CN108456745A - 小麦籽粒颜色相关caps标记及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦籽粒颜色相关CAPS标记及其检测方法，涉及的是小麦分子育种的技术领域，所述CAPS标记命名为KU4104‑6AL，序列为：SEQ ID NO.1，记鉴定小麦籽粒颜色的方法，包括以下步骤：步骤1、提取待测小麦基因组DNA，步骤2、利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的序列对步骤1获得的小麦基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；步骤3、利用NruI内切酶对所述扩增产物进行酶切，内切酶识别序列为TCG/CGA，获得酶切产物；步骤4、当酶切产物为214bp和212bp时，对应的小麦籽粒颜色较浅，其对应扩增产物的基因型命名为KU4104‑6AL‑a；当酶切产物为426bp时，对应的小麦籽粒颜色较深。本发明开发出的CAPS标记KU4104‑6AL可以有效区分小麦籽粒颜色深浅，用于小麦穗发芽抗性及面粉品质的遗传改良。

Description

小麦籽粒颜色相关CAPS标记及其检测方法

技术领域

本发明涉及的是小麦分子育种的技术领域，尤其涉及的是一种小麦籽粒颜色相关CAPS标记及其检测方法。

背景技术

小麦收获前遇到连阴雨天气容易造成已经生理成熟的籽粒直接在麦穗上发芽，这种现象称为收获前穗发芽(Pre-harvest sprouting，PHS)。小麦穗发芽不仅降低产量，而且劣化品质(特别是加工品质)，影响种用价值。世界主要小麦生产国大都遭受穗发芽危害，如中国，加拿大，澳大利亚，美国，日本等，我国长江中下游麦区、西南麦区、东北春麦区，以及黄淮南部麦区穗发芽发生较为频繁(Xiao等2002；Liu等2013；Zhou等2017)。

小麦籽粒颜色与穗发芽抗性紧密相关。一般情况下，籽粒颜色越深，穗发芽抗性越强，即红皮小麦比白皮小麦具有更强的穗发芽抗性。此外，小麦籽粒颜色也是影响面粉色泽的重要因素之一。在国际市场中，尤其在亚洲地区，消费者以及面粉加工业更青睐白皮小麦，因为白麦皮薄，出粉率高，种皮色浅，胚乳色泽洁白，麦皮混入面粉内对比不明显，因此加工出的面粉色泽相对较好，具有价格优势，而红麦种皮呈棕红色，种皮混入面粉内对比很明显，影响面粉色泽。

小麦籽粒内的红色素主要受R-A1、R-B1和R-D1基因控制，且位于小麦第三同源染色体组(Allan和Vogel1，1965)。Himi等(2005，2011)通过染色体定位以及类黄酮生物合成途径关键酶基因的功能分析，如查尔酮合成酶(CHS,group 1,2)，查耳酮异构酶(CHI,group5)，黄烷酮-3-羟化酶(F3H,group 2)和二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR,group 3)，认为Tamyb10是R-1的候选基因，其编码一种MYB型转录因子，主要通过调控上述几种关键酶基因表达，从而调控种皮红色素合成(Li等1999；Himi和Noda 2004；Himi等2005，2011；Khlestkina等2011；Shoeva等2014；Shoeva和Khlestkina 2015)。

据资料报道，除Tamyb10外，小麦籽粒颜色同时也受其它QTL影响。Groos等(2002)在3A、3B、3D及5AS染色体上检测到与籽粒颜色相关的QTL，其中位于3A、3B、3D染色体上的QTL与之前定位到R-1基因位置相近，位于5AS染色体上的QTL为新位点。Kumar等(2005)检测到12个与小麦籽粒颜色相关的QTL，分别位于1D、2B、2D、3A、3B、3D、5D和6B，其中QGc.ccsu-2B.1、QGc.ccsu-2B.2、QGc.ccsu-2D.1、QGc.ccsu-5D.1、QGc.ccsu-6B.1为新发现的主效QTL。Lin等(2016)检测到4个与小麦籽粒颜色显著相关的QTL，分别位于1B、3A、3B和3D染色体，其中位于1B染色体的QTL是一个新位点。Zhou等(2017)鉴定到32个与籽粒颜色相关的QTL，其中20个已被报道，11个为新位点。由上述结果可知，小麦籽粒颜色的遗传机理较为复杂，受多基因网络共同调控，鉴定更多籽粒颜色相关位点，并开发与其紧密连锁的分子标记，有助于提升对籽粒颜色分子调控机制的认识，以及候选基因的克隆，从而应用于小麦穗发芽抗性以及面粉品质的遗传改良。

