CN102220315A

CN102220315A - 基于西瓜全基因组序列信息开发分析的ssr核心引物组及其应用

Info

Publication number: CN102220315A
Application number: CN 201110095677
Authority: CN
Inventors: 许勇; 张海英; 王慧; 宫国义; 郭绍贵; 任毅; 张岩
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2031-04-15
Also published as: CN102220315B

Abstract

基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组，所述引物组包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～46所示引物。本发明获得的SSR核心引物组合具有最大限度反映西瓜种质材料遗传多样性、多态性高、重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点。利用该套引物进行遗传多样性分析，能最大限度准确反映供试材料的遗传亲缘关系。

Description

基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组及其应用

技术领域

本发明涉及核心引物序列，具体地说是一套基于西瓜基因组序列开发的SSR核心引物序列及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

西瓜作为重要的经济作物，在我国种植业结构调整和促进农民致富增收中发挥着重要作用。当前西瓜生产中种子质量问题比较突出和普遍，种子纯度不够和假种子坑农事件常有发生，同名异物、异物同名的现象十分普遍，严重干扰了种业的健康发展，也是对品种创新与知识产权保护的严重损害。常规的品种审定/鉴定主要以形态学特征为依据，需要对被测试品种在特定生长时期的农艺性状进行考察，鉴定周期较长，而且农艺性状易受环境条件的影响。同时，很多亲缘关系相近的西瓜品种间农艺性状差异较小，甚至只有单一性状的不明显变异；而且西瓜生产中一般要在结瓜后才能判断种子纯度和真实性，周期长达3-4个月，因此单纯依靠品种形态特征进行准确、快速的品种鉴别变得越来越困难。

基于DNA多态性的分子标记正逐渐成为分析生物遗传多样性的有力工具，在农作物遗传分析中应用较多的主要有RAPD、ISSR、AFLP等，而这些标记均是采用无基因组序列信息的标记技术，尽管有一定的实用性，但标记随机性强、稳定差。SSR技术具有共显性、重复性好等优点，是目前进行遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究的首选标记。但如果将基因组的所有SSR位点对供试种质一一进行分析，需要耗费大量的人力和物力，是不可能实现的。为提高SSR技术的检测效率，玉米、小麦等大田作物采用核心引物进行相关研究。核心引物指均匀覆盖染色体全基因组、多态性、稳定性、重复性等综合特性好、可作为初步研究优先选用的一套引物。由于核心引物相对固定，不同实验室均可使用该套引物进行相关研究。但并非所有SSR引物具有同等检测结果和检测效率，不同引物组合的检测能力差异极大，我们无法准确判断引物组合是否正确地反映参试品种的特异性和遗传多样性。理论上，只有进行每个品种全基因组序列的比较才能正确反映不同品种的特异性。然而，目前多数植物基因组测序计划尚未完成，很难进行序列比较，只能通过反复筛选核心引物组合才能获得理想的试验结果，工作量极大且容易出错。

发明内容

本发明的目的在于提供一套基于西瓜基因组序列开发的SSR核心引物组。

本发明的再一目的在于提供上述核心引物组的用途。

本发明的第三目的在于提供利用上述核心引物组进行西瓜品种资源遗传多样性评价分析的方法，该方法可靠、迅速，能最大限度准确反映供试材料的遗传亲缘关系。

本发明的发明思路为：针对上述现有技术的问题，本发明依据西瓜基因组序列开发了一套SSR核心引物序列，可用于西瓜种质资源核酸指纹库构建和遗传背景等研究。在西瓜全基因组测序的基础上，首先依据覆盖整个基因组的303,0194个SNP位点对17份重测序材料进行全景检测分析并绘制系统发育树，由于系统发育树是通过比较17份重测序材料的全基因组序列得到的，因此能正确显示不同测序品种的特异性。以此系统发育树为模版，利用不同SSR引物组合对上述测序品种材料进行遗传多样性分析，并比较分析二者的研究结果，选取与系统发育树结果一致的引物组合作为检测遗传多样性的引物组合，将能迅速获得最大限度准确反映遗传多样性关系的核心引物组合。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组，所述引物组包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～46所示引物。

所述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在西瓜品种遗传多样性分析中的应用。

上述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在西瓜品种真伪性鉴别中的应用。

上述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在杂种纯度鉴定中的应用。

上述的SSR核心引物组进行西瓜品种资源遗传多样性评价分析的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测西瓜样品基因组DNA；

(2)采用如序列表SEQ ID No.1～46所示引物进行PCR扩增；

(3)将步骤(2)的扩增产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果，某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’；

