CN101619358A - 一种白菜品种鉴定的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白菜品种鉴定的方法及其专用试剂盒。该试剂盒，包括引物组合I、引物组合II、引物组合III、引物组合IV、引物组合V和引物组合VI。该方法，是以待测白菜的DNA为模板，以权利要求1所述的试剂盒的引物组合分别进行PCR扩增，检测多态性片段大小，跟已知白菜品种用该引物组合进行PCR扩增得到的多态性片段大小相对比，若他们扩增得到的片段大小均一致，则该待测白菜的品种与已知白菜品种是同一个品种；如果该待测白菜样品扩增得到的多态性片段与已知白菜品种扩增得到的多态性片段不一致，则该待测品种白菜不是该已知白菜品种。该方法操作方便简单，可以高效准确和全面进行白菜品种的真实性和一致性鉴定。

Description

一种白菜品种鉴定的方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种白菜品种鉴定的方法及其专用试剂盒。

背景技术

白菜类蔬菜是原产于我国并广受欢迎的蔬菜，并且其栽培面积极广适应于全国各种气候条件下栽培。由于品种的差异直接影响这类蔬菜的生产和使用性能，品种鉴别尤为重要。对于控制种子质量的商品种子品种鉴别，新品种登记的品种测试以及资源种质遗传多样性分析，都非常需要发展一种高效、快速、准确和经济实用的白菜类蔬菜的品种鉴别方式。

经典的鉴定方法是形态标记的田间检测(孟淑春，郑晓鹰，刘玉梅，何伟明，刘庞源.2005.大白菜种质资源形态形状的多样性分析.华北农学报，20(4)：57-61)，近年来分子标记作为一种植物基因组特征分析手段，是继形态标记，细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的基因标记形式，其具有的许多优势是基于DNA水平多态性的遗传标记。众所周知，目前已使用的分子标记技术不下数十种(张书芬，傅廷栋，李媛媛，朱家成，王建平，马朝芝.2006.SRAP标记分析甘蓝型油菜多态性.华北农学报，21(1)：50-54；Li L，Zheng X Y，Klocke E.2003.Identificationof hybrid purity of tomato(Lycopersicon esculentum)using RAPD markers.Guihaia，23(2)：149-154；Li L，Zheng X Y，Klocke E.2004.Variation in Some Lycopersicumesculentum and Capsicum annuum Cultivars Revealed by RAPD and AFLP Markers.Guangxi Sciences 11(3)：249-257；郭晶心，周乃元，马荣才，曹鸣庆.2002.白菜类蔬菜遗传多样性的AFLP分子标记研究.农业生物技术学报，10(2)：138-143；忻雅，崔海瑞，张帆，林荣杓，2007.EST-SSR标记在白菜种质资源分析中的应用.浙江农业科学，6：628-629)。

SSR技术由于其多态性和重复性表现是目前研究和应用的热点与首选技术，微卫星DNA是一种核酸简单重复序列，简称SSR，广泛存在于真核生物的基因组中。SSR的核心单位一般由2-5个核苷酸组成，两侧一般是保守序列，可用于设计引物并进行扩增。SSR的特点主要有：数量丰富，覆盖整个染色体组；具有多等位基因特性，信息含量高；共显性遗传；用于PCR分析时重复性好。虽然植物中SSR的数量约为哺乳动物的六分之一，但其多态性水平与动物中相当。比较RAPD、ALFP和SSR标记的稳定性，SSR标记最稳定和可靠，不同实验室的得到的实验结果之间，可比性最强。通过设计引物进行SSR的多态性分析的方法已在许多植物中得到应用。迄今为止，已从小麦、水稻、玉米、大麦、马铃薯、油菜、西红柿等作物基因组中分离得到SSR，大多数表现出较好的多态性。目前已有研究将此项技术应用到大豆、小麦、水稻、大麦等作物的品种鉴定方面，也可用于杂交种的纯度鉴定。这种方法在作物上应用较多的主要原因是目前已有一些引物序列能对多态性较高的SSR等位基因进行分析。根据研究结果，在不同的实验室不同的实验系统条件下，与RAPD和AFLP标记相比，SSR标记的实验差异是最小的，即SSR的稳定性是最好的。

