CN102952851B - 用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1-5所示。本发明还涉及用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD检测试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的引物。本发明还涉及用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD方法，所述方法包括使用本发明所述的引物或试剂盒。本发明还涉及本发明所述的引物或试剂盒在检测啤酒大麦品种和/或纯度中的应用。使用本发明的RAPD方法，能够快速进行啤酒大麦品种和/或纯度的检测，且操作简便，结果可靠。

Description

用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物、用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的试剂盒、使用所述引物或试剂盒检测啤酒大麦品种和/或纯度的方法，以及所述引物或试剂盒在检测啤酒大麦品种和/或纯度中的应用。 

背景技术

大麦是仅次于水稻、小麦、玉米等粮食作物的第四大主产作物，根据其用途可分为啤酒大麦、饲用大麦、食用大麦三种类型。其中啤酒大麦是啤酒酿造的主要来源。目前我国啤酒大麦种植面积约1000万亩，年产约150-200万吨，优质啤酒大麦产量远远达不到市场需求，据统计1998-2007年我国从澳大利亚、加拿大、法国共计进口1834.1万吨啤酒大麦，年均进口量183万吨。近年来，由于啤酒工业的迅猛发展，对啤酒大麦的需求不断增大，同时对其品质要求也随之提高。啤酒大麦种质的优劣将直接影响麦芽和啤酒品质。因各地风土气候和耕种习惯等原因，世界各地不同品系、不同产地的啤酒大麦各不相同，酿造出的啤酒质量也大相径庭。 

啤酒大麦品种和/或纯度是评判啤酒大麦质量的重要指标，准确鉴别啤酒大麦品种和/或纯度是啤酒大麦原料质量控制的重要措施。目前，由于生产、经营、管理不规范，不合格种子甚至假种频繁混入市场，对啤酒工业造成了一定损失，并损害了品种权拥有者的利益和广大农民的经济利益，破坏了良好的市场秩序。因此，建立一套完善的种质鉴定体系尤为重要。目前，传统的鉴定手段多采用形态标记方法，如穗长、粒色、干粒重等，但该法易受环境及杂交过程个体变化影响，鉴定结果不可靠。 

在啤酒大麦种质鉴定方面寻求可靠的分子生物学技术成为一种趋势。 RAPD(随机扩增多态DNA)技术作为一种DNA分子指纹技术，是利用合成的随机引物基于整个基因组序列进行随机PCR扩增，不同的基因组由于序列的差异导致PCR产物长度多态性，通过电泳检测到的多态性特征对不同基因组进行区分，十分容易发现不同样品之间的序列差异。因此，RAPD在物种鉴定中的优势非常突出，不仅操作相对简便，容易标准化，而且是从基因水平进行分析，不受外界条件的影响，分辨率高，可有效区分近缘品种。目前，国内外对于检测啤酒大麦的品种和/或纯度的RAPD方法研究较少，而且技术尚不够成熟，尤其是对于啤酒大麦的纯度检测尚无直接根据扩增条带进行半定量的先例。另外，传统的啤酒大麦RAPD检测技术是通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行PCR产物的检测，例如“侯永翠等，利用RAPD标记分析大麦种质资源的遗传多样性，《植物遗传资源学报》2005，6(2)：145～150”和“张大乐等，中国啤酒大麦品种RAPD标记的遗传多样性分析，《武汉植物学研究》2005，23(4)：305～309”中所揭示的，通过肉眼观察分子量标准对应位置来判断标记条带的有无，容易受到电泳条件变化或操作误差造成的条带位置偏差的干扰，加上随机扩增自身的非特异性，得到的图谱往往在重现性上存在问题。另外，目前针对啤酒大麦之类的谷物纯度的基因鉴别方法主要采用单粒法，操作繁琐，需要投入大量人力物力。 

