具体而言：

当该位点为AA时，小麦籽粒中锌元素含量相对较高，为富锌有利基因型（也即，可以认为是高锌含量小麦）；核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示（72bp），具体为：

AGGTTTCCATATTATACACTGGTGCTTCCAAATCTAAATTTTTTTGGTTCAATGAAATAATAACTGCTTCAT；

当该位点为GG时，小麦籽粒中锌元素含量较低；为富锌不利基因型（也即，可以认为是低锌含量小麦）；核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示（72bp），具体为：

AGGTTTCCATATTATACACTGGTGCTTCCAAATCTGGATTTTTTTGGTTCAATGAAATAATAACTGCTTCAT。

与小麦籽粒中锌元素含量性状QTL qZnC.hnaas-5A（简称：QTL qZn-5A）紧密连锁的SNP分子标记SNP1014，位于小麦5A染色体上，以“中国春”参考基因组v1.1版本参考序列为准，具体在第650,240,330位核苷酸处，其具体核苷酸序列为：

GGTGTTTCCATTGTGCTCCAGTTGAGCTCCTTAAG[A/C]TATCGCACCATTTTACCCCTCTTCATCTCGCATGA；

其中第36位碱基（即“[A/C]”表示形式）为一个36A-36C的多态性位点，具有A/C多态性；具体而言：

当该位点为AA时，小麦籽粒中锌元素含量相对较高，为富锌有利基因型（也即，可以认为是高锌含量小麦）；核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示（72bp），具体为：

GGTGTTTCCATTGTGCTCCAGTTGAGCTCCTTAAGAATATCGCACCATTTTACCCCTCTTCATCTCGCATGA；

当该位点为CC时，小麦籽粒中锌元素含量相对较低；为富锌不利基因型（也即，可以认为是低锌含量小麦）；核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示（72bp），具体为：

GGTGTTTCCATTGTGCTCCAGTTGAGCTCCTTAAGCCTATCGCACCATTTTACCCCTCTTCATCTCGCATGA。

所述分子标记SNP2471或SNP1014在小麦富锌品种分子标记辅助选择中的应用，或者用来区分高锌含量、低锌含量小麦品种。

现有技术中，针对其他作为作物中与锌元素积累的基因，已有了初步研究，例如，Swamy等定位了影响水稻锌元素积累的基因，并应用于作物的遗传改良过程当中（Swamy etal., Advances in breeding for high grain Zinc in Rice，2016，Rice）；而Descalsota等、Hindu等利用关联分析方法对水稻、玉米等多种作物中的锌元素积累QTL进行了检测（Descalsota GIL et.al.，Genome-Wide Association Mapping in a Rice MAGIC PlusPopulation Detects QTLs and Genes Useful for Biofortification，2018，Front.Plant Sci.；Hindu et.al. ，Identification and validation of genomic regionsinfluencing kernel zinc and iron in maize，2018，Theor Appl Genet）。

本申请中，发明人利用高密度SNP芯片基因型鉴定结果，结合鉴定数量性状中常用的关联分析方法，对小麦籽粒中锌元素积累表型与基因型之间的关联性进行了分析，最终筛选、鉴定获得了与小麦籽粒锌元素积累紧密连锁的位点与基因，而基于此可开发相应的功能标记，从而可为富锌小麦新品种培育奠定一定技术基础。

附图说明

图1为不同环境关联群体锌元素含量表现型数据的正态分布；左侧为商丘地区结果，右侧为原阳地区结果；

图2为不同环境小麦籽粒锌元素积累性状全基因组关联分析曼哈顿图，中间红色虚线为-log10P=4的阈值线；中间红色圆圈代表本发明所筛选到的分子标记在两个环境中同时被鉴定，该标记位于小麦3B染色体上第376,625,452位碱基；上图为商丘地区结果，下图为原阳地区结果；

图3为不同环境小麦籽粒锌元素积累性状全基因组关联分析曼哈顿图，中间红色虚线为-log10P=4的阈值线；中间红色圆圈代表本发明所筛选到的分子标记在两个环境中同时被鉴定，该标记位于小麦5A染色体上第650,240,330位碱基；上图为商丘地区结果，下图为原阳地区结果；

图4为SNP2471标记在关联群体中的基因分型及表型分布图：橙色（左侧）代表AA基因型个体的表型分布情况，绿色（右侧）代表GG基因型的表型分布情况，两种基因型小麦籽粒锌元素含量之间的差异达到极显著水平；

图5为SNP1014标记在关联群体中的基因分型及表型分布图：橙色（左侧）代表AA基因型个体的表型分布情况，绿色（右侧）代表GG基因型的表型分布情况，两种基因型小麦籽粒锌元素含量之间的差异达到极显著水平。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

