CN111850151A

CN111850151A - 槟榔黄化植原体微滴式数字pcr检测试剂盒、方法及应用

Info

Publication number: CN111850151A
Application number: CN202010829454.5A
Authority: CN
Inventors: 于少帅; 覃伟权; 唐庆华; 宋薇薇; 赵蕊玲
Original assignee: Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-08-18
Also published as: CN111850151B

Abstract

本发明基于植原体tuf基因序列设计特异性引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，并采用建立的ddPCR技术对采自我国海南省不同地区槟榔黄化病样品及发病组织不同部位进行检测分析。引物Atf/Atr和探针AtProbe可特异性地在槟榔黄化病发病组织中检测到植原体信号，每个反应微滴生成数大于10000，绝对定量结果可信。基于建立的槟榔黄化植原体ddPCR技术检测分析表明：在海南定安、三亚、屯昌、文昌、万宁等不同市县槟榔黄化病样品中均检测到植原体，植原体浓度最低为0.07copies/μL，与LAMP检测技术相比灵敏灵提高约1000倍；本发明建立的ddPCR检测技术对于槟榔黄化植原体定量检测、病害流行监测、传播媒介昆虫和中间寄主筛选、槟榔种苗检疫及槟榔黄化病综合防治等研究具有较为重要的意义。

Description

槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒、方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种微滴式数字PCR检测试剂盒，具体涉及一种基于植原体tuf基因序列设计特异性引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，并采用建立的ddPCR技术对采自我国海南省不同地区槟榔黄化病样品及发病组织不同部位进行检测分析。

背景技术

植原体是一类寄生于植物韧皮部、尚不能分离纯化的原核致病菌(Doi et al,1967)。槟榔(Areca cathecu L.)是一种棕榈科常绿乔木，我国重要的南药资源之一，具有很高的药用价值和经济价值。

由植原体引起的槟榔黄化病是是我国海南槟榔生产上的一种毁灭性病害。我国槟榔黄化病已由发病初期的海南省屯昌县蔓延至海南省琼海、万宁、陵水、文昌、琼中、定安、乐东、保亭、三亚、五指山等10余个市县，在海南不同地区的槟榔产区均有不同程度的发生，且发病地区及面积仍在不断扩大，严重影响我国槟榔产业健康可持续发展(罗大全等,2001；车海彦等,2010a,2010b；周亚奎等,2010)。植原体病害是系统性侵染病害，尚无有效治疗药剂，其扩散传播途径包括自然状态下的刺吸式口器昆虫、菟丝子传播和人为状态下的种苗、嫁接传播，从源头上杜绝病原是防止此类病害流行的最常用也是最根本的方法。因此，高灵敏度的植原体检测方法的建立在植原体病害各方面的研究中都至关重要，特别是在病害监测、种苗检疫及综合防治方面占据着无法替代的地位并发挥着关键作用。

槟榔黄化病在中国、印度和斯里兰卡均有报告(罗大全等,2001；车海彦等,2010a,2010b；周亚奎等,2010；Ramaswamy et al,2013；Silva et al,2015)。引起槟榔黄化病的病原包括16SrI-B亚组(Muddumadiah et al.,2014；周亚奎等,2010)、16SrI-G(车海彦等,2010a)、16SrXI组(Ramaswamy et al,2013)、16SrXIV组(Silva et al,2015)等不同组或亚组植原体株系。基于不同组或亚组的植原体目前已建立了巢式PCR(罗大全等,2001；车海彦等,2011)、实时荧光PCR(车海彦等,2011；Nair et al.,2014)、LAMP检测技术(Nair et al,2016)等检测技术。针对海南槟榔黄化植原体快速、便捷检测方面，车海彦等基于海南16SrI组槟榔黄化植原体16SrRNA基因设计1对特异性引物和TaqMan-MGB探针组合，建立了海南16SrI组槟榔黄化植原体实时荧光PCR快速检测方法(车海彦等,2011)。Nair等(2014)基于印度16SrXI组槟榔黄化植原体16S rRNA基因建立起适合检测印度16SrXI组槟榔黄化植原体的SYBR green法实时荧光PCR技术。Nair等(2016)基于印度16SrXI组槟榔黄化植原体16SrRNA基因建立适合检测印度16SrXI组槟榔黄化植原体的LAMP检测体系。不同检测技术检测灵敏度差异较大，基于植原体16S rRNA基因序列构建重组质粒的灵敏度分析表明：巢式PCR检测扩增灵敏度能达到的DNA模板浓度的为3.17×10⁴copies/μL(任争光等,2015)；荧光定量PCR检测扩增灵敏度能达到的DNA模板浓度为3.17×10²copies/μL(任争光等,2015)；LAMP检测技术能达到的DNA模板浓度为5.3×10¹copies/μL(Yu et al,待发表数据)。