因此，本领域需要一种快速、简便以及可靠的啤酒大麦品种和/或纯度的检测方法。 

发明内容

一方面，本发明提供了用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1-5所示。 

本发明所述引物的核苷酸序列分别为： 

SEQ ID No.1(Opp14)：5’CCAGCCGAAC3’； 

SEQ ID No.2(BA8)：5’GTCCACACGG3’； 

SEQ ID No.3(BA10)：5’CTGCTGGGAC3’； 

SEQ ID No.4(BA152)：5’TTATCGCCCC3’；以及 

SEQ ID No.5(BA187)：5’TCCGATGCTG3’。 

另一方面，本发明提供了用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的引物。 

根据一种优选的实施方式，本发明的所述试剂盒还包含使用说明书，所述使用说明书中记载的随机PCR扩增反应条件是：94℃，10min；94℃1min，37℃1min，72℃2min，45个循环；72℃5min。 

根据一种优选的实施方式，本发明的所述试剂盒还包含用于提取样品DNA的试剂和用于随机PCR扩增反应的试剂。 

根据一种进一步优选的实施方式，所述试剂盒还包含标准品和阴性对照，所述标准品为啤酒大麦目标品系的DNA序列，所述阴性对照为无菌双蒸水。 

再一方面，本发明提供了用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD方法，所述方法包括使用本发明所述的引物或试剂盒。 

根据一种实施方式，本发明用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD方法包括如下步骤； 

(1)提取啤酒大麦DNA模板； 

(2)分别使用本发明所述的引物对于所述步骤(1)获得的啤酒大麦DNA模板进行随机PCR扩增； 

(3)对所述步骤(2)随机PCR扩增获得的产物进行毛细管芯片电泳；(4)根据所述步骤(3)获得的标志带图谱鉴定啤酒大麦的品种；和/或 

(5)对于所述步骤(3)获得的标志带图谱绘制标准曲线，建立啤酒大麦纯度检测半定量模型，以判定啤酒大麦目标品种的纯度。 

根据一种优选实施方式，其中，上述步骤(2)的随机PCR扩增的条件被设定为：94℃，10min；94℃1min，37℃1min，72℃2min，45个循环；72℃5min。 

根据一种优选实施方式，本发明用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD方法能够鉴定选自下述的啤酒大麦品种：甘啤3号、甘啤4号、恳啤2号、恳啤3号、Harningtan、Copeland、Metcalfe、Baudlin、Hamelin、Legacy、 Kendall、Stirling、Gairdner、Estevel、Cervoise、Flagship、Arturio、Vlamingh以及Newdale。 

根据一种优选实施方式，其中，上述步骤(3)中毛细管芯片电泳采用50-1000bp分子量标准品。 

又一方面，本发明提供了本发明所述的引物或试剂盒在检测啤酒大麦品种和/或纯度中的应用。 

本发明RAPD技术通过使用本发明人筛选的5条随机寡核苷酸引物并利用毛细管芯片电泳对PCR产物高分辨、高灵敏度、稳定以及准确量化(分子量、相对量以及浓度)的优点，对初选得到的随机扩增标志带的重现性进行严格筛查，最终得到7条有意义的标志带。结果证明，利用本发明建立的RAPD检测方法可以有效地进行啤酒大麦品种的鉴定，同时还通过标准曲线方法建立啤酒大麦纯度快速检测半定量模型，从而可对啤酒大麦样品纯度进行准确的半定量检测。该半定量方法直接对混合样品进行检测，无需对大量的单粒种子分别进行鉴别，可以迅速判断样品的纯度范围，使得操作更为简便。 

本发明的RAPD技术快速、简便且可靠，具有良好的应用推广前景。 

附图说明

图1显示不同扩增酶反应体系对7个标志带的灵敏度影响情况。这里使用的扩增酶反应体系包括Hotstar、Takara、Invitrogen。灵敏度表示为模板的10倍倍比系列稀释倍数，倍数越高，说明灵敏度越高。横坐标为标志带，纵坐标为稀释倍数。 