SSR标记检测方式在蔬菜上的应用还不太多，因为有效的SSR标记的数量有限。然而，有效的SSR引物的获得，要耗费大量的时间和财力。依据最新的研究成果，EST-SSR标记可以减少巨大的投入，使获得大量有效的SSR标记成为切实可行的途径。表达序列标签(expreessed sequence tags)EST是指对cDNA克隆进行随机的、单项测序所获得的一段核苷酸序列。自Adams等在人类基因组研究中使用这一概念以来，EST技术已被广泛应用于新基因的克隆、组织特异性基因表达谱分析以及基因组序列的功能注释等许多研究领域。EST现已成为大规模获取功能基因的一种最为快捷和有效的研究手段。目前，国际上最大的EST专门数据库dbEST中已有25,959,961个EST片段。芸薹属中EST数目最多的是油菜，共45,906条，结球白菜有12,583条EST信息。由EST信息库形成有效的SSR标记成为一种明智的选择。目前，在葡萄、甘蔗、小麦和大麦上都有利用这种方式形成了EST-SSR标记的报道。利用MISA软件在EST信息库的基础上得到SSR核心序列和核心序列单元重复数，以及引物和扩增片断的大小。

发明内容

本发明的发明人为了有效和全面鉴定白菜品种，研制了EST-SSR复合标记检测技术，提供了一种白菜品种真实性及一致性鉴定的方法及其专用试剂盒。

本发明所提供的白菜品种鉴定的试剂盒，是包括6套EST-SSR复合标记引物组合的试剂盒，它包括下述引物组合：

1)引物组合I：由核苷酸序列分别为序列表序列1和序列表中序列2的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列3和序列表中序列4的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列5和序列表中序列6的引物对组成；

2)引物组合II：由核苷酸序列分别为序列表序列7和序列表中序列8的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列9和序列表中序列10的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列11和序列表中序列12的引物对组成；

3)引物组合III：由核苷酸序列分别为序列表序列13和序列表中序列14的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列15和序列表中序列16的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列17和序列表中序列18的引物对组成；

4)引物组合IV：核苷酸序列分别为序列表序列19和序列表中序列20的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列21和序列表中序列22的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列23和序列表中序列24的引物对组成；

5)引物组合V：由核苷酸序列分别为序列表序列25和序列表中序列26的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列27和序列表中序列28的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列29和序列表中序列30的引物对；和

6)引物组合VI：由核苷酸序列分别为序列表序列31和序列表中序列32的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列33和序列表中序列34的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列35和序列表中序列36的引物对组成。

本发明所提供的白菜品种鉴定的方法，是以待测白菜的DNA为模板，以权利要求1所述的试剂盒的引物组合I-VI分别进行PCR扩增，检测多态性片段大小，跟已知白菜品种(标准对照样品)用该引物组合进行PCR扩增得到的多态性片段大小相对比，若他们扩增得到的片段大小均一致，则该待测白菜的品种为该已知的白菜品种(标准对照样品)；如果该待测白菜扩增得到的多态性片段与已知白菜样品扩增得到的多态性片段不符，则该待测白菜品种是与已知白菜品种不一样的白菜品种。

所述PCR扩增的反应程序为：先72℃ 3min，94℃ 2min；然后在94℃ 1min，68℃-58℃(-1℃/2cycles)，每完成扩增的两个循环，温度降低一度，1min，72℃1min15s的条件下，进行20个迫降循环；再在94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min15s条件下进行20个循环；最后于72℃ 7min，4℃中保存。

所述PCR扩增反应中，每个所述引物组合中的三对引物在一个反应体系中进行扩增反应，所述PCR扩增反应体系中，核苷酸序列分别为序列表序列1和序列表中序列2的引物对的每个引物浓度为1.5pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列3和序列表中序列4的引物对的每个引物浓度为0.8pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列5和序列表中序列6的引物对的每个引物浓度为0.45pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列7和序列表中序列8的引物对的每个引物浓度为0.5pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列9和序列表中序列10的引物对的每个引物浓度为0.9pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列11和序列表中序列12的引物对的每个引物浓度为0.8pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列13和序列表中序列14的引物对的每个引物浓度为0.75pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列15和序列表中序列16的引物对的每个引物浓度为0.5pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列17和序列表中序列18的引物对的每个引物浓度为1.0pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列19和序列表中序列20的引物对的每个引物浓度为0.65pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列21和序列表中序列22的引物对的每个引物浓度为0.8pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列23和序列表中序列24的引物对的每个引物浓度为1.3pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列25和序列表中序列26的引物对的每个引物浓度为0.6pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列27和序列表中序列28的引物对的每个引物浓度为1.25pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列29和序列表中序列30的引物对的每个引物浓度为0.9pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列31和序列表中序列32的引物对的每个引物浓度为1.0pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列33和序列表中序列34的引物对的每个引物浓度为0.65pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列35和序列表中序列36的引物对的每个引物浓度为1.1pmol.L^-1。

