CN102676504A

CN102676504A - 快速提取大量样品微量dna的方法及其在利用ssr标记鉴定作物杂交种纯度上的应用

Info

Publication number: CN102676504A
Application number: CN2012101534420A
Authority: CN
Inventors: 王玉刚; 冯辉; 李承彧; 刘志勇; 冀瑞琴; 聂子静; 薛一花
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明公开一种快速提取大量样品微量DNA的方法及其利用SSR标记鉴定作物杂交种纯度上的应用，适于多种作物杂交种纯度鉴定。在进行PCR扩增试验时，直接利用10ul排枪进行操作，省去分装DNA过程，方便易行，提高效率，能短时间提取大量样品的微量DNA，本发明所提取的DNA直接用于PCR扩增，具有操作简单、快速、药品用量少、成本低等优点。

Description

快速提取大量样品微量DNA的方法及其在利用SSR标记鉴定作物杂交种纯度上的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种快速提取大量样品微量DNA的方法及其在作物SSR标记杂交种纯度鉴定上的应用。

背景技术

现代农业生产中，杂交种获得了广泛应用，并在农业生产中发挥了重要作用。种子作为重要的农业生产资料，种子纯度是保证农作物品种增产潜力得以发挥的关键因素, 开展种子纯度鉴定对保证种子质量具有重要意义。常规田间鉴定方法一直是各育种单位采用的方法，但此法周期长、工作量大且易受环境条件影响，有一定风险，造成种子积压，影响种子推广销售。

随着现代分子生物学的发展, DNA 分子标记技术在种子纯度鉴定上的应用越来越广泛，国际植物新品种保护联盟在BMT分子测试指南中，已将构建DNA指纹的标记方法确定为SSR和SNP，其中SSR标记因其技术比较成熟，稳定性重复性好，可操作性强，已成为当前各个作物进行分子标记鉴定的首选。

CTAB法提取植物DNA，已为广大科研工作者所熟知，是目前各试验室应用最广泛且最为成熟的DNA提取法，具有实用、稳定、价格低廉等特点。常规提取方法大多用1.5ml或2ml的离心管进行提取，获得基因组DNA较多，可以进行几十次至上百次左右试验。但通常情况下，杂交种纯度鉴定所用DNA只需要进行1次PCR的DNA量即可满足要求，常规方法浪费严重，效率低。

对杂交种进行分子标记纯度鉴定时，常常需要在短时间内提取大量样本的微量DNA进行PCR检测。提取效率高低、成本多少已经成为制约该技术应用的最大限制因素。

因此，寻找一种快速、高效、稳定、成本低廉能够满足SSR技术要求的作物基因组DNA提取方法成为当前亟待解决的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种快速、高效、稳定、成本低的适用于作物SSR分子标记分析的微量基因组DNA提取方法。

本发明提供的一种快速提取大量样品微量DNA的方法，包括如下步骤：

1）取深孔板1个，每孔加1-1.5克石英砂，再加入1个直径3mm 的小钢珠球，将幼叶或根尖放入深孔板的每个孔中，利用排枪向每孔中加入CTAB提取液100ul，盖上板盖，利用研磨机进行研磨，每秒25-30次，研磨2-3分钟；

2）将深孔板放入65℃水浴10 min，水浴后1500 r/min 离心1 min，然后加入100ul的氯仿和异戊醇混合液，混合液的两者体积比为24：1，盖上板盖，轻轻混匀；

3）4000 r/min离心10 min，取上清液30ul，转移至新的普通PCR板中，加入20ul在 -20℃下预冷的异丙醇，盖上PCR板板盖；

4）4000 r/min离心10 min，快速翻转PCR板，倾倒试管中的全部液体，将试管板在多层干燥的吸水纸上不同的位置吸湿2-3 次，以吸去多余的液体；晾干后，加入30ul的TE溶液。-4℃保存备用即可。

本发明快速提取大量样品微量DNA的方法在SSR标记鉴定作物杂交种纯度上的应用，其特征是：DNA所涉及作物为黄瓜、大白菜、西瓜。

本发明具有如下积极效果：

1、本发明所述的基因组DNA提取方法，所用试剂为常规CTAB方法涉及的试剂，为大家所熟知。所涉及仪器设备也为通用的，易于推广应用。

2、本发明在DNA提取过程中减少了药品用量，提取成本降低。

3、本发明DNA提取过程中，全部使用排枪（多孔道进样器），大大提高DNA提取效率。

4、本发明所获得DNA直接放于PCR板中，在进行PCR扩增试验时，可直接利用10ul排枪进行操作（省去分装DNA过程）,方便易行，提高效率。

附图说明

图1是提取西瓜根尖基因组DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果图片。

图2是提取大白菜叶片基因组DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果图片。

图3是提取黄瓜叶片基因组DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果图片。

图4是白菜SSR-PCR扩增后经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析图片。

图5是西瓜SSR-PCR扩增后经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析图片。

具体实施方式

1）取96孔深孔板1个，每孔加1-1.5克石英砂，再加入1个直径3mm 的小钢珠球，将黄瓜、大白菜或西瓜幼叶或根尖放入96孔深孔板的每个孔中，利用8道或12道排枪每孔中加入CTAB提取液100ul，盖上板盖。研磨仪研磨，每秒25-30次，研磨2-3分钟。

2）65℃水浴10 min，水浴后1500 r/min 离心1 min, 加入100ul氯仿和异戊醇（体积比24：1）的混合液，盖上板盖，轻轻混匀。

3）4000 r/min离心10 min，利用8道或12道排枪（多孔道进样器），取上清液30ul，转移至新的普通PCR板中，加入20ul在-20℃下预冷的异丙醇，盖上PCR板板盖。

4）4000 r/min离心10 min，倾倒试管中的全部液体，将试管板在多层干燥的吸水纸上不同的位置吸湿2-3 次，以吸去多余的液体。倒置晾干或65℃恒温干燥箱10 min后，加入30ul的TE溶液。-4℃保存备用。

DNA所涉及作物为西瓜、大白菜、黄瓜。

图1、图2、图3分别示出提取西瓜根尖、大白菜叶片、黄瓜叶片基因组DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果图片。

图4、图5分别示出白菜、西瓜SSR-PCR扩增后经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析图片。

本发明也可应用于在作物育种中分子标记辅助选择等领域。

Claims

1.一种快速提取大量样品微量DNA的方法，其特征是包括如下步骤：

1）取深孔板1个，每孔加1-1.5克石英砂，再加入1个直径3mm 的小钢珠球，将幼叶或根尖放入深孔板的每个孔中，利用排枪向每孔中加入CTAB提取液100ul，盖上板盖，进行研磨，每秒25-30次，研磨2-3分钟；

2）65℃水浴10 min，水浴后1500 r/min 离心1min，然后加入100ul的氯仿和异戊醇混合液，混合液的两者体积比24：1，盖上板盖，轻轻混匀；

3）4000 r/min离心10 min，取上清液30ul，转移至新的普通PCR板中，加入20ul在-20℃下预冷的异丙醇，盖上PCR板板盖；

4）4000 r/min离心10 min，快速翻转PCR板，倾倒试管中的全部液体，将试管板在多层干燥的吸水纸上不同的位置吸湿2-3 次，以吸去多余的液体；晾干后，加入30ul的TE溶液，-4℃保存备用即可。

2.一种如权利要求1所述快速提取大量样品微量DNA的方法在作物SSR杂交种纯度鉴定上的应用，其特征是：DNA所涉及作物为黄瓜、大白菜、西瓜。