微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)采用一种全新的方式进行核酸分子的定性定量，即在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的荧光PCR反应体系“分割”成数万个纳升级的微滴，经PCR扩增后，对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，从而将荧光模拟信号数字化，因此该技术被称为“数字PCR”(www.bio-rad.com；Day et al,2013)。最终根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例，分析软件即可给出待检靶标分子的起始拷贝数浓度(www.bio-rad.com；Dayet al,2013)。与传统PCR、定量PCR相比，ddPCR检测结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。其定量的结果不再依赖于Cq值而直接给出靶标序列的起始拷贝数浓度，实现真正意义上的绝对定量(Day et al,2013)。槟榔黄化植原体在发病槟榔组织中含量较低，且浓度分布不均(罗大全等,2001；车海彦等,2010a,2010b；周亚奎等,2010)。因此，为了精确、灵敏地检测鉴定待检槟榔组织中植原体的有无及分布情况，建立槟榔黄化植原体高灵敏度检测技术势在必行。

发明内容

本发明的目的是提供了一种基于植原体tuf基因序列设计特异性引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，并采用建立的ddPCR技术对采自我国海南省不同地区槟榔黄化病样品及发病组织不同部位进行检测分析，检测灵敏较高，在海南定安、三亚、屯昌、文昌、万宁等不同市县槟榔黄化病样品中均检测到植原体，植原体浓度最低为0.07copies/μL，与LAMP检测技术相比灵敏灵提高约1000倍。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒，含有槟榔黄化植原体ddPCR检测特异性引物对和特异性探针，其中，引物Atf的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，引物Atr的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示，探针AtProbe的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

具体地，SEQ ID NO:1序列为5'AAATTTATACGAAACAAACCGCATTTA 3'；SEQ ID NO:2序列为5'ACGTGAGCATAGTGACGTTTTTC 3'；SEQ ID NO:3序列为5'AGCAGCTATTACCCAAGTTTTGTCTAC 3'。

进一步地，所述探针AtProbe的5’端由VIC修饰，3’端由BHQ1修饰。

进一步地，本发明检测到的槟榔黄化植原体最低浓度为0.07copies/μL。

本发明槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒在槟榔黄化植原体定量检测、病害流行监测、传播媒介昆虫和中间寄主筛选、槟榔种苗检疫及槟榔黄化病综合防治的应用。

本发明的另一目的在于提供一种槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测方法，其中，将总体积为24μL ddPCR反应体系放入微滴生成仪中生成微滴，将生成微滴后的反应体系放入梯度PCR仪中进行扩增，扩增结束后将PCR产物放入微滴读取仪中，通过软件读取数据，每份样品重复检测3次；ddPCR反应体系总体积为24μL，反应体系包括12μL ddPCR预混液NodUTP，900nM引物Atf/Atr 10μM，250nM探针AtProbe 10μM，DNA模板1μL，加ddH₂O补齐至24μL。