所述PCR扩增反应体系中含有dNTP 0.4mmol.L^-1，Mg²⁺2.75mmol.L^-1，Taq酶1.25U.μL^-1，模板DNA 20-200ng.μL^-1。Mg²⁺具体可通过加入可溶性Mg盐如MgCl₂等加入。

所述扩增产物在含有0.5mg.L^-1溴化乙锭的超高分辨率琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，凝胶质量百分浓度为3-4％，100～800bp片段大小范围内，所述超高分辨率的琼脂糖凝胶的分辨率为5bp(即可以将片段大小差别为5bp以上的片段分开)。

实验表明，本发明的试剂盒完全鉴别了43个白菜品种差异的检测，及其在3个大白菜杂交种个体之间的一致表现，以及比较了单引物标记与复合标记的鉴定效率，验证了这套技术和组合可以表达白菜品种间多态性，品种内一致性及稳定性和重复性。确认这套EST-SSR复合标记检测技术和6套引物组合，可以高效准确和全面的鉴别白菜品种的真实性和一致性。

本发明的方法一次扩增反应可以得到多个EST-SSR多态位点，扩大了SSR标记的多态信息量，祢补了其位点少的缺陷。本发明的方法在进行品种间真实性和品种内一致性鉴定时具有重复性好实验结果稳定的优势，是一套可以有效用于白菜商品种子真伪鉴定和纯度检测，资源种质分析以及新品种唯一性、一致性鉴定的多态性高、准确、快速而经济实用的品种鉴定技术。

附图说明

图1为利用11个白菜品种筛选EST-SSR多态性引物的扩增指纹图谱(P8，P14，P40，P41为4个自交系，1，15，18，23，28，37，43所示品种为表1中的编号所示的品种)

图2A为用三对EST-SSR引物组合成的复合标记在同一个扩增程序中得到的8个大白菜品种的电泳图谱，左边8个样品和右边8个样品的扩增体系中所加入的每一对引物的量是不一样的。(P8，P14，P40，P41为4个自交系，18，23，37，43所示品种为表1中的编号所示的品种)

图2B为在调整复合引物组中每一对引物所需加入的合适用量过程中的一幅DNA扩增指纹图。

图3为复合SSR引物组合1鉴定43个大白菜品种的DNA指纹图谱(样品见表1)

图4为复合SSR引物组合2鉴定43个大白菜品种的DNA指纹图谱(样品见表1)

图5A为引物组合5对改良京春绿杂交组合样品的扩增图谱(L：改良京春绿，40、41为其亲本)

图5B为引物组合1对改良京春绿杂交组合样品的扩增图谱(L：改良京春绿，40、41为其亲本)

图6A为引物组合1对32个改良京春绿杂交种个体DNA的扩增图谱，图中可见有一个单株是杂株(L：改良京春绿，41杂株)。

图6B为引物组合2对32个京绿2号杂交种个体DNA的扩增图谱，图中可见有一个单株是杂株(5：京绿2号，Z为杂株，W为不确定单株)。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、白菜品种鉴定的专用试剂盒的获得及其效果验证

一、材料和方法：

1、植物材料

试验用白菜种子由北京市农林科学院蔬菜研究中心白菜育种组和种质资源库提供，使用的品种名称如表1所示。

表1.品种名称及编号

样品号	品种名称	样品号	品种名称
				1	春油1号(Chunyou 1)	23	北京桔红心(Beijingjuhongxin)
2	紫冠1号(Ziguan 1)	24	桔红2号(Juhong 2)
				3	天津绿(Tianjinglv)	25	京夏1号(Jingxia 1)
4	京绿7号(Jinglv 7)	26	京研快菜(Jingyankuaicai)
				5	京绿2号(Jinglv 2)	27	京翠70(Jingcui 70)
6	国夏1号(Guoxia 1)	28	北京大牛心(Beijingdaniuxin)
				7	京冠1号(Jingguan 1)	29	快菜1号(Kuaicai 1)