(4)利用步骤(3)的统计结果进行遗传多样性分析。

所述步骤(1)是采用CTAB小量法快速提取待测西瓜样本基因组DNA，步骤为：1ml/管96孔管加入叶片2～3片；加入400ul CTAB缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65℃水浴1小时；4℃冰箱冷却至15℃以下，10～40分钟；加入200ul体积比为24∶1，4℃预冷的氯仿/异戊醇，200ul酚，上下混匀5分钟；4500rpm离心30分钟；取上清液300ul，加入预先加好的300ul异丙醇的96深孔板中，在台面上轻轻晃匀；4℃冰箱静止30分钟以上；4500rpm离心1小时，弃上清夜；自然吹干DNA，让异丙醇挥发干净，≥1小时；加入100ul的H₂O溶解DNA，-20℃保存备用。

所述步骤(2)为：所述的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～46所示；PCR反应条件是：12.5μl的反应体系中含有1.25μl 10×buffer(含Mg²⁺)，1.0μl 2.5mMdNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng SSR引物，60ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性5min，然后94℃15s，55℃15s，72℃30s，循环35次，72℃延伸4min后保存在10℃条件下。

所述步骤(3)扩增产物的检测：在PCR扩增产物中加入2μl加样缓冲液，用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。凝胶大小为180cm×120cm×1mm，电极缓冲液为1×TBE，每个点样孔加2μl样品，180V恒压下电泳约1.0h。电泳结束，银染法染色。先将胶放入固定液(450mL H₂O+50mL无水乙醇+2.5mL冰醋酸)，在摇床上轻摇6min。固定2次。倒掉固定液，加入银染液(500ml H₂O+1g硝酸银)，在摇床上轻摇12min。倒掉银染液，清洗两次。第一次用500ml蒸馏水洗30s；第二次在500ml蒸馏水中加入120ul硫代硫酸钠洗30s。清洗后，倒掉蒸馏水加入显色液(500ml H₂O+7.5g NaOH+1500ul甲醛)，轻摇至DNA条带显出为止，当条带清晰时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟。倒掉固定液，用蒸馏水中漂洗5分钟。照相并统计带型。某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’。

所述步骤(4)是使用NTSYS-pc Ver.2.10e软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用Picalc 0.6软件计算各引物的PIC值(多态性信息量)。

本发明基于西瓜基因组序列开发一套SSR(Simple Sequence Repeat，SSR)核心引物序列，并使用该套核心引物准确进行西瓜种质资源材料的遗传多样性分析。

本发明的有益效果：

本发明获得的SSR核心引物组合具有最大限度反映西瓜种质材料遗传多样性、多态性高、重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点。利用该套引物进行遗传多样性分析，能最大限度准确反映供试材料的遗传亲缘关系。

下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。

附图说明

图1为建立在西瓜全基因组测序SNP信息基础上的17份重测序材料系统发育树；

图2为建立在39个SSR指纹数据基础上的17份重测序材料聚类图；

图3为依据23个引物组合绘制的17份测序材料亲缘关系图谱；

图4为依据11个引物组合绘制的17份测序材料亲缘关系图谱；

图5为依据5个引物组合绘制的17份测序材料亲缘关系图谱；

图6为相似系数矩阵标准误与SSR位点数关系图谱；

图7为依据23个核心引物组合绘制的117份西瓜育种材料亲缘关系图谱。

具体实施方式

实施例1西瓜育种材料遗传多样性研究

一、材料和方法：

1.1材料

供试材料为17份重测序材料和100份西瓜育种材料。

17份西瓜重测序材料涵盖西瓜的Citrullus lanatus和Citrullus colocynthis 2个种以及Citrullus lanatus var.lanatus、Citrullus lanatus var.citroides 2个变种。类型丰富，从无籽到有籽、从黄瓤到红瓤、从小瓜到大瓜，基本涵盖了西瓜主要生态类型与主要农艺性状，尽可能多地体现了种质多样性，具有较高的遗传多样性(表1)。

100份西瓜育种材料为亲缘关系明确的育种材料，主要用于调整和验证核心引物。

1.2研究方法

1.2.1基因组DNA的提取

1ml/管96孔管加入离心管盖大小新鲜叶片2-3片；加入400ul CTAB缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65℃水浴1小时；4℃冰箱冷却至15℃以下(约30分钟)；加入200ul 24：14℃预冷的氯仿/异戊醇，200ul酚，上下混匀5分钟；4500rpm离心30分钟；取上清液300ul，加入预先加好的300ul异丙醇的96深孔板中，在台面上轻轻晃匀；4℃冰箱静止30分钟以上；4500rpm离心1小时，弃上清夜；自然吹干DNA，让异丙醇挥发干净(≥1小时)；加入100ul的H₂O溶解DNA，-20℃保存备用。