目前，小麦籽粒颜色的测定方法主要有：计算机识别、肉眼识别(NaOH浸泡、比色卡)以及色差仪测定法。计算机识别法通常采用RGB颜色系统，将RGB颜色信息和HIS颜色配合使用来识别小麦籽粒颜色(Majumdar等2000；White等2005；石小凤2013)。沈正兴(1991)和吴兆苏(1987)等使用黄纳粉配制10个浓度梯度，均匀涂于白纸上，着色成10个色级的色卡，各品种籽粒对照色卡，分别测定种皮所属色级，色级小于等于5者划为白皮品种。Kumar(2005)、Fofana(2009)、Himi(2011)、Lin(2016)等均采用NaOH浸泡法测定小麦籽粒颜色。Wang(2007)等采用国际照明委员会(CIE)制定的L*a*b空间系统，使用Grams/32软件测定小麦籽粒颜色。Groos等(2002)使用色度仪测定小麦籽粒颜色，其原理同样参照国际照明委员会(CIE)制定的L*a*b空间系统，并认为色度仪测定的a*值最能反映籽粒颜色。

QTL定位方法主要有基于双亲的连锁分析和全基因组关联分析。前者需要构建定位群体，耗时较长，且QTL仅局限于两个亲本所存在的差异位点。后者以连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)为基础，通过识别数百个或数千个个体中高密度的分子标记，筛选出与复杂性状表现型变异相关联的分子标记，进而分析这些分子标记对表型的遗传效应(谭贤杰等2011)。且随着高密度SNP芯片的开发，关联分析方法能够高效检测影响目标性状的所有位点。尤其连锁分析与关联分析的结合更有利于验证并精细定位目标位点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种小麦籽粒颜色相关CAPS标记及其检测方法。

本发明主要以遗传背景丰富的192份小麦品种组成的自然群体为试验材料，利用高密度90K SNP芯片对其进行基因型扫描，并采用色度计(Minolta CM-5)(2017年)以及肉眼观测(2015和2017年)方法测定籽粒颜色，采用TASSEL 5.0软件进行基因型与表型的关联分析，结果在6AL染色体上显著关联到一个籽粒颜色新位点，基于与该位点紧密连锁的SNP标记(Kukri_rep_c70994_104)，进一步开发一个CAPS标记(KU4104-6AL)，并利用连锁群体京411/红芒春21群体(RIL,174份家系)和自然群体(192份小麦品种)共同验证了该位点与籽粒颜色显著相关。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明利用关联分析在小麦6AL染色体上鉴定到一个与籽粒颜色显著相关的新主效位点，其连锁SNP标记为Kukri_rep_c70994_104(607956719bp)，基于该标记提供一种与小麦籽粒颜色相关的CAPS标记，所述CAPS标记命名为KU4104-6AL，所述CAPS标记的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1

n为a或g，N为碱基G或A；京411为G，红芒春21为A

本发明还提供一种用于检测上述的CAPS标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：

F：GAGGCGTTTGCTTATTGC SEQ ID NO.2

R：CTTGCTTCCCATCATCATCT SEQ ID NO.3。

本发明还提供一种利用上述的CAPS标记鉴定小麦籽粒颜色的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1、提取待测小麦基因组DNA

步骤2、利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的序列对步骤1获得的小麦基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

步骤3、利用NruI内切酶对所述扩增产物进行酶切，内切酶识别序列为TCG/CGA，获得酶切产物；

步骤4、当酶切产物为214bp和212bp时，其对应扩增产物的基因型命名为KU4104-6AL-a，对应的小麦籽粒颜色在L*a*b色彩系统对应的a/L数值范围为0.134-0.187，对应籽粒颜色较浅；当酶切产物为426bp时，其对应扩增产物的基因型命名为KU4104-6AL-b，对应的小麦籽粒颜色L*a*b色彩系统对应的a/L数值范围为0.165-0.206，对应籽粒颜色较深。

即利用CAPS标记分析不同小麦品种的基因型，共存在两种基因型KU4104-6AL-a和KU4104-6AL-b，当品种含有KU4104-6AL-a基因型(含有碱基G),则能够被限制性内切酶NruI切开，产生的扩增产物长度为214bp和212bp，籽粒颜色较浅；当品种含有KU4104-6AL-b基因型(含有碱基A),则不能够被限制性内切酶NruI切开，扩增产物长度为426bp，籽粒颜色较深。