8	黑叶2号(heiye 2)	30	夏胜(Xiasheng)
				9	京冠2号(Jingguan 2)	31	二包头(Erbaotou)
10	京绿乌蹋菜(Jinglvwutachai)	32	夏优三号(Xiayou 3)
				11	奶白1号(Naibai 1)	33	贮藏用白菜(Zhuchangbaicai)
12	斗白1号(Doubai 1)	34	大核桃纹(Dahetaowen)
				13	胶研金秋(Jiaoyanjinqiu)	35	青和1号(Qinghe 1)
14	京春娃菜2号(jingchunwacai 2)	36	春早黄心(ChunzaoHuangxin)
				15	改良京春绿(Gailiangjingchunlv)	37	河北青麻叶(Hebeiqingmaye)
16	改良京春白(Gailiangjingchunbai)	38	矮五头白菜籽(Aiwutoubaicaizi)
				17	青杂中丰(Qingzazhongfeng)	39	大青梢白菜(daqingshaobaicai)
18	黄芽菜(Huangyacai)	40	内蒙八叶齐(Neimengbayeqi)
				19	秋月(Qiuyue)	41	东京五号(Dongjing 5)
20	北京小杂60(Beijingxiaoza 60)	42	怡兴黄蕊白菜(Yixinghuangruibaicai)
				21	京秋65(Jingqiu 65)	43	早熟5号(Zhaoshu 5)
22	京翠1号(Jingcui 1)

2、DNA模板的制备

提取方法按照Dorokhov和Klocke提取DNA的方法(Dorokhov D B，Klocke E.1997.A rapid and economic technique for RAPD analysis of plant genomes.Russ J Genet，33：443-450)提取，具体为：取生长了30-40天的单株幼苗的幼嫩真叶50-60mg放入1.5ml离心管，加400μl SDS-DNA提取液(Tris-HCl PH 7.5，200mmol/L；NaCl250mmol/L；EDTA 2.5mmol/L；SDS 0.5％(质量含量))。玻棒研磨后混匀置65℃水浴15min，中间振摇混匀3次，加5mol/L KAc 200μl，混匀后置冰浴10min，13,000r/min离心30min，取上清液用等体积预冷(-20℃)的异丙醇沉淀DNA，沉淀物用70％(体积百分含量)乙醇溶液洗涤2～3次后溶于60～80μl消毒双蒸水中过夜。其OD₂₆₀/OD₂₃₀比值在1.9～2.0左右，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8～2.0之间，用1.0％Agrose凝胶电泳检测提取的DNA为一条清晰的带，表明提取的DNA分子没有断裂和降解，是一条完整的双链分子，纯度符合PCR扩增的要求。

3、EST-SSR引物设计、筛选和复合标记的形成

利用澳大利亚植物生物技术中心在网上公布的SSR引物设计软件(PBC PublicSSR Primer Discovery)对美国国家生物技术信息中心(NCBI)发布的十字花科芸苔属EST信息库进行搜索，形成242对SSR引物序列。

以大白菜不同变种和生态型的四个自交系和六个地方品种(P8，P14为新三号的自交系，P40，P41为改良京春绿的自交系；1，15，18，23，37，43见表1中相应编号所示的品种)从EST-SSR引物群筛选出120个多态引物。

其中图1为部分筛选过程中的DNA指纹图谱。图1是三对引物对10个白菜样品扩增后经高分辨率琼脂糖电泳得到的图谱，从左向右，第三对引物为筛选出的引物，能看出此对引物对每一个样品都扩出了清晰的带型，而且片段的分子量大小是不一样的，由此可以明显地看出，此对引物对样品扩增的带型好、品种间差异明显、多态性丰富；而第一对引物对样品也都扩出了清晰的带型，但品种间的带型差异不明显；第二对引物只扩增出了四个样品的带型，其它六个样品没有扩增产物，所以图1中第一对和第二对引物为淘汰的引物。图右侧的数字为片段的分子量大小，图顶端是样品品种的编号。

在筛选的120对引物群中，经过大量实验筛选，最后确定了其中18对扩增带型好、品种间带型差异明显、多态性丰富的引物形成6个复合引物组，6个复合引物组合如表2所示。每个引物组合选择了具有可相容的基因片段大小，在同一个反应条件和扩增程序上扩增，选用Touchdown程序，温度从68℃至58℃逐级降低，每完成扩增的两个循环，温度降低一度，这个过程促使经扩增得到的大小不等的产物片段可以在模板相对应的区域适当配对，得到了复合SSR PCR扩增反应的适宜条件。