DNA浓度用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以OD260值测定，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。

1.2.2PCR扩增与产物的检测

12.5μl的反应体系中含有1.25μl 10×buffer(含Mg²⁺)，1.0μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng SSR引物(SEQ ID No.1～46所示)，60ng模板DNA。TaqDNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTP购自上海Sangon公司。SSR引物由北京奥科生物公司合成。

反应程序：94℃预变性5min，然后94℃15s，55℃15s，72℃30s，循环35次，72℃延伸4min后保存在10℃条件下。PCR仪为美国Biorad公司制造的PTC-100。

扩增产物的检测：在PCR扩增产物中加入2μl加样缓冲液，用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。凝胶大小为180cm×120cm×1mm，电极缓冲液为1×TBE，每个点样孔加2μl样品，180V恒压下电泳约1.0h。电泳结束，银染法染色。先将胶放入固定液(450mL H₂O+50mL无水乙醇+2.5mL冰醋酸)，在摇床上轻摇6min。固定2次。倒掉固定液，加入银染液(500ml H₂O+1g硝酸银)，在摇床上轻摇12min。倒掉银染液，清洗两次。第一次用500ml蒸馏水洗30s；第二次在500ml蒸馏水中加入120ul硫代硫酸钠洗30s。清洗后，倒掉蒸馏水加入显色液(500ml H₂O+7.5g NaOH+1500ul甲醛)，轻摇至DNA条带显出为止，当条带清晰时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟。倒掉固定液，用蒸馏水中漂洗5分钟。照相并统计带型。某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’。

1.2.3核心引物筛选

利用重测序材料97103和PI296341-FR获得的重组自交系群体RIL₁₀，本实验室构建了高密度遗传图谱。图谱包含1023个SSR标记，覆盖基因组长度679.8cM。本发明利用17份重测序材料中的4份材料-97103(Citrullus lanatus var.lanatus)、PI296341-FR(Citrullus lanatus var.citroides)、PI386019(Citrullus colocynthis)和PI595203(Citrullus lanatus var.lanatus)对1023个来自遗传图谱的引物进行初步筛选，获得在Citrullus lanatus和Citrullus colocynthis 2个种之间、Citrullus lanatus var.lanatus和Citrullus lanatus var.citroides两个变种之间以及Citrullus lanatus var.lanatus栽培种和野生种之间有差异的引物。利用2个重测序材料(97103和Sugarlee，分别属于东亚生态类型和美洲生态类型)对初步筛选引物进行复筛，获得在变种Citrullus lanatus var.lanatus不同生态型间具有多态性的引物。最后以条带清晰、便于统计，在不同栽培种之间具有多态、且来自不同连锁群作为核心引物的标准，在鉴别17份重测序材料的基础上，筛选核心引物组合。

1.2.4数据统计

依据西瓜重测序序列中3030194个SNP信息，利用Mega软件绘制17份重测序材料的系统发育树。

利用带型统计结果进行遗传多样性分析。使用NTSYS-pc Ver.2.10软件进行基于UPGMA法的聚类分析。使用Picalc 0.6软件计算各引物的PIC值(多态性信息量)。

表117份重测序材料

二、结果与分析

2.117份重测序材料的SSR标记多态性分析

利用97103(Citrullus lanatus var.lanatus)、PI296341-FR(Citrullus lanatus var.citroides)、PI386019(Citrullus colocynthis)和PI595203(Citrullus lanatus var.lanatus)对1023对来自遗传图谱的引物进行初步筛选，获得在Citrullus lanatus和Citrullus colocynthis 2个种之间、Citrullus lanatus var.lanatus和Citrullus lanatus var.citroides两个变种之间以及Citrullus lanatus var.lanatus栽培种和野生种之间有差异的引物105对，占总引物数量的10.26％。105对多态性引物在17份重测序材料中共检测到364个等位基因变异，平均每个SSR位点有3.53个，变幅为2-7个。位点多态性信息含量(PIC)为0.11-0.82，平均0.54，PIC在0.6以上的SSR位点有41个。可见，本发明采用的17份重测序材料基本上能有效地检测出不同西瓜种间(Citrullus lanatus和Citrullus colocynthis)，变种间(Citrullus lanatus var.lanatus、Citrullus lanatus var.citroides)以及同一种间不同种质材料的SSR差异位点，具有较高的遗传多样性代表性。