本发明相比于现有技术具有以下优点：

本发明利用关联分析在小麦6AL染色体上鉴定到一个与籽粒颜色显著相关的新主效位点，其连锁SNP标记为Kukri_rep_c70994_104(607956719bp)，基于该标记进一步开发一个CAPS标记KU4104-6AL，然后利用连锁群体和关联群体共同验证了该新位点与籽粒颜色紧密相关。本发明鉴定的新位点为候选基因的克隆奠定了重要基础，开发的CAPS标记可以为小麦抗穗发芽育种以及品质遗传改良提供分子标记。

附图说明

图1为酶切产物琼脂糖电泳图。

M：marker；1：京411；2：红芒春21；a：酶切之前；b：酶切之后。

具体实施方式

1、籽粒颜色测定：

种皮颜色采用色度仪(Minolta CR-5)测定。该仪器采用L*a*b色彩系统来评定颜色(CIE 1931)。在该色彩系统中，L值测定黑(0)-白(100)，当a为正值时，表示红色，反之则为绿色，当b为正值时，表示黄色，反之则为蓝色，而种子的亮度也是种皮颜色应考虑得因素，因此本发明采用a/L值表示种皮颜色，并使用GC(grain color)表示。称取约20g种子置于该仪器半径约25mm的培养皿中，三次重复，取其平均值代表各品种籽粒颜色表型值。在京411/红芒春21群体，2017年采用色度仪测定籽粒颜色表型，记为17GrainColor-JH；2015和2017年采用肉眼观看籽粒颜色，记为15GC-JH和17GC-JH。对于192份小麦品种，2017年采用色度仪测定籽粒颜色表型，记为17GrainColor-192；2017年采用肉眼观看籽粒颜色，记为17GC-192。

2、SDS-Tris饱和酚法抽提小麦基因组DNA

(1)取2-3粒小麦种子置于2ml灭菌离心管，利用电动粉碎机将种子研磨成粉末；

(2)加入1.2ml DNA提取缓冲液(200mM Tris-Cl,250mM N_aCl,25mM EDTA,0.5％SDS,2％β-ME)；

(3)60℃水浴45min，期间间歇振荡7-8次，以充分提取DNA；

(4)室温下12000rpm离心10min；

(5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，加入预冷的等体积Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡避免出现分层；

(6)室温下12000rpm离心10min；

(7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，重复步骤(5)、(6)，以充分去除蛋白；

(8)转移上清液至新的1.5ml灭菌离心管中，加入0.6倍异丙醇和0.1倍体积NaAc(pH5.2)，轻轻颠倒混匀后于冰上静置20min或更久，使DNA白色沉淀充分析出；

(9)4℃10000rpm离心10min；

(10)弃上清，加入预冷的70％乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾干，加入100μl其中含2μl 10mg/ml RNase酶的1×TE缓冲液(或双蒸水)过夜溶解；

(11)在NanoVue Plus微量分光光度计上检测DNA浓度，并统一稀释成50-60ng/uL工作液，-20℃冰箱保存备用。

3、CAPS引物设计，PCR扩增与检测

利用Primer Premier6.0软件设计KU4104-6AL引物(F：GAGGCGTTTGCTTATTGC；R：CTTGCTTCCCATCATCATCT)。CAPS标记PCR扩增体系为10μL,包括10×buffer(含有2.0mmol L-1Mg²⁺)1.0μL,2.5mmol L-1dNTPs 0.8μL,5UμL-1 EasyTaq DNA polymerase 0.1μL,10μmolL-1上下游引物各0.4μL,2.0μL模板DNA(50～60ngμL-1),ddH2O 5.3μL。PCR程序设定：94℃预变性5min，40个循环(94℃变性30S，62℃退火30S，72℃延伸30S)，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物利用NruI内切酶进行酶切，酶切时间及方法参考网站说明书(http://www.neb-china.com)。酶切产物利用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析检测，GelStain荧光染料染色，BIO-RAD凝胶成像系统扫描拍照，如图1。

酶切产物为214bp和212bp时，其对应扩增产物的基因型命名为KU4104-6AL-a；酶切产物为426bp时，其对应扩增产物的基因型命名为KU4104-6AL-b。4、CAPS标记对籽粒颜色效应的验证