下述实施例中所涉及小麦材料均由河南省农业科学院小麦研究所提供（也均为可公开获得性小麦品种），分析所用关联群体材料由207份不同小麦品种组成，于2017年分别种植于河南省农业科学院原阳基地和商丘市两个地区，待生理成熟后进行收获，并用于本申请中的相关分析。

实施例1

首先需要解释的是，基于现有研究，发明人认为锌元素含量属于一个由数量型基因控制的积累性状，因此，在筛选、确定SNP分子标记前，只有获得合适的样本群体后才能进行进一步的筛选，为此，发明人以现有技术中部分典型小麦品种在不同地区种植收获后籽粒为例，对不同品种小麦籽粒中锌元素含量进行测定，以确定所构建样本群体是否适合用来后续分子标记的筛选、鉴定。由于小麦种植过程均是常规过程，因此仅就不同环境种植条件下小麦籽粒中锌元素积累表现型数据测定及分析情况简要介绍如下。

（一）小麦籽粒锌元素积累表型测定

本申请中，利用消解和分光光度法来测量小麦籽粒中锌元素含量，具体步骤如下：

（1）样品前处理：

用小型粉碎机粉碎小麦籽粒，过孔径0.15mm的筛子；

取0.5g样品放入消解管中，依次加入5 mL硝酸和2mL过氧化氢，轻轻摇晃混匀后静置20min，将样品放入微波消解仪进行消解；

最后过滤消解液并用1%硝酸溶液定容至50mL；

（2）标准曲线的建立：

将待测元素（锌）标准样品(购自中国国家标准物质中心)配制成4个梯度(0.02mg/mL, 0.05mg/mL, 0.1mg/mL, 0.2mg/mL)，用于建立锌元素的标准曲线；

（3）矿质元素测定：

利用日本岛津原子吸收分光光度仪AA-6300，采用火焰-原子吸收法测定小麦样品中锌元素含量，重复3次。

最终样品群体内每个小麦品种籽粒的锌元素含量与小麦品种关联情况如下表1所示。

表1 207个小麦品种标记位点基因型及籽粒锌元素含量

续上表：

续上表：

续上表：

续上表：

注： N为未知基因型。

（二）表型数据分析

对关联群体不同环境调查获得的表现型数据进行描述型处理，结果如下表2所示，同时绘图如图2所示。

表2，不同环境关联群体锌元素含量描述型统计

注：SD，标准偏差；峰度，表征概率密度分布曲线在平均值处峰值高低的特征数；偏度，统计数据分布偏斜方向和程度的度量，是统计数据分布非对称程度的数字特征。

从上表结果可以看出，不同环境条件下小麦籽粒中锌元素含量变异范围为31.87-128.22 mg/kg，并且不同地点之间的小麦籽粒中锌元素含量变异幅度和平均值存在一定的差异，推测认为是由于环境影响所导致的。而从图1可以看出，不同环境下关联群体锌元素含量积累表现型数据均符合正态分布，反映出该群体包含的小麦品种具有广泛的表型多样性，是进行后续关联分析的理想群体。

实施例2

在实施例1检测不同品种中锌含量同时，发明人利用Axiom® Wheat 660K SNP芯片对样品群体中的所有品种进行了基因型判定。需要说明的是，该芯片包含了超过630,000个均匀分布在小麦全基因组中的特异SNP位点，能提供足够的SNP标记密度，因此可用于全基因组关联分析。具体过程简介如下。

（一）首先，利用CTAB（Cetyl trimethylammonium bromide）法提取小麦叶片基因组DNA，具体步骤参考如下：

取0.5g小麦叶片样品放入液氮中速冻，迅速研磨打碎；

加入700μL、65℃的CTAB提取液，水浴30min，对组织进行裂解；

冷却至室温加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）溶液，对样品进行萃取；

室温离心5min（12000rpm/min），吸取450μL上清液，将其转至1.5mL离心管；

加入等体积冷冻异丙醇，以析出絮状DNA；离心5min（12000rpm/min），倒掉上清，获得DNA沉淀；

加入75%乙醇溶液，漂洗两遍；晾干8小时，加入400μL的ddH₂O将DNA溶解备用；

溶解后的DNA用NanoDrop™ One (Thermo Fisher Scientific, Wilmington,DE, USA)系统进行浓度与纯度检测，确保满足后续分析需要。

（二）参考SNP芯片说明书，进行基因型判定；进一步对207份关联群体基因型数据进行质量控制，剔除检出率低于90%（基因型缺失数据少于10％）和最小等位基因频率（MAF）小于0.05的SNP标记，最终筛选获得244,508个有效SNP标记可用于后续的GWAS研究（Genome-Wide Association Studies，全基因组关联研究）。

实施例3

在实施例1、2基础上，结合207份不同小麦品种在不同环境下的锌元素表型数据和基因型数据，发明人利用现有的MLM模型（Mixed Linear Model，混合线性模型，该模型可有效校正群体结构和亲缘关系对分析结果的影响）进行了全基因组关联分析，该模型具体为：

