CN109868327A - 一种基于est-ssr标记的甜瓜杂交种甜9号种子纯度鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于EST‑SSR标记的甜瓜品种“甜9号”杂交种种子纯度鉴定的方法。该方法以甜瓜品种“甜9号”杂交种及其双亲的基因组DNA为模板，通过Gene Bank数据库上公布甜瓜EST序列，利用Primer 3.0在线引物设计，设计EST‑SSR引物。经过筛选，得到1对杂交种带型为双亲的互补带型引物，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，能够对甜瓜杂交品种进行纯度鉴定。本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。
Description
技术领域
本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及甜瓜杂交种“甜 9号”纯度鉴定方法，是一种基于EST-SSR分子标记技术的杂交种种子纯度鉴定方法。
背景技术
“甜9号”是天津科润蔬菜研究所全新培育的厚皮甜瓜新品种，植株长势健壮，耐低温性好，对甜瓜多发病有较强的抗性，坐果性好。果实发育期38天，单果重可达3公斤以上。果皮黄色，果面光洁。果肉浅绿色，肉厚4.5厘米，含糖量16.0％，肉质较脆，香味清香，口感风味俱佳。
甜瓜种子纯度的高低是直接衡量种子质量优劣的主要指标。种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质，使农民蒙受巨大的经济损失。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。
EST-SSR标记因其具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一。近年来，随着测序技术的不断提高和分子生物学的深入研究，大量瓜类作物的EST被测序，迄今为止，国际葫芦科基因组计划研究小组共收录西瓜ESTs588789 条，甜瓜129067条，黄瓜513276条。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种基于EST-SSR分子标记技术的甜瓜杂交种“甜9号”种子纯度鉴定方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
本方法通过对供试甜瓜杂交种“甜9号”进行DNA提取、PCR扩增和 EST-SSR分析，确认了杂交种及其双亲稳定的共显性互补带型，从而对甜瓜杂交种“甜9号”种子进行纯度鉴定。用于鉴定甜瓜杂交种“甜9号”种子纯度的SSR引物，包括上游引物序列：5’-TTGACCTTTTACGGTGGTCC -3’，下游引物序列：5’-CGGACAAATCCCTCTCTGAA-3’。
本发明所述快速鉴定甜瓜杂交种种子纯度的方法，该方法以温室甜瓜品种“甜9号”供试种子的基因组DNA为模板，对已知品种“甜9号”亲本DNA差异性片段进行分析。供试甜瓜杂交种取样及DNA提取方法为：对温室甜瓜随机取样，总共50株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20 g/LCTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA Na2)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA 提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL， Nanodrop ND1000，Thermo)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
供试甜瓜杂交种PCR方法为：
(1)SSR上游引物序列：5’-TTGACCTTTTACGGTGGTCC-3’，SSR下游引物序列：5’-CGGACAAATCCCTCTCTGAA-3’。
(2)采用上述SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：Master Mix 5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试甜瓜杂交种基因组 DNA模板(50ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec)； 72℃延伸7min，4℃保存；
(3)供试甜瓜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE 3mL，40％PAG 6 mL，TMED 30μL，10％过流酰胺300μL；设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(4)供试甜瓜杂交种EST-SSR结果分析，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。
本发明的检测方法在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时 90min，EST-SSR分析60-90min，所以本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
1、原理
本方法应用一种新型的核酸分析方法其原理是：EST-SSR是以1～6个碱基为重复单元，是存在于EST中的SSR。EST(Expressed sequence tag，表达序列标签)是将mRNA在体外反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克隆，对其5’端或3’端进行测序后获得的长约150～500bp的表达序列片段。EST序列来自实验室构建的 cDNA文库或从美国国家生物信息中心(NCBI)的Genbank中下载。采用相关软件合成引物，最后对研究材料进行PCR扩增和凝胶电泳，通过特异谱带进行分析，从而计算杂交种的纯度。
2、引物设计
通过Gene Bank数据库上公布的214条甜瓜EST序列，利用Primer 3.0在线引物设计，引物由上海生工合成，经筛选获得了1对EST-SSR引物可用于甜瓜杂交种种子纯度鉴定。引物由上海生物工程公司合成。
表1引物序列表如下：
3、取样及DNA提取
对温室甜瓜进行随机取样，总共50株，取靠近根部的嫩叶部分50～100 mg，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20 g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1MTris-HCl，20mM EDTA Na2)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA 提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermo)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
4、PCR反应
采用SSR上游引物序列：5’-TTGACCTTTTACGGTGGTCC-3’， SSR下游引物序列：5’-CGGACAAATCCCTCTCTGAA-3’。
SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增(仪器为ABI Veriti PCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为： Master Mix 5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板(50ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec)； 72℃延伸7min，4℃保存。
5、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
供试甜瓜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳(仪器为BIO-RAD电泳仪)，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，凝胶组分为：去离子水21mL， 10×TBE 3mL，40％PAG 6mL，TMED 30μL，10％过流酰胺300μL；上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；
染色过程(仪器为ORBITAL脱色摇床)：于600mL超纯水中加入6mL 10％的硝酸银溶液，银染8～10min；于600mL超纯水中迅速水洗；于600 mL超纯水中加入9g氢氧化钠粉末，溶解后加入3mL甲醛，显色数分钟，直至条带清晰即可；600mL超纯水中再次水洗。
6、EST-SSR谱带分析