图2是19号和1号组合(图2A)、14号和3号组合(图2B)、11号和8号组合(图2C)的啤酒大麦不同比例混合物(基于1号、14号以及8号的含量分别为90％、70％、50％、30％、10％、5％)的实验结果。箭头指示标志带，标志带的有或无可以对啤酒大麦品系进行鉴别，标志带浓度或相对量可以作为未知样品纯度半定量检测的参照。各电泳图的横坐标为电泳泳道，其对应的啤酒大麦种子重量比(基于1号、14号以及8号)分别为：左列各小图中的泳道1-4为90％，泳道5-8为70％，泳道9-12为50％；右列各小图中的泳道1-4为30％，泳道5-8为10％，泳道9-12为5％。纵坐标为分子量marker。 

图3是19号和1号组合(图3A)、14号和3号组合(图3B)、11号和8号组合(图3C)的啤酒大麦不同比例混合物(基于1号、14号以及8号的含量分别为90％、70％、50％、30％、10％、5％)的标志带相对量标准曲线。横坐标为标志带相对量，纵坐标为纯度。 

图4是5个不同浓度水平的19号和1号混合样品的半定量电泳结果。根据样品标志带与标准样品标志带着色的比较，可以对混合样品的纯度范围(基于1号的含量来计)进行判断。图片左上角为混合样品真实纯度；箭头指示标志带；横坐标为电泳泳道，纵坐标为分子量marker；上方的90-5表示标准样品浓度；椭圆标识混合样品。 

具体实施方式

本发明所使用的5条寡核苷酸引物是从随机引物库中针对19个品种的啤酒大麦(包含主要进口啤酒大麦品种)基因组筛选得到的，能够鉴定13组啤酒大麦品种(甘啤3，甘啤4，恳啤2，Harningtan/Kendall，Copeland/Metcalfe/Newdale，Baudlin/Stirling，Hamelin，Legacy，Gairdner，Estevel/Arturio，Cervoise，Flagship/Vlamingh，恳啤3)。通过采用RAPD技术对引物扩增特异性、标志带重现性、灵敏度、稳定性、纯度检测等进行了研究。 

在本发明的RAPD技术中，本发明采用毛细管芯片电泳对啤酒大麦样品进行混合样品检测，建立了啤酒大麦纯度检测方法。同时，由于得到的特异性标志带的相对量或浓度与啤酒大麦纯度呈现良好线性关系，还通过标准曲线方法建立啤酒大麦纯度快速检测半定量模型，从而可对啤酒大麦样品进行纯度半定量检测。 

下面通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。 

仪器与试剂

所使用的主要检测仪器如下： 

微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf，德国)、PCR仪(Eppendorf，德国)、高速台式离心机(Pico17Thermo，德国)、高速粉碎机(IKA-WEARKE，德国)、毛细管芯片电泳仪(2100，美国Angilent)。 

所使用的检测主要试剂如下： 

氯仿、异丙醇，分别购于北京六合通公司；DNA提取试剂盒，购自Nucleospin，MN；Taqman聚合酶试剂中Hotstar购自德国Qiagen、Takara购自日本Takara、Invitrogen购自美国Invitrogen；引物，由北京英俊生物科技有限公司合成；用于毛细管芯片电泳的DNA 1000LabChip试剂盒购自美国Agilent公司。 

实施例1 

本实施例通过如下试验对啤酒大麦品种和/或纯度检测引物的特异性、重现性、特征参数和灵敏度进行验证。 

1、DNA模板提取 

(1)对19个啤酒大麦检测样品(包括甘啤3号、甘啤4号、恳啤2号、Harningtan、Copeland、Metcalfe、Baudlin、Hamelin、Legacy、Kendall、Stirling、Gairdner、Estevel、Cervoise、Flagship、Arturio、Vlamingh、恳啤3号、Newdale)进行DNA模板提取。具体地，分别称取每一样品的50g啤酒大麦种子，用研磨机磨成粉末，称取100mg，使用DNA提取试剂盒提取DNA模板，用100μL双蒸无菌水溶解，作为原液储存于4℃备用。 

(2)将上述提取的啤酒大麦DNA模板原液用无菌水分别稀释10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍，用于分析不同聚合酶体系的扩增灵敏度。 