表2.6组复合标记所用引物组合的碱基序列及其引物用量

所有正向引物和反向引物的用量是一样的均为20μl扩增体系中的用量，所用引物的浓度均为10pmol.L^-1，表中所列为吸取引物的体积。

每一对引物的用量在复合引物的扩增中也是至关重要的，扩增反应中所用的每一组复合引物的量都是不一样的(见表2)，其它试剂的用量相对于单引物扩增体系的用量也有相应的增加。经过大量的筛选和多次重复性的验证，最终确定了将三对引物组合在一起的适宜条件，成功获得到六组鉴定白菜品种的复合EST-SSR多态性组合。实验在20μL的体系中所加入的试剂量如下所述，每一对的引物用量是不一样的，见表2每个组合中一对引物的取量，所用PCR扩增的反应程序为：先72℃ 3min，94℃ 2min；然后在94℃ 1min，68℃-58℃(-1℃/2cycles)，每完成扩增的两个循环，温度降低一度，1min，72℃ 1min15s的条件下，进行20个迫降循环；再在94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min15s条件下进行20个循环；后于72℃ 7min，4℃中保存。见图3和图4，在此条件下，引物组合I和组合II中的三对引物对每个样品都扩出了清晰的带型，而且，每一对引物所扩增出的带型差异明显，三对引物扩增出的所有的片段在不同的区域，相互之间具有可相容性。相反，如果不调整引物的用量如表2中所示的引物组合I和引物组合II中各对引物所加入的量，将每个引物分别加入同等的用量，那么必定其中有引物对应扩出的带是缺失的。

图2A是三对EST-SSR引物组合成的复合标记在同一个扩增程序中得到的8个白菜品种的电泳图谱，M为标准分子量对照，从左至右，左侧8个样品和右侧8个样品是一样的，这两组样品的扩增体系中，所有的试剂用量都是一样的，只有三对引物的加入量是不一样的，右侧样品的扩增体系中，每一对引物的用量都较左侧样品扩增体系中少了0.15pmol.L^-1，图中可见从上至下，第一对和第二对引物都出现了样品缺带的情况，特别是第二对引物(196bp区域扩增出的片段)有4个样品(P14，P40，P41，43)都没有得到清晰的片段，由此，左侧样品的扩增体系中加入的引物量是最佳引物量。图2B是在调整复合引物组中每一对引物所需加入的合适用量过程中的一幅DNA扩增指纹图。图中数字为引物的原始编号，括号中是此对引物扩增所得到的片段的大小。从图中可见每一对组合中都有一对引物没有扩增出应有的片段，所以需要增加缺失带的引物在扩增体系中的用量。这两幅DNA指纹图中所用引物不全是本研究中最后得到的这18个引物对，这是两幅复合引物组形成实验过程中的DNA指纹图，所示复合标记形成的实验过程。

上述筛选实验过程中获得的PCR反应条件如下所述：

PCR反应体系为：总反应体积为20μL，其中体系中加入10mmol.L^-1dNTP 0.8μL，PCR反应缓冲液(含15mmol.L^-1Mg²⁺)2μL，25mmol.L^-1MgCl₂溶液0.4μL(扩增体系中Mg²⁺的终浓度为2.75mmol.L^-1)，5U.μL^-1Taq 10酶0.25μL(购自北京泽星生物科技有限公司)，模板DNA 20-200ng.μL^-12μL，每个引物组合在同一个PCR扩增体系中，引物取量见列表2。筛选的6组引物组合均采用Touchdown PCR反应程序，反应程序为：72℃ 3min，94℃ 2min后进行20个迫降循环：94℃ 1min，68℃-58℃(-1℃/2cycles)(68℃至58℃逐级降低，每完成扩增的两个循环，温度降低一度)1min，72℃ 1min15s；再进行20个循环：94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min15s，于72℃ 7min后于4℃保存。PCR扩增产物于-20℃冰箱保存。扩增产物在含有0.5mg.L^-1溴化乙锭的超高分辨率琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，凝胶质量百分浓度为3％。使用Alpha Innotech公司Multimage^TM凝胶成像仪进行凝胶扫描成像。100～800bp片段大小范围内超高分辨率的琼脂糖凝胶的分辨率可以达到5bp(即可以将片段大小差别为5bp以上的片段分开)，扩增所得到的片段大小相差5bp，经过以大小恒定5V/cm的电压电泳后，就可以在带型上清晰地分辨出来，它的分辨率接近经4％聚炳稀酰胺胶电泳后银染所得到的带型的分辨率，但操作方法和过程上却较后者简单、方便、快捷得多。聚炳稀酰胺胶电泳后经银染显现带型的方法，在成胶和染色过程分别都要经过多个操作步骤，而且对水质要求严格，如果水的质量达不到要求，就得不到清晰的带型。而超高分辨率的琼脂糖凝胶一次成胶，染料已在胶中，电泳完成后可以直接在紫外光下扫描观察DNA指纹图谱的带型；而普通琼脂糖凝胶在片段小于250bp的情况下不能清晰地显现条带。

4、复合EST-SSR引物组合鉴定白菜品种的多态性分析

为了确定多重EST-SSR标记组合在白菜品种鉴定中应用的效果，选择了有代表性的43个白菜品种，对上述试验得到的6组多重EST-SSR标记组合的多态性引物及应用于实际检测的可行性进行了确定性实验验证。PCR反应条件如步骤3所示。

