CN105154550A - 一种利用est-ssr分子标记快速鉴定西瓜品种珍甜1217纯度的方法 - Google Patents

一种利用est-ssr分子标记快速鉴定西瓜品种珍甜1217纯度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子标记领域，提供了一种利用EST-SSR分子标记快速鉴定西瓜品种珍甜1217纯度的方法，该方法采用专门设计的EST-SSR引物，以珍甜1217基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测珍甜1217的品种纯度进行检测，采用这种方法可以在珍甜1217植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；准确性高，应用推广前景广阔，为开展西瓜制种和良种的及时销售提供科学依据。

Description

一种利用EST-SSR分子标记快速鉴定西瓜品种珍甜1217纯度的方法
技术领域
本发明涉及分子标记领域，具体提供了一种利用EST-SSR分子标记快速鉴定西瓜品种珍甜1217纯度的方法。
背景技术
珍甜1217是山东省华盛农业股份有限公司最新培育的高品质西瓜品种，易座瓜，开花至成熟28天左右，瓜近圆形，单果重6kg左右。底色绿并覆盖有青黑色条斑，条斑细且清晰度好。皮厚1.0cm，果肉大红色，肉质松脆多汁，含糖量13％左右，品质好，耐热性强，适宜保护地及露地种植。该品种在杂交制种过程中,母本需要人工去雄，授以父本花粉来完成杂交过程，母本去雄不彻底或漏去雄，都将会极大地影响制种纯度。因此鉴定杂交西瓜种子纯度至关重要。
传统的西瓜杂交种子纯度鉴定工作仍然以田间种植鉴定为主，通过成株外观形状比较鉴定，该方法鉴定一般需要2个月，时间长、费用高、难度大且准确性差，需要鉴定人员具有丰富的经验，且易受栽培措施和环境条件的影响，严重影响品种鉴定的效率及准确性，越来越不能满足现代育种工作和生产经营的需要。
室内纯度检验通常采用分子标记技术，该技术从DNA水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，不受环境条件和栽培措施的影响，无组织、器官及发育特异性，能够检测微小的变异，不受植株生长季节的限制，多态性丰富、稳定性高，可以大大缩短鉴定时间。EST-SSR(expressedsequencetag-simplesequencerepeat)标记，是根据EST序列中的简单串联重复序列开发的一种标记类型，是一类由几个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，根据串联重复单位数目的差异检测多态性。EST-SSR标记具有多态性丰富、共显性遗传、稳定性和重复性较好、对DNA质量要求不高、操作简单易行、不受环境因素影响等优点，与基因组SSR标记相比，EST-SSR标记不仅降低了开发成本、提高了开发效率，而且节省了开发时间，显著提高了其利用价值。因此如何利用该技术实现对珍甜1217纯度的鉴定成为亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种利用EST-SSR分子标记快速鉴定西瓜品种珍甜1217纯度的方法，该方法采用专门设计的EST-SSR引物，以珍甜1217的基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测珍甜1217的品种纯度进行检测，采用这种方法可以在珍甜1217植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；准确性高，应用推广前景广阔，为开展西瓜制种和良种的及时销售提供科学依据。
本发明所针对的西瓜品种为珍甜1217，为了对珍甜1217进行品种纯度的鉴定，获得母本和父本的优良杂交品种，本发明的发明人首先提供了一对EST-SSR引物，命名为ZT1217，其正向序列为5’-TCGGATCTAGGCGAAGGTGGTCG-3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；反向序列为5’-GCTCAGGAGGGAGTTTACGGTC-3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，
在获得上述引物之后发明人利用其对待测品种珍甜1217的杂交种及其亲本的幼嫩组织基因组DNA进行了扩增，具体过程如下：
(1)提取珍甜1217杂交种及其亲本幼根基因组DNA；
(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板，用EST-SSR引物ZT1217进行PCR扩增：
PCR反应体系为10μL，其中包括10×PCRBuffer1μL，0.2mMdNTPs，DNA模板100ng，引物各5μM，0.5UTaqDNA聚合酶，无菌超纯水补齐至10μL；
扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终延伸5min；PCR产物保存于10℃；
发明人经过多次试验后发现，针对本发明的发明目的，以及专门设计的特异性引物，扩增程序中将退火温度设置为57℃时，扩增效果最好，最终检测的结果更加贴近与实际情况，故而将本发明的退火温度设定为57℃。
(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；
其中所采用的非变性聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺的质量比为29∶1；
所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液；
(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定“珍甜1217”杂交种的纯度，判定标准为：
母本具有159bp特异谱带,其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；父本具有147bp特异谱带,其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；杂交种具有159bp和147bp两条特异谱带；
根据上述鉴定结果，可以换算珍甜1217品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％，其中N为待测西瓜种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“珍甜1217”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。
上述方法中发明人并没有采用常规的叶片提取基因组DNA的方式，而是选用了幼根提取，这是由于发明人经过多次试验后发现，针对本发明的发明目的，选取幼根也能提取出适合纯度鉴定的基因组DNA，与叶片无差别，但选取幼根会大大缩短材料准备时间，故而将本发明取材优先选取幼根，这样一来整体纯度鉴定时间可缩减为4天，较之采用叶片提取基因组DNA的方式缩短了3天。