进一步地，ddPCR反应条件为95℃10min；94℃30sec，53℃60sec，共40个循环；98℃10min。

本发明每个反应微滴生成数大于10000。

本发明基于植原体tuf基因序列设计特异性引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，并采用建立的ddPCR技术对采自我国海南省不同地区槟榔黄化病样品及发病组织不同部位进行检测分析。引物Atf/Atr和探针AtProbe可特异性地在槟榔黄化病发病组织中检测到植原体信号，每个反应微滴生成数大于10000，绝对定量结果可信。基于建立的槟榔黄化植原体ddPCR技术检测分析表明：在海南定安、三亚、屯昌、文昌、万宁等不同市县槟榔黄化病样品中均检测到植原体，植原体浓度最低为0.07copies/μL，与LAMP检测技术相比灵敏灵提高约1000倍；本发明建立的ddPCR检测技术对于槟榔黄化植原体定量检测、病害流行监测、传播媒介昆虫和中间寄主筛选、槟榔种苗检疫及槟榔黄化病综合防治等研究具有较为重要的意义。通过建立的槟榔黄化植原体ddPCR检测技术从源头上切断槟榔黄化植原体的传播途径，有效的杜绝该类病原及其相关病害的传播扩散，为我国海南岛槟榔黄化病及其它植原体病害的流行监测和防控管理提供理论参考和技术支撑。

附图说明

图1为本发明通过引物Atf/Atr和探针AtProbe可在槟榔黄化病样品中检测到明显的槟榔黄化植原体信号。

图2为本发明通过引物Atf/Atr和探针AtProbe对槟榔黄化病样品进行植原体检测的绝对定量结果。

图3为本发明通过引物Atf/Atr和探针AtProbe对槟榔黄化病样品进行植原体检测的绝对定量结果的可信度(柱形图为仪器自动生成，由柱形图可知每个反应产生的微滴数均大于10000，结果可信)。

图4为本发明采用建立的槟榔黄化植原体ddPCR检测技术对采自海南不同地区槟榔黄化病样品进行植原体检测的绝对定量结果。

图5为本发明采用建立的槟榔黄化植原体ddPCR检测技术对采自海南不同地区槟榔黄化病样品进行植原体检测的绝对定量结果的可信度(柱形图为仪器自动生成，由柱形图可知每个反应产生的微滴数均大于10000，结果可信)。

图6为本发明采用建立的槟榔黄化植原体ddPCR检测技术对同一发病槟榔叶片中植原体浓度分布进行检测分析。

具体实施方式

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1供试样品

槟榔黄化病样品于2020年采自海南省定安、三亚、屯昌、文昌、万宁等5个县市共16份样品，健康对照样品于2020年采自海南省琼中、三亚、文昌等3个县市共3份样品。

1.1.2仪器

QX200型自动微滴式数字PCR仪(包括QX200automated droplet generator微滴生成仪、QX200droplet reader微滴读取仪)、PX1型热封仪、T100型梯度PCR仪购自美国BIO-RAD公司；Eppendorf公司5810R型台式冷冻离心机；杭州奥盛MSC-100型恒温混匀器；KZ-II型高速组织研磨仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司；DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂；G:BOX F3型核酸凝胶成像系统购自中国香港基因有限公司；NanoDrop2000超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技公司；HH-4型恒温水浴锅购自金坛科兴仪器厂产品。

1.1.3试剂

探针用ddPCR预混液(No dUTP)购自美国BIO-RAD公司；CTAB法植物基因组DNA快速提取试剂盒(DP305)、2×PCR Mix预混液购自北京天根生物科技有限公司，其它试剂为国产分析纯。引物合成和基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1 DNA提取

样品叶片取样量为0.1g，植原体总DNA提取方法参考天根植物基因组DNA提取试剂盒说明书方法。

1.2.2 PCR扩增

DNA样品通过P1/P7引物组(Deng&Hiruki,1991；Schneider et al,1995)进行扩增，P1/P7引物的扩增产物稀释50倍后作为第二轮PCR反应的模板，通过R16mF2/R16mR1引物组(Lee et al,1993)进行巢式PCR扩增，利用EB染色在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳检测。