结果表明，平均每个引物组合产生近24条带，有效多态性带17条(24条带是一组复合引物对43个白菜品种扩增所得到的所有不同大小的片段数的总和，24条带就是得到的24个大小不同的片段。在这24条带中，其中有的条带是每个样品都有，如图5A为复合引物组合V对改良京春绿杂交组合扩增的指纹图谱，其中大小为800bp，450bp，150bp三条带对改良京春绿杂交种(L)和父(40)母(41)本来说是它们共有的带，从这3条带来看，我们分辨不出它们之间的差异，所以这3条带在这里是无效无多态的；而大小为200bp，220bp的2条带对这三个样品就不一样，改良京春绿杂交种具有200bp和220bp两条带，而父本具有220bp一条带，母本具有200bp一条带，根据这个带型，能清楚地区别出改良京春绿杂交种和它的父本、母本；在这里，这2条带就是有效多态性条带)。六套引物组合共产生131条带，有效多态性带100条。每套复合引物组合产生的有效多态性带的比例为69.0～84.6％，平均为77.0％，具体结果如表3所示。

其中，图3和图4是用表2所示多重EST-SSR引物组合I和引物组合II分析43个大白菜品种的鉴定结果图谱，有效扩增的带的区域为100～700bp范围内，扩增带清晰、稳定，具多态的带的大小范围均属这一区域(图1，图2)。在图3和图4中，例如样品2、3、4在引物组合I对其扩增的图谱(见图3)中，样品2和样品3的带型无差异，但在引物组合II对其扩增的图谱(见图4)中，样品2和样品3的差异明显，对照标准分子量，200bp和500bp区域，两个样品的扩增片段的大小都是不一样的，所以，根据引物组合II对样品2和3的扩增图谱可将两个品种鉴别开来；样品3和4在两个组合扩增的图谱中，带型都有明显的差异，极易区分；样品2和4在引物组合II对其扩增的图谱(见图4)中带型无差异，但在引物组合I对其扩增的图谱(见图3)中，样品2和样品4的差异明显，对照标准分子量，250bp和500bp区域，两个样品的扩增片段的大小都是不一样的，所以，根据引物组合I对样品2和4的扩增图谱可将两个品种鉴别开来。正如多重EST-SSR引物组合鉴定白菜品种的多态性分析(见表2)的结果所述，结合这六组复合标记的多态位点，对鉴定白菜品种提供了充足的有差异的带型组合。

表3多重EST-SSR引物组合鉴定白菜品种的多态性分析

多重引物组合	总条带数	多态性条带数	多态率(％)	多态信息量(％)
					引物组合I	26	-22	84.6	47.6
引物组合II	24	18	75.0	38.2
					引物组合III	9	7	77.8	58.7
引物组合IV	16	13	81.3	67.0
					引物组合V	27	20	74.1	74.0
引物组合VI	29	20	69.0	76.8
					合计	131	100	76.3	60.4

5、复合EST-SSR标记品种间真实性及品种内一致性检测

为了验证得到的6组复合EST-SSR标记组合应用于实际白菜种子质量检测的可行性，采用3个不同纯度水平的白菜品种的各50个单株和3个白菜杂交组合，鉴定了所形成的6组复合EST-SSR标记在品种内各单株之间表现的一致性，以及杂交种与其亲本之间的可鉴别用多态性。

采用已知杂交种纯度为96％的改良京春绿F1代杂交种用6组多重EST-SSR标记组合的多态性引物分析了50个单株。具体方法按照步骤1、2、3所述PCR方法进行。

结果表明，在品种遗传特性一致的样品中各个个体之间复合SSR带型表现一致，如果样品搀杂其它种子或其亲本则SSR带型表现出差异见图6(1)和图6(2)。复合SSR分析结果与此品种的已知纯度鉴定结果基本符合。由此证明了EST-SSR复合组合体系在白菜品种鉴定和纯度分析中的实用性。图5A是引物组合V对改良京春绿杂交组合的扩增图，改良京春绿杂交种在200bp和220bp大小的位置有多态的位点，亲本各只有一个200bp或220bp的片段，杂交种具有双亲的带型的两条带。图5B是引物组合I对改良京春绿杂交组合的扩增图，改良京春绿杂交种和亲本在500bp和240bp，250bp大小的位置有多态的位点，亲本各只有一个240bp一条带或500bp和220bp两条带，杂交种具有双亲的带型的三条带。图6A是引物组合I对改良京春绿杂交种32个单株的扩增指纹图，从图中带型可以分辨出这32个单株个体中31个个体都是改良京春绿杂交种，只有一个个体是杂株，不是改良京春绿杂交种，所以这份改良京春绿杂交种样品基本上是一致的。图6B是引物组合V对京绿2号杂交种32个单株的扩增指纹图，从图中带型可以分辨出这32个单株个体中29个个体都是京绿2号杂交种，只有一个个体是杂株(Z)，不是改良京春绿杂交种，还有两个单株需重新扩增以得到其清晰的带型。