且为了适应本发明的需要，发明人重新设计了用EST-SSR引物ZT1217进行PCR扩增时的扩增程序，使其具有明显的针对性，且可以保证扩增效果，为最终检测的准确性提供了可靠的保证。
利用上述方法，即可实现对珍甜1217品种纯度的快速检测，能够不受栽培措施和环境条件的影响；无器官、组织及发育特异性：该方法在植株生长的任何时期均可进行鉴定；多态性丰富、共显性遗传：能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单：该方法在苗期即可进行鉴定，节省大量人力、物力和土地资源；重复性和稳定性较好；快速高效：4天即可完成种子纯度鉴定工作；准确性高：该方法从基因组水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，克服了田间表型鉴定带来的误差；应用推广前景广阔：可以快速、准确检测“珍甜1217”杂交种纯度，为开展西瓜制种和良种的及时销售提供科学依据。
附图说明
图1为本发明杂交种“珍甜1217”种子检测特征引物的PCR电泳图谱，
其中，P1为“珍甜1217”母本；F1为多组“珍甜1217”F1杂交种；P2为“珍甜1217”父本，
结果显示：“珍甜1217”F1杂交种拥有分别来自父、母本的147bp和159bp的两条带；
图2为不同PCR退火温度对“珍甜1217”商品种子样品的纯度检测结果的影响电泳图谱；
其中，P1为“珍甜1217”母本；F1为“珍甜1217”F1杂交种；P2为“珍甜1217”父本，
结果显示，最佳退火温度在57℃时，最易区分珍甜1217杂交种纯度；
图3为不同DNA模板量对“珍甜1217”商品种子样品的纯度检测结果的影响电泳图谱，
其中，P1为“珍甜1217”母本；F1为“珍甜1217”F1杂交种；P2为“珍甜1217”父本，
结果显示，DNA模板量从100ng至1000ng均可用于“珍甜1217”商品种子样品的纯度检测。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；下数实施例中的百分比除特殊注明外，均为重量百分比。
实施例1珍甜1217品种叶片基因组DNA的获取
具体操作方法如下：
(1)将“珍甜1217”亲本与F1种子放入铺有潮湿滤纸的培养皿中，30℃黑暗培养3d后取幼根；
其中，该品种在杂交制种过程中,母本需要人工去雄，授以父本花粉来完成杂交过程，最后收获母本上的F1代种子；
(2)每个离心管中放入一个西瓜幼根，加入60-65℃预热的500μL提取缓冲液，放入钢珠4粒，于破碎机上将材料打碎，60-65℃水浴20-30min；
其中所述的提取缓冲液为2×CTAB提取液，其配比如下：
高温灭菌，冷却至室温，加2mL巯基乙醇，室温保存，
(3)上步获得的液体经10000rpm/min离心10min，取上清于另一离心管，加入等体积(500μL)苯酚：氯仿：异戊醇(体积比为25:24:1)混合液；
(4)上步混合液经10000rpm/min离心10min，取上清液于另一离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24:1)混合溶液；
(5)上步混合液经10000rpm/min离心10min，取上清溶液于另一离心管中，加入400μL异丙醇混匀；
(6)上步混合液经12000rpm/min离心15min，弃上清，固体物质用70％乙醇洗涤，晾干；
(7)向上述固体中加入200μLddH2O回溶，加入1μLRNA酶37℃水浴30min，-20℃备用。
实施例2PCR扩增
以上述获得的RNA酶解混合物为模板，利用ZT1217引物进行PCR扩增：
PCR反应体系为10μL，其中包括10×PCRBuffer1μL，0.2mMdNTPs，引物各5μM，0.5UTaqDNA聚合酶，模板100ng，无菌超纯水补齐至10μL；
根据本发明针对性设置扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终延伸5min；PCR产物保存于10℃。
实施例3扩增产物检测
5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；
所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液；
其中所述的12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶配方(100mL)如下：
其中所采用的30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺配置过程如下：
丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g蒸馏水定容至100mL4℃避光保存，保质期一个月；
所采用的10╳TBE配置过程如下：
TrisBase27g，硼酸13.75g，0.5M/LEDTA10mL，蒸馏水定容至250mL，调pH至8.3；
所采用的10％过硫酸铵(APS)以过硫酸铵0.1g和蒸馏水1mL的比例现用现配。
电泳缓冲液为1×TBE，电泳结束后，凝胶显色采用银染方法，具体过程如下：
1.水洗：ddH2O水洗2次，每次1min；
2.染色：用1‰AgNO3浸泡，平行摇动10-15min；
3.水洗：倒掉显色液，ddH2O水洗2次，每次1min；
4.显影：在盘中加入显色液(每升显色液中含有16g氢氧化钠和8mL甲醛，余量为纯净水)，然后平行摇动直至显影清楚；
5.终止：用终止液(每升终止液中含有7.5g碳酸化钠，余量为纯净水)浸泡2min，后加入ddH2O水清洗1-2次；最后用相机照相保存。
实施例4鉴定“珍甜1217”杂交种的纯度
根据特异谱带的电泳结果鉴定“珍甜1217”杂交种的纯度，判定标准为：
母本具有159bp特异谱带；父本具有147bp特异谱带；杂交种具有159bp和147bp两条特异谱带；
根据上述鉴定结果，可以换算珍甜1217品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％，其中N为待测西瓜种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“珍甜1217”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。
实验例
以2014年生产的珍甜1217种子为例，收获F1代种子后马上将F1代种子进行催芽萌发，大约3d后取幼根提取西瓜基因组DNA，利用本发明的ZT1217分子标记进行纯度鉴定，4d即可获得的种子纯度结果；
利用常规鉴定方法即田间种植形态鉴定：需到海南进行加代纯度鉴定，生长周期约为60天左右，且受到多种恶劣天气影响，可能需多次重复播种鉴定，鉴定时间不好估计。具体比较如下表：
可见与常规鉴定方法相比较，利用该分子标记法鉴定珍甜1217杂交种子纯度快速高效、操作简单、重复性好、成本较低。