1.2.3 ddPCR引物设计合成

根据全基础测序已完成的、与槟榔黄化植原体遗传关系较近的16SrI-B亚组洋葱黄化植原体OY-M株系的tuf基因序列(序列号：AP006628)，设计槟榔黄化植原体ddPCR检测引物对和探针，引物对Atf/Atr与探针AtProbe的序列信息如下所示：

Atf：5'AAATTTATACGAAACAAACCGCATTTA 3'；

Atr：5'ACGTGAGCATAGTGACGTTTTTC 3'；

AtProbe：5'AGCAGCTATTACCCAAGTTTTGTCTAC 3'；

探针AtProbe的5’端由VIC修饰，3’端由BHQ1修饰，引物与探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并经HPLC级别纯化。

1.2.4 ddPCR检测

将总体积为24μL ddPCR反应体系放入QX200微滴生成仪中生成微滴，将生成微滴后的反应体系放入T100型梯度PCR仪中进行扩增，扩增结束后将PCR产物放轻轻地平衡放入微滴读取仪中，通过QuantaSoft软件读取数据，每份样品重复检测3次。ddPCR反应体系总体积为24μL，反应体系包括12μL ddPCR预混液(No dUTP)，900nM引物Atf/Atr(10μM)，250nM探针AtProbe(10μM)，DNA模板1μL，加ddH₂O补齐至24μL。ddPCR反应条件为95℃10min；94℃30sec，53℃60sec，共40个循环；98℃10min。

1.2.5统计分析

本发明通过SPSS 13.0软件进行相关数据的平均值、标准差计算和单因素方差分析，显著性水平设置为0.05；柱形图通过SigmaPlot 12.0软件绘制。

2结果与分析

2.1槟榔黄化植原体ddPCR检测体系建立

基于槟榔黄化病样品AYL1、AYL2和AYL3及健康槟榔样品H1、H2和H3，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测体系。由结果可知：通过引物Atf/Atr和探针AtProbe可在槟榔黄化病样品中检测到明显的槟榔黄化植原体信号(图1)。如图1所示，A02、B02、C02代表的槟榔黄化病样品AYL1、AYL2和AYL3阳性微滴与阴性微滴分离明显，有明显的阳性结果；D02、E02、F02代表的健康槟榔样品H1、H2和H3无阳性结果；G02为DNA提取过程洗脱DNA用的TE缓冲液，H02为ddPCR反应体系中加入的ddH₂O，TE缓冲液和ddH₂O对照中均无阳性结果。绝对定量结果显示样品AYL1、AYL2和AYL3的植原体tuf基因拷贝数浓度分别为6.9、6.0、6.0copies/μL(图2)。由图3可知：每个反应的微滴生成数均超过10000。因此，基于tuf基因设计的引物Atf/Atr和探针AtProbe对槟榔黄化植原体的定量结果可信，建立的槟榔黄化植原体ddPCR检测体系检测效果较好。

2.2不同地区槟榔黄化植原体ddPCR检测

采用建立的槟榔黄化植原体ddPCR检测技术对采自海南不同地区槟榔黄化病样品进行植原体检测，ddPCR检测技术在采自不同地区的槟榔黄化病样品中均可检测到槟榔黄化植原体(图4)，检测结果可信(图5)。如图4所示，屯昌槟榔黄化病样品AYL4、AYL5的植原体浓度分别为0.12、0.22copies/μL；采自文昌的样品AYL6、AYL7、AYL8的植原体浓度分别为0.07、0.07、0.16copies/μL；万宁样品AYL9、AYL10的植原体浓度分别为0.23、0.09copies/μL；ck为ddH2O对照，无植原体检测信号。在检测到植原体的不同槟榔黄化病样品中，植原体含量最低可达到0.07copies/μL。