通过分析EST-SSR结果，比较供试样品的杂交种及其双亲的特征谱带，对供试杂交种进行纯度鉴定。用筛选获得的SSR引物，母本表现为1条特征谱带，父本表现为相异于母本的1条特征谱带，纯合的杂交种即表现为这2条特征谱带的集合，也就是共显性的互补带型；非纯合的不能表现为共显性的互补带型，可能表现为母本特征谱带带型，即出现了母本自交。
7、纯度鉴定
通过计算供试品种样品中杂交种的比例确定种子纯度:
种子纯度＝杂交种数量/供试样品数量*100％。
附图说明:
图为筛选获得的TJT9引物用于甜瓜杂交种及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为母本1～2、杂交种3～13、父本14～15；
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法作以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1。
实施例1
(1)试剂：Promega公司生产的Master Mix溶液；上海生工合成的 EST-SSR引物；
(2)EST-SSR引物序列表如下：
| 引物名称 | 序列(5'to3') |
| TJT9-正向引物 | TTGACCTTTTACGGTGGTCC |
| TJT9-反向引物 | CGGACAAATCCCTCTCTGAA |
(3)取样及DNA提取
供试品种幼苗120株，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA Na2)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermo)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
(4)PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试幼苗DNA模板及其亲本DNA进行 PCR扩增(仪器为ABI Veriti PCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：Master Mix 5μL，上游和下游引物10 μmol/L各0.5μL，供试品种母本基因组DNA模板(50ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃45 sec，55℃45sec，72℃45sec)；72℃延伸7min，4℃保存。
(5)凝胶电泳及银染
供试品种母本PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(6)EST-SSR结果分析：120株供试幼苗中有2株的电泳带型与母本带型一致，为非杂交种。
(7)纯度鉴定
通过计算供试品种样品中杂交种的比例确定种子纯度。
种子纯度＝118/120*100％＝98.33％。
实施例2
(1)试剂：Promega公司生产的Master Mix溶液；上海生工合成的 EST-SSR引物；
(2)EST-SSR引物序列表如下：
| 引物名称 | 序列(5'to3') |
| TJT9-正向引物 | TTGACCTTTTACGGTGGTCC |
| TJT9-反向引物 | CGGACAAATCCCTCTCTGAA |
(3)取样及DNA模板提取
供试品种幼苗136株，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA Na2)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermo)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
(4)PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试幼苗DNA模板及其亲本DNA进行 PCR扩增(仪器为ABI Veriti PCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：Master Mix 5μL，上游和下游引物10 μmol/L各0.5μL，供试品种父本基因组DNA模板(50ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃45 sec，55℃45sec，72℃45sec)；72℃延伸7min，4℃保存。
(5)凝胶电泳及银染
供试品种父本PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(6)EST-SSR结果分析：136株供试幼苗中有3株的电泳带型与母本带型一致，为非杂交种。
(7)纯度鉴定
通过计算供试品种样品中杂交种的比例确定种子纯度。
种子纯度＝133/136*100％＝97.79％。
实施例3
(1)试剂：Promega公司生产的Master Mix溶液；上海生工合成的 EST-SSR引物；
(2)EST-SSR引物序列表如下：
(3)取样及DNA提取
供试品种取杂交种单株102，液氮冷冻研磨(Retsch MM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl， 20mM EDTA Na2)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA 提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermo)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。
(4)PCR反应
按上表所述的PCR扩增引物对供试品种杂交种单株模板DNA进行PCR 扩增(仪器为ABI Veriti PCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：Master Mix 5μL，上游和下游引物10μmol/L 各0.5μL，供试品种杂交种基因组DNA模板(50ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃45sec， 55℃45sec，72℃45sec)；72℃延伸7min，4℃保存。
(5)凝胶电泳及银染
供试品种杂交种PCR产物上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(6)EST-SSR结果分析：供试品种杂交种带型为母本1条与父、母本相异于的1条，这2条特征谱带的集合，也就是共显性的互补带型。
(7)纯度鉴定
通过计算供试品种样品中杂交种的比例确定种子纯度。
种子纯度＝100/102*100％＝98.04％。
序列表
<110> 天津市农业质量标准与检测技术研究所
<120> 一种基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种“甜9号”种子纯度鉴定的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 甜瓜(Cucumis melo)
<400> 1
ttgacctttt acggtggtcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 甜瓜(Cucumis melo)
<400> 2
cggacaaatc cctctctgaa 20
Claims (2)
1.用于鉴定甜瓜杂交种“甜9号”种子纯度的1对SSR引物，其特征在于，包括上游引物序列：5’- TTGACCTTTTACGGTGGTCC -3’， 下游引物序列： 5’- CGGACAAATCCCTCTCTGAA -3’。
2.一种采用权利要求1所述引物，基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种“甜9号”种子纯度鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）采用权利要求1所述的SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq®Master Mix 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板（50ng/μL）1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性2 min，32个扩增循环（94℃ 45sec，55℃ 45 sec，72℃ 45 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；（2）对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40 %PAG 6 mL，TEMED 30 μL，10% 过流酰胺 300 μL；设定电压 250 V，电泳 30 min，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；（3）通过分析EST-SSR结果，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。
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