利用KU4104-6AL标记对192份小麦品种以及京411/红芒春21群体进行基因型分析，共存在两种基因型KU4104-6AL-a和KU4104-6AL-b，其中携带KU4104-6AL-b带型的材料其籽粒颜色较深。T-test测验结果表明，两种等位基因型在京411/红芒春21群体及192份自然群体籽粒颜色表型上差异达显著或极显著水平(P＜0.01)(表1)，验证了该标记与籽粒颜色显著相关。

当酶切产物为214bp和212bp时，其对应扩增产物的基因型命名为KU4104-6AL-a(含有碱基G),则能够被限制性内切酶NruI切开，对应的小麦籽粒颜色在L*a*b色彩系统对应的a/L数值范围为0.134-0.187，对应籽粒颜色较浅；当酶切产物为426bp时(含有碱基A),则不能够被限制性内切酶NruI切开，其对应扩增产物的基因型命名为KU4104-6AL-b，对应的小麦籽粒颜色L*a*b色彩系统对应的a/L数值范围为0.165-0.206，对应籽粒颜色较深。

表1 KU4104-6AL标记在京411/红芒春21(RIL)群体和自然群体(192份小麦品种)中与种皮颜色的相关性(**在置信度为0.01时，相关性极显著)

由上述可以看出本发明中采用的关联分析法是定位和挖掘数量性状位点的一条有效途径，本发明中以自然群体为材料，将基因多样性与表型变异关联，从而鉴定出与目标性状紧密关联的标记位点。本发明利用192份小麦品种组成的自然群体，并结合籽粒颜色表型进行关联分析，在小麦6AL染色体上鉴定到一个控制籽粒颜色的新位点，与SNP标记(Kukri_rep_c70994_104)紧密连锁；

基于与籽粒颜色显著关联的SNP标记(Kukri_rep_c70994_104)，将其进一步转化成可以用琼脂糖电泳快速检测的CAPS标记，命名为KU4104-6AL；

进一步在192份小麦品种以及京411/红芒春21RIL群体中分析KU4104-6AL标记的多态性，验证了其对籽粒颜色表型的效应。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 小麦籽粒颜色相关CAPS标记及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 426

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L)

<220>

<221> misc_feature

<222> (217)

<223> n is a or g

<400> 1

gaggcgtttg cttattgctt cataatctgc atgcctttgc aaaccctttt ccatttggat 60

ttaatttgtt tttctcattt gcagaaaggc atatcggggt ctcgtcgcag tcttgcagag 120

attgaatggt tagtttgaca gaataacccc tgtacagaca gatagcgagg ctagccttac 180

cagtagtcgt tgtccagtgc cgtcgtcgga gctcgcnaaa gcctttgatt gtaaataaag 240

gagggggcct ctgggaataa agagaaagag aagagatttt acttgttcaa aaggagagaa 300

gttgtatatt tgtaccgttt tttcctcttc gagtaagata catatataaa tatatatata 360

agaaaggcaa agcatggaag caaaattagc tgaaatattt agggttagat gatgatggga 420

agcaag 426

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

gaggcgtttg cttattgc 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

cttgcttccc atcatcatct 20

Claims (3)

1.一种与小麦籽粒颜色相关的CAPS标记，其特征在于，所述CAPS标记命名为KU4104-6AL，所述CAPS标记的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

2.一种用于检测权利要求1所述的CAPS标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为：F：GAGGCGTTTGCTTATTGC SEQ ID NO.2

R：CTTGCTTCCCATCATCATCT SEQ ID NO.3。

3.一种利用权利要求2所述的CAPS标记鉴定小麦籽粒颜色的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤1、提取待测小麦基因组DNA

步骤2、利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的序列对步骤1获得的小麦基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

步骤3、利用NruI内切酶对所述扩增产物进行酶切，内切酶识别序列为TCG/CGA，获得酶切产物；

步骤4、当酶切产物为214bp和212bp时，其对应扩增产物的基因型命名为KU4104-6AL-a，对应的小麦籽粒颜色在L*a*b色彩系统对应的a/L数值范围为0.134-0.187，对应籽粒颜色较浅；当酶切产物为426bp时，其对应扩增产物的基因型命名为KU4104-6AL-b，对应的小麦籽粒颜色L*a*b色彩系统对应的a/L数值范围为0.165-0.206，对应籽粒颜色较深。