2.3同一槟榔叶片中植原体浓度分布

在海南省定安县槟榔黄化病病株的一片复叶上取6份样品(DA1-1、DA1-2、DA1-3、DA1-4、DA1-5、DA1-6)，提取DNA用于ddPCR检测。检测结果表明：槟榔黄化病病株同一复叶中，不同DNA提取液中槟榔黄化植原体浓度差异极其显著(P＝0.00<0.05)，如图6所示。在同一叶片上提取的6份DNA样品，槟榔黄化植原体浓度最高为9.63±3.34copies/μL，最低为0.08±0.01copies/μL。同一叶片上植原体最高浓度与最低浓度相比，差异高达120倍。由此可见，槟榔黄化植原体在发病槟榔同一组织不同部位中浓度分布十分不均，在同一发病槟榔叶片的不同部位浓度差异极其显著(P<0.05)。

3结论

本发明基于16SrI-B亚组植原体tuf基因序列，设计了针对槟榔黄化植原体的引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立了槟榔黄化植原体ddPCR检测技术。研究结果表明：建立的ddPCR检测技术对槟榔黄化植原体绝对定量结果可信，检测效果良好。采用建立的槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，在海南省定安、三亚、屯昌、文昌、万宁等不同地区槟榔黄化病样品中均检测到植原体，检测到的槟榔黄化植原体最低浓度可达0.07copies/μL，即7.0×10^- ²copies/μL。ddPCR检测技术与LAMP、荧光定量PCR和巢式PCR等检测技术相比，检测灵敏度最好，比LAMP检测技术灵敏度提高了约1000倍。

此外，基于ddPCR检测技术分析表明：槟榔黄化植原体在槟榔黄化病病株的同一叶片上浓度分布十分不均，浓度差异极其显著(P＝0.00<0.05)。ddPCR检测技术灵敏度相对较高，本发明建立的槟榔黄化植原体ddPCR检测技术在植原体病害监测、槟榔种苗检疫及槟榔黄化病综合防治等方面应用前景较为广泛，对于槟榔黄化病病原的定量检测、病害的流行监测及其传播媒昆虫介、中间寄主的筛选鉴定等研究具有较为重要的意义。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

序列表

<110>中国热带农业科学院椰子研究所

<120>槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒、方法及应用

<130> 2020

<160> 3

<210> 1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 1

5' AAATTTATACGAAACAAACCGCATTTA 3'

<210> 2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 2

5' ACGTGAGCATAGTGACGTTTTTC 3'

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 3

5' AGCAGCTATTACCCAAGTTTTGTCTAC 3'

Claims

1.一种槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于：含有槟榔黄化植原体ddPCR检测特异性引物对和特异性探针，其中，引物Atf的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示，引物Atr的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，探针AtProbe的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述探针AtProbe的5’端由VIC修饰，3’端由BHQ1修饰。

3.根据权利要求1所述的槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于：检测到的槟榔黄化植原体最低浓度为0.07copies/μL。

4.权利要求1所述的槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒在槟榔黄化植原体定量检测、病害流行监测、传播媒介昆虫和中间寄主筛选、槟榔种苗检疫及槟榔黄化病综合防治的应用。

5.一种槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测方法，其特征在于：将总体积为24μL ddPCR反应体系放入微滴生成仪中生成微滴，将生成微滴后的反应体系放入梯度PCR仪中进行扩增，扩增结束后将PCR产物放入微滴读取仪中，通过软件读取数据，每份样品重复检测3次；ddPCR反应体系总体积为24μL，反应体系包括12μL ddPCR预混液No dUTP，900nM引物Atf/Atr 10μM，250nM探针AtProbe 10μM，DNA模板1μL，加ddH₂O补齐至24μL。

6.根据权利要求5所述的槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测方法，其特征在于：ddPCR反应条件为95℃10min；94℃30sec，53℃60sec，共40个循环；98℃10min。

7.根据权利要求5所述的槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测方法，其特征在于：每个反应微滴生成数大于10000。