Claims (3)

1.一种利用EST-SSR分子标记快速鉴定西瓜品种珍甜1217纯度的方法,其特征在于：利用EST-SSR引物进行鉴定，所述的EST-SSR引物命名为ZT1217，其正向序列为5’-TCGGATCTAGGCGAAGGTGGTCG-3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；反向序列为5’-GCTCAGGAGGGAGTTTACGGTC-3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
2.根据权利要求1所述的利用EST-SSR分子标记快速鉴定西瓜品种珍甜1217纯度的方法,其特征在于：具体步骤如下：
(1)提取珍甜1217杂交种及其亲本幼根基因组DNA；
(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板，用EST-SSR引物ZT1217进行PCR扩增：
PCR反应体系为10μL，其中包括10×PCRBuffer1μL，0.2mMdNTPs，引物各5μM，0.5UTaqDNA聚合酶，DNA模板100ng，无菌超纯水补齐至10μL；
扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终延伸5min；PCR产物保存于10℃；
(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；
其中所采用的非变性聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺的质量比为29∶1；
(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定“珍甜1217”杂交种的纯度，判定标准为：
母本具有159bp特异谱带,其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；父本具有147bp特异谱带,其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；杂交种具有159bp和147bp两条特异谱带；
根据上述鉴定结果，换算珍甜1217品种纯度＝(1-n/N)×100％，其中N为待测西瓜种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于珍甜1217谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。
3.根据权利要求2所述的利用EST-SSR分子标记快速鉴定西瓜品种珍甜1217纯度的方法,其特征在于：
步骤(3)中所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液。
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