(3)分别将1号(甘啤3号)和19号(Newdale)组合、14号(Cervoise)和3号(恳啤2号)组合、11号(Stirling)和8号(Hamelin)组合的啤酒大麦样品按重量比90％、70％、50％、30％、10％、5％混合，分别称取50g混合后的啤酒大麦种子，用研磨机磨成粉末，称取100mg，使用DNA提取试剂盒提取DNA，用100μL双蒸无菌水溶解，4℃储存，用于进行啤酒大麦纯度检测定量模型的检测。

2、随机扩增所用引物 

所使用的寡核苷酸引物序列示于SEQ ID No.1-5。 

3、随机扩增反应体系 

使用SEQ ID No.1-5的5条随机引物分别对19个啤酒大麦检测样品进行扩增。反应体系为：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTP(各2.5mmol/L)2μL，TaqDNA聚合酶1U，DNA模板5μL，引物(10μmol/l)1.3μL，水14μL。 

4、随机扩增反应参数 

94℃，10min；94℃1min，37℃1min，72℃，2min，45个循环；72℃5min。 

5、毛细管芯片电泳 

根据制造商的使用说明书进行操作，具体地，将DNA1000LabChip试剂盒中DNA Dye Concentrate及DNA Gel Matrix试剂室温放置30min，涡旋振荡DNA Dye Concentrate试剂，取25μL DNA Dye Concentrate至DNAGel Matrix试剂中，混匀充分后，用离心过滤器过滤，1500g离心10min。将凝胶-染料混合物注入分离芯片中，将5μL marker加入各个样品孔中。取PCR扩增产物各1μL分别加入12个样品孔中，将1μL ladder加入指定的ladder孔中，最后将芯片涡旋混匀后放入Agilent2100毛细管芯片电泳仪中进行检测。 

实验结果分别示于表1-2和图1-3。 

表1显示使用SEQ ID No.1-5的5条随机引物扩增的7个标志带对19个啤酒大麦品种的区分结果。P表示标志带阳性，N表示标志带阴性。通过这些标志带的有或无，可以鉴定啤酒大麦的品系。“特异性”一列中“*”号表示该啤酒大麦品种可以和其他品种区分，数字表示和该品种成为一个组，与其他品种区分。如表1所示，19个啤酒大麦品种通过5条随机引物扩增的7个标志带可以区分成13组(甘啤3，甘啤4，恳啤2，Harningtan/Kendall，Copeland/Metcalfe/Newdale，Baudlin/Stirling，Hamelin，Legacy，Gairdner， Estevel/Arturio，Cervoise，Flagship/Vlamingh，恳啤3)。每组品系具有特异的标志带图谱(分子指纹)。括号中的百分率表示11次独立实验出现的阳性率，同时体现该标志带的重现性，对品系判别最关键的标志带均为100％的阳性或0％的阴性，说明所选择的标志带具有很好的重现性。 

表2显示5条随机引物扩增的7个标志带的分子量范围和相对分子量限值，其中包括11次独立实验中每个标志带分子量的平均值、标准偏差、相对标准偏差、上下限，和标志带相对分子量的平均值、标准偏差、相对标准偏差、下限。根据标志带的这些分子量和相对分子量下限，可以对标志带的身份和有无进行判别。例如，对于OPP14的扩增产物，只有通过毛细管芯片电泳结果显示分子量介于690bp和789bp之间和相对分子量大于3的条带才是OPP14-A。通过对11次独立实验数据的统计分析，设置7条标志带的分子量上下限和相对分子量下限，能够准确对标志带身份和结果进行判别，避免了传统凝胶电泳因主要依靠肉眼鉴别条带导致错判和漏判，大大提高RAPD技术的可靠性和科学性。 

如图1所示，不同扩增酶体系对7个标志带的扩增灵敏度有差异，其中Hotstar体系灵敏度高于Invitrogen和Takara(例如，针对BA10-A，Hotstar稀释倍数达到10³，Invitrogen为10²，Takara为10¹)。说明不同的扩增酶体系均适合该方法，但根据扩增效率的不同，建议使用Hotstar或其他相当的扩增体系。 