利用97103(东亚生态类型)和Sugarlee(美洲生态类型)对初选的105个引物进行复筛，获得在变种Citrullus lanatus var.lanatus的栽培种之间中具有多态性的引物76对，其条带清晰、多态性好、稳定性好，占总引物数量的7.4％。76对多态性引物在17份重测序材料中共检测到155个等位基因变异，平均每个SSR位点有2.21个，变幅为2-4个。位点多态性信息含量(PIC)为0.11-0.82，平均0.6，PIC在0.6以上的SSR位点有39个。

2.2SSR核心引物的筛选

依据基因组测序获得的17份重测序材料系统发育树显示(图1)，17份重测序材料可以分为6类，与传统的植物学分类结果完全一致。第1类为PI386019，为Citrullus colocynthis类型，第2类包括PI296341-FR、PI482303和PI482276等3份材料，为Citrullus lanatus var.citroides类型，第3、4类为PI595203和PI482271，属于Citrullus lanatus var.lanatus的野生种质，第5类包括97103、JX-2、JLM、JXF、RZ901、XHBFGM等6份材料，属于Citrullus lanatus var.lanatus的东亚生态型，第6类包括Black diamond、Calhoun Gray、Sugarlee、RZ-900、Sy-904304等5份材料，属于Citrullus lanatus var.lanatus的美洲生态型。

将39对PIC值在0.6以上的SSR引物作为核心引物的备选引物，利用UPGMA对17份重测序材料进行聚类分析，聚类图与系统发育树基本一致，可以明显分为Citrullus colocynthis、Citrullus lanatus var.citroides和Citrullus lanatus var.lanatus的栽培、野生变种4大类群，而Citrullus lanatus var.lanatus的栽培变种又可分为东亚生态型和美洲生态型2个小类群(图2)。

依据标记数目最少和每个连锁群至少有一个标记的原则，并与系统发育树进行比较分析，通过不断调整各种引物组合，获得23对引物组合能够与39对引物组合的聚类结果基本相同。其每个大类别所包含的种质材料以及材料之间的遗传相似系数具有较高的一致性，且23对引物分布于11个连锁群，平均每个连锁群有2个标记，所以可以将23个核心引物确定为首选核心引物(图3)。

为了能够获得以最少的引物数目能代表最大的遗传多样性信息，我们把核心引物数目继续减少到11对，11对核心引物和23对核心引物所反映的17份重测序材料之间DNA水平差异也基本吻合(图4)，但这11对核心引物只分布在6个连锁群，没有覆盖整个西瓜基因组，同时利用亲缘关系明确的100份育种材料进行验证时，也不能区分一些亲缘关系很近的育种材料，如302、贵母和双星母本，他们的遗传相似系数显示为1。当核心引物数目减少到5对时，17份重测序材料依然可以分为5大类，但不能有效区分不同的重测序材料，如PI482303和PI482276，RZ-901和XHBFGM，以及Calhoun Gray、Sugarlee(图5)，并且材料之间的遗传相似系数也发生了较大变化。因此，采用5个或11个的引物组合，不能准确反映参试材料的遗传多样性信息，这些引物组合不能作为核心引物组合。

相似系数矩阵标准误分析表明随标记数的增加，相似系数矩阵标准误的变化情况。结果显示在标记数为5时，标准误为0.0013，当标记数增加到10以上时，标准误恒定在0.0012，说明依据西瓜基因组测序序列进行引物组合筛选，获得的引物组合能够真实反映材料之间的遗传关系，标准误都极小，也从另一方面证明所获得的引物组合正确。

表2 23个核心引物信息

实施例2本发明SSR核心引物组的有效性检验

在100份育种材料中有许多亲缘关系很近的材料，如中籽京母、K209、中心京母均由同一个优良单株系统选育而成，159白皮是佘948父本-1的姊妹系，京欣1号F₁、京欣2号F₁、京欣7号F₁具有相似的血缘。采用23个核心引物组合进行聚类分析，结果显示这三组材料的遗传相似系数均大于0.9。说明23个核心引物所反映的材料之间DNA水平的差异与材料来源的系谱分析结果基本一致。

同时，100份育种材料聚类分析结果显示，佘948母本-1和佘948母本-2的遗传相似系数为1。而这两份材料确实来源于同一育种材料，说明23对首选核心引物不仅可以对遗传距离狭窄的品种(系)具有很好的鉴别力，而且能对品种的真实性作出判断。