二.讨论

1、多重EST-SSR标记扩增条件的优化

多重EST-SSR标记的形成是一个复杂的过程，要求单引物扩增所形成的片段要处在不同片段大小的区域，这样形成的多重标记才不会重叠。所以，本研究选择了逐步降低(Touchdown)的退火温度，为保证大小不同的引物都可以与模板配合选择到一个合适的退火温度形成DNA双链。从68℃逐步降到58℃用了20个循环，每一个循环降低半度，这样，多重标记中的每对单引物都可以在此扩增程序中得到特异的扩增片段，将不同大小的引物需要不同退火温度的程序统一在了此Touchdown的程序中。每一对单引物在扩增反应中的终浓度是不同的，取决于能得到清晰扩增片段为准。在单引物扩增反应体系的终浓度的基础上予以增加或减少。镁离子、四种脱氧核甘酸和DNA合成聚合酶的终浓度都比单引物扩增反应有所增加，但也不是越高就可以保证可以得到清晰的图谱。每一种试剂过量了，不但增加成本造成浪费，还会形成大量非特异型片段。本研究在对引物浓度、镁离子、四种脱氧核甘酸、DNA合成聚合酶的终浓度和扩增程序等参数进行了大量的实验测试及优化后，建立了六套标准的EST-SSR复合标记扩增体系。

2、EST-SSR复合引物标记的优势

本研究EST-SSR标记是利用澳大利亚植物生物技术中心在网上公布的SSR引物设计软件(PBC Public SSR Primer Discovery)对美国国家生物技术信息中心(NCBI)发布的十字花科芸苔属EST信息库进行搜索，就得到了SSR引物序列，这无疑是得到SSR标记的经济捷径。而EST-SSR复合标记增加了多态信息量，可与AFLP和SRAP标记的信息量相比美，但比SRAP稳定，比AFLP的可操作性强，简单省时。所以EST-SSR多重标记堪称一种经济、稳定、高效实用的分子标记方法，为应用于品种鉴定提供了广阔的前景。

3、单引物标记和多重引物标记鉴定品种之效率的比较

多重标记的多态位点是组成多重引物的单引物多态位点之和，所以多重引物标记增大了多态信息量。每一组多重标记中的单引物标记所能鉴定的品种数是其多态位点的组合数，而多重标记的多态是单引物多态位点之和，而它所能鉴定的品种数是其单引物多态位点之和的组合数。对于复合标记来说，多态位点增加了，所能检测的品种数不是单引物标记所能检测品种数之和，而是单引物多态位点之和的组合数。如复合标记3由3对单引物标记组成，每一对单引物标记的多态位点为两个，如果只用一对引物来鉴定，只能将三个品种区别开来。但由此三对引物组合的复合标记就有六个多态位点，多态位点为六的组合数是82，所以其复合标记能将82个品种鉴别开来。明显的复合标记极大得提高了EST-SSR标记的鉴定品种的效率。

序列表

<160>36

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gtgatagcag tggtggaagt    20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gataatatca gccgacgaag    20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gatctcatcg acccgtacta    20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

cagagatact gcagaggagg    20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

ttccgtccct tccctaaaca    20

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gaacactact gcccagagaa cac    23

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

gttgactgtg gatgatgtga        20

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

tttcctcctc ggtctcgt          18

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

gagtttcgag gagtttcaga      20

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

cttcaaagta gagagaagcc c    21

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

cttcttacga tggattgagc      20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

cctctttcaa gaacttagcg    20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

agagagatcg agatccacaa    20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

ggcgagaaag ttagttgcta    20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

gactctgtca tcatcgtcct     20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

acacgacaga acacaagtga          20

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>17

cagatctcat cttcttctct tctgg    25

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>18

gaaaggagcc agatcttctt          20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>19

gcttgacgat ctgtaaccat    20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>20

gagagctgct cattcatttc    20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>21

caagtctcct tcaaatctcg    20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>22

agtctccgct ctcttcttct    20

<210>23

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>23

gaagaagtgg cgcttcaa      18

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>24

cttagcagag agcaaccatc    20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>25

cggaagattg agaaacacag    20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>26

gactttcagc tgtagggttg    20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>27

cccactcaac acacactaga    20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>28

ctcctttcag agtgaccaag    20

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>29

aacagctttc tctctcatgg    20

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>30

ttgagcatta cacagagacg    20

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>31

acatgacaca ctctctgcaa    20

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>32

gaggagagca gagctaacag    20

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>33

aactggtaga gcagaaacca    20

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>34

atcaggagaa acgtgtgtgt    20

<210>35

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>35

gatcacaact caaccagc      18

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>36

ctgtgttctt ctttggcttc    20

Claims (6)