如图2所示，19号和1号组合(图2A)、14号和3号组合(图2B)、11号和8号组合(图2C)的啤酒大麦90％、70％、50％、30％、10％、5％(分别基于1号、14号以及8号的含量)混合物的标志带(箭头所示)着色随着对应品系(分别为1号、14号以及8号)的比例的增加逐步加深(19+1，11+8)或变浅(14+3)。每个样品重复4次。其中，图2A中，19+1组合电泳条带的着色深度随着1号啤酒大麦的相对浓度递增而加深。图2B中，14+3组合电泳条带的着色深度随着14号啤酒大麦的相对浓度递增而变浅。图2C中，11+8组合电泳条带的着色深度随着8号啤酒大麦的相对浓度递增而加深。 

如图3所示，19号和1号组合(图3A)、14号和3号组合(图3B)、11号和8号组合(图3C)的啤酒大麦90％、70％、50％、30％、10％、5％(分别基于1号、14号以及8号的含量)混合物的标志带相对量或浓度与混合比例呈现良好的线性关系，R²值分别为0.9617、0.9737、0.9671。因此，通过不同比例的啤酒大麦混合物样品的标准曲线可以对待测样品的目标品系的纯度进行判定。 

实施例2 

本发明的发明人通过如下试验对不同纯度水平的啤酒大麦样品进行了验证性检测。 

将1号样品和19号按重量混合成纯度(基于1号的含量)分别为1％、4％、13％、20％、52％以及80％。 

在本实施例中，所使用的寡核苷酸引物为SEQ ID No.1(OPP14)。 

在本实施例中，进行RAPD的实验操作条件如实施例1中所述。 

如图4所示，6份不同纯度的19号和1号混合样品标志带着色深度与标准 样品标志带比较后发现，混合样品半定量结果与真实纯度一致，1％的样品标志带几乎无法目测，4％样品着色与5％标准品一致，13％和20％样品介于5％和30％标准品之间，其中20％样品着色深于13％，52％样品介于50％和70％，80％样品接近70％。这种半定量测量无需对大量的单粒种子分别进行鉴别，可以快速对样品纯度范围进行检测。 

虽然已经对本发明的具体实施方式进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。 

Claims (10)

1.用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1-5所示。

2.用于检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含使用说明书，所述使用说明书中记载的随机PCR扩增反应条件是：94℃，10min；94℃1min，37℃1min，72℃2min，45个循环；72℃5min。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含用于提取样品DNA的试剂和用于随机PCR扩增反应的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含标准品和阴性对照，所述标准品为啤酒大麦目标品系的DNA序列，所述阴性对照为无菌双蒸水。

6.检测啤酒大麦品种和/或纯度的RAPD方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的引物或权利要求2至5任一项所述的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤；

(1)提取啤酒大麦DNA模板；

(2)分别使用权利要求1所述的引物对于所述步骤(1)获得的啤酒大麦DNA模板进行随机PCR扩增；

(3)对所述步骤(2)随机PCR扩增获得的产物进行毛细管芯片电泳；

(4)根据所述步骤(3)获得的标志带图谱鉴定啤酒大麦的品种；和/或

(5)对于所述步骤(3)获得的标志带图谱绘制标准曲线，建立啤酒大麦纯度检测半定量模型，以判定啤酒大麦目标品种的纯度。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的随机PCR扩增的条件被设定为：94℃，10min；94℃1min，37℃1min，72℃2min，45个循环；72℃5min。

9.根据权利要求6至8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法能够鉴定选自下述的啤酒大麦品种：甘啤3号、甘啤4号、恳啤2号、恳啤3号、Harningtan、Copeland、Metcalfe、Baudlin、Hamelin、Legacy、Kendall、Stirling、Gairdner、Estevel、Cervoise、Flagship、Arturio、Vlamingh以及Newdale。

10.权利要求1所述的引物或权利要求2至5任一项所述的试剂盒在检测啤酒大麦品种和/或纯度中的应用。