Y = Xα + Zβ + μ + e

其中：Y为表型值，X为群体结构矩阵，α为固定效应估计参数；Z为亲缘关系矩阵，β为分子标记效应，μ为随机效应估计系数，e为随机偏差。

需要注意的是，不同标记之间可能存在紧密连锁关系，因此需要估算独立标记的有效数量以降低假阳性发生概率。

本申请筛选标记过程中，将关联分析显著性阈值定为1.0e-04。

最终分析结果表明，基因芯片上位于3B染色体的第376,625,452位核苷酸与小麦籽粒锌元素含量积累显著相关（P<1.0e-04），并在2个不同环境中被同时鉴定（结果如图2所示），而不同环境下，SNP2471标记的表型解释率分别为14.75%和19.07%（结果如表3所示）。同时，基因芯片上位于5A染色体的第650,240,330位核苷酸与小麦籽粒锌元素含量积累显著相关（P<1.0e-04），并在2个不同环境中被同时鉴定（结果如图3所示），不同环境下，SNP1014标记的表型解释率分别为15.59%和15.89%（结果如表4所示）。

表3， SNP2471标记关联分析结果

。

表4， SNP1014标记关联分析结果

。

进一步分析后，SNP2471标记的具体核苷酸序列为：

AGGTTTCCATATTATACACTGGTGCTTCCAAATCT[A/G]ATTTTTTTGGTTCAATGAAATAATAACTGCTTCAT，

其序列的第36位碱基存在一个36A-36G的多态性位点；

SNP1014标记的具体核苷酸序列为：

GGTGTTTCCATTGTGCTCCAGTTGAGCTCCTTAAG[A/C]TATCGCACCATTTTACCCCTCTTCATCTCGCATGA，

在此序列的第36位碱基存在一个36A-36C的多态性位点。

而对两个标记不同基因型情况下小麦籽粒锌元素积累情况进一步进行统计，结果如下表5、表6所示。

表5， SNP2471标记不同基因型对小麦籽粒锌元素积累的影响

表6， SNP1014标记不同基因型对小麦籽粒锌元素积累的影响

注，“1”为不同基因型个体2个环境下的表型平均值；“2”为不同基因型个体之间的差异显著性分析。

对上表5分析可知，基因型为AA的小麦材料中籽粒锌元素积累能力极显著高于GG材料，其中AA单倍型的小麦籽粒锌元素含量比GG单倍型材料增加了20.46%。因此，可以认定AA基因型小麦籽粒积累锌元素的能力更强。上述结果表明，AA基因型相对于GG基因型而言为优势单倍型（如图4所示）。

对上表6分析可知，基因型为AA的个体小麦籽粒锌元素积累能力极显著高于CC个体，其中AA单倍型的小麦籽粒锌元素含量比CC单倍型材料增加了16.28%。因此，可以认定AA基因型小麦籽粒积累锌元素的能力更强。上述结果表明，AA基因型相对于CC基因型而言为优势单倍型（如图5所示）。

综上，发明人认为，由于分子标记技术在苗期即可准确快速的预测出成熟期小麦籽粒锌元素积累情况，从而降低育种的时间成本；同时由于分子标记检测技术具有通量大、检测效率高等优点，因此，利用本申请筛选获得的分子标记可在富锌小麦新品种选育及优异种质资源筛选中发挥较好应用效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 小麦籽粒锌含量QTL qZn-5A的分子标记

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 1

aggtttccat attatacact ggtgcttcca aatctaaatt tttttggttc aatgaaataa 60

taactgcttc at 72

<210> 2

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 2

aggtttccat attatacact ggtgcttcca aatctggatt tttttggttc aatgaaataa 60

taactgcttc at 72

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 3

ggtgtttcca ttgtgctcca gttgagctcc ttaagaatat cgcaccattt tacccctctt 60

catctcgcat ga 72

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 4

ggtgtttcca ttgtgctcca gttgagctcc ttaagcctat cgcaccattt tacccctctt 60

catctcgcat ga 72

Claims (1)

1.与小麦籽粒锌含量性状相关的分子标记在小麦品种培育中的应用，其特征在于，该分子标记命名为SNP1014，该标记位于小麦5A染色体上，具体核苷酸序列为：

GGTGTTTCCATTGTGCTCCAGTTGAGCTCCTTAAG[A/C]TATCGCACCATTTTACCCCTCTTCATCTCGCATGA，

其中第36位碱基为一个36A-36C的多态性位点，具有A/C多态性；具体而言：

当该位点的基因型为AA时，为小麦籽粒富锌有利基因型；

当该位点的基因型为CC时，为小麦籽粒富锌不利基因型；

所述应用为在富锌小麦品种分子标记辅助育种中应用。

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