1、一种白菜品种鉴定的试剂盒，包括下述引物组合：

1)引物组合I：由核苷酸序列分别为序列表序列1和序列表中序列2的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列3和序列表中序列4的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列5和序列表中序列6的引物对组成；

2)引物组合II：由核苷酸序列分别为序列表序列7和序列表中序列8的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列9和序列表中序列10的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列11和序列表中序列12的引物对组成；

3)引物组合III：由核苷酸序列分别为序列表序列13和序列表中序列14的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列15和序列表中序列16的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列17和序列表中序列18的引物对组成；

4)引物组合IV：核苷酸序列分别为序列表序列19和序列表中序列20的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列21和序列表中序列22的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列23和序列表中序列24的引物对组成；

5)引物组合V：由核苷酸序列分别为序列表序列25和序列表中序列26的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列27和序列表中序列28的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列29和序列表中序列30的引物对；和

6)引物组合VI：由核苷酸序列分别为序列表序列31和序列表中序列32的引物对、核苷酸序列分别为序列表序列33和序列表中序列34的引物对和核苷酸序列分别为序列表序列35和序列表中序列36的引物对组成。

2、一种白菜品种鉴定的方法，是以待测白菜的DNA为模板，以权利要求1所述的试剂盒的引物组合I-VI分别进行PCR扩增，检测多态性片段大小，跟已知白菜品种用该引物组合进行PCR扩增得到的多态性片段大小相对比，若他们扩增得到的片段大小均一致，则该待测白菜的品种与已知白菜品种是同一个品种；如果该待测白菜样品扩增得到的多态性片段与已知白菜品种扩增得到的多态性片段不一致，则该待测品种白菜不是该已知白菜品种。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：先72℃3min，94℃2min；然后在94℃1min，68℃-58℃(-1℃/2cycles)，每完成扩增的两个循环，温度降低一度，1min，72℃1min15s的条件下，进行20个迫降循环；再在94℃1min，58℃1min，72℃1min15s条件下进行20个循环；最后于72℃7min，4℃保存。

4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应中，每个所述引物组合中的三对引物在一个反应体系中反应，所述PCR扩增反应体系中，核苷酸序列分别为序列表序列1和序列表中序列2的引物对的每个引物浓度为1.5pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列3和序列表中序列4的引物对的每个引物浓度为0.8pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列5和序列表中序列6的引物对的每个引物浓度为0.45pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列7和序列表中序列8的引物对的每个引物浓度为0.5pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列9和序列表中序列10的引物对的每个引物浓度为0.9pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列11和序列表中序列12的引物对的每个引物浓度为0.8pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列13和序列表中序列14的引物对的每个引物浓度为0.75pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列15和序列表中序列16的引物对的每个引物浓度为0.5pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列17和序列表中序列18的引物对的每个引物浓度为1.0pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列19和序列表中序列20的引物对的每个引物浓度为0.65pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列21和序列表中序列22的引物对的每个引物浓度为0.8pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列23和序列表中序列24的引物对的每个引物浓度为1.3pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列25和序列表中序列26的引物对的每个引物浓度为0.6pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列27和序列表中序列28的引物对的每个引物浓度为1.25pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列29和序列表中序列30的引物对的每个引物浓度为0.9pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列31和序列表中序列32的引物对的每个引物浓度为1.0pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列33和序列表中序列34的引物对的每个引物浓度为0.65pmol.L^-1，核苷酸序列分别为序列表序列35和序列表中序列36的引物对的每个引物浓度为1.1pmol.L^-1。

5、根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应体系中含有dNTP 0.4mmol.L^-1，Mg2⁺².75mmol.L^-1，Taq酶1.25U.μL^-1，模板DNA 20-200ng.μL^-1。

6、根据权利要求2-5中任意一项所述的方法，其特征在于：所述扩增产物在含有0.5mg.L^-1溴化乙锭的超高分辨率琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，凝胶质量百分浓度为3-4％，100～800bp片段大小范围内，所述超高分辨率的琼脂糖凝胶的分辨率可以将片段大小差别为5bp以上的片段分开。

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