2.3 117份参试材料遗传多样性分析

UPGMA聚类分析显示(图7)，117份供试材料的遗传相似系数变幅为0.54-1.00。在遗传相似系数0.54处，所有的供试材料被聚为一类。以遗传相似系数0.615为阈值，将供试材料划分为3大类群：即Citrullus lanatus var.lanatus(A)、Citrullus lana tus var.citroides(B)和Citrullus colocynthis(C)。相对于Citrullus lana tus var.lana tus，Citrullus lana tus var.citroides与Citrullus colocynthis的遗传相似性更高，其遗传相似系数达0.62，而Citrullus lanatus var.lanatus和Citrullus colocynthis遗传相似系数仅为0.54。

在遗传相似系数为0.656处，又可将A类(citrullus lanatus var.lanatus)划分为2个亚类：A1(栽培品种类型)和A2(野生种质类型)。A1亚类包括111份材料，占所有供试材料的94.87％。111份栽培材料间遗传多样性水平较窄，其遗传相似系数变幅为0.763～1.00。由此可知中国西瓜主栽培品种和育种材料遗传基础狭窄。A2类包括PI595203和PI482271两份材料，它们虽然也属于Citrullus lanatus var.lanatus，但为野生种质类型，与栽培种的亲缘关系相对较近，可能是栽培物种的起源种。

以0.786为阈值将A1栽培品种类型分为I，II两个小类。

I类共包括86个品种，它们大多来源于日本品种或者具有日本品种的血缘，因此可视为东亚类型，占A1亚类的77.48％。按照阈值0.8，又可86个品种划分为京欣西瓜类型和无籽西瓜类型。其中53个京欣西瓜类型材料大多具有日本血缘，表明日本种质资源在中国西瓜育种中起了很大的作用，这一方面说明了它们的适应性及亲和性强，但也说明我国西瓜引种存在的局限性，我们应大力加强引进其他国家的西瓜种质资源，来提高我国西瓜种质资源的遗传多样性。而33个无籽西瓜类型材料大多具有美国和东亚生态类型，因此应该划分为中间生态类型。

II类为共包括Sugarlee(4)、159白皮(38)、佘948父本-1(54)、90-4304(115)、Calhoun Grey(9)等25个品种，占A1亚类的22.52％。按照传统西瓜生态类型划分，它们大多来源于美国品种或者具有美国品种的血缘，因此它们可以划分为美国生态类型。

聚类结果表明品种的遗传关系与西瓜生态类型分类有较为明显的关系，即同属于某一生态类型的西瓜品种在不同程度上聚在一起。聚类结果与供试材料系谱相对照，基本反映出了供试材料种质资源亲缘关系的远近。该分类结果从DNA水平上体现了这些种质资源的亲缘关系，可以为西瓜育种亲本选择提供理论依据。

Claims

1.基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～46所示引物。

2.权利要求1所述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在西瓜品种遗传多样性分析中的应用。

3.权利要求1所述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在西瓜品种真伪性鉴别中的应用。

4.权利要求1所述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在杂种纯度鉴定中的应用。

5.利用权利要求1所述的SSR核心引物组进行西瓜品种资源遗传多样性评价分析的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测西瓜样品基因组DNA；

(2)采用如序列表SEQ ID No.1～46所示引物进行PCR扩增；

(4)利用步骤(3)的统计结果进行遗传多样性分析。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是采用CTAB小量法快速提取待测西瓜样本基因组DNA，步骤为：1ml/管96孔管加入叶片2～3片；加入400ul CTAB缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65℃水浴1小时；4℃冰箱冷却至15℃以下，10～40分钟；加入200ul体积比为24∶1，4℃预冷的氯仿/异戊醇，200ul酚，上下混匀5分钟；4500rpm离心30分钟；取上清液300ul，加入预先加好的300ul异丙醇的96深孔板中，在台面上轻轻晃匀；4℃冰箱静止30分钟以上；4500rpm离心1小时，弃上清夜；自然吹干DNA，让异丙醇挥发干净，≥1小时；加入100ul的H₂O溶解DNA，-20℃保存备用。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)为：所述的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～46所示；PCR反应条件是：12.5μl的反应体系中含有1.25μl 10×buffer(含Mg²⁺)，1.0μl 2.5mMdNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng SSR引物，60ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性5min，然后94℃15s，55℃15s，72℃30s，循环35次，72℃延伸4min后保存在10℃条件下。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)是使用NTSYS-pc Ver.2.10e软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用Picalc 0.6软件计算各引物的PIC值。