CN114854895A - 一种与油菜锌含量性状QTL紧密连锁的分子标记BnZn-3A1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，公开了一种与油菜锌含量性状QTL紧密连锁的分子标记BnZn‑3A1及其应用。本发明获得了一个与油菜锌含量显著关联的SNP(单核苷酸多态性)标记，位于Darmor‑bzh v10基因组A03染色体上第9886351位碱基位置，可解释5.3%的表型变异。通过该分子标记进行辅助选择，可以提高含较高锌元素油菜单株的筛选效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与油菜锌含量性状QTL紧密连锁的分子标记BnZn-3A1及其应用。
背景技术
锌作为人体含量第二高的微量元素，与许多功能蛋白及生物膜的正常结构与功能行使密切相关，锌元素缺乏会对机体的生长发育、生殖、免疫等过程造成严重影响。
甘蓝型油菜是由甘蓝和白菜经自然种间杂交和加倍进化而来，其菜用属性在起源和进化上具备科学基础。随着双低油菜品种的广泛推广，油菜的菜苗及菜薹作为可口蔬菜正逐渐被广大消费者认可。研究表明，油菜是锌元素的良好植物转化载体，培育锌元素高效利用的油菜新品种是改善人体矿质营养素缺乏和推动油菜全价值链开发利用的一种重要技术手段。
应用传统育种技术进行锌等微量元素的作物育种改良难度较大，存在选择效率低、育种周期长等缺陷。随着分子生物学和测序技术的快速发展，通过基因型选择辅助的育种手段经实践证明是解决传统育种困境的有效途径，而性状紧密连锁的分子标记开发是该技术应用的重要前提。利用分子标记辅助选择检测油菜中与锌含量积累紧密关联的分子标记，可降低繁琐的表型鉴定工作规模，指导性状的精准导入或聚合，将极大提高育种效率。
本发明以油菜核心种质资源群体为材料，利用全基因组关联分析鉴定油菜中具有育种应用潜力的锌含量相关QTL位点，并基于QTL位点信息开发分子标记，对加速富锌油菜新品种选育和提升油菜生产效益有积极作用。
发明内容
本发明的目的是在于提供了检测甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第A03染色体上第9886351位碱基的试剂在甘蓝型油菜锌含量筛选育种中的应用。通过对甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第A03染色体上第9886351位碱基进行基因型的检测，即可实现对油菜锌元素富集能力的筛选育种。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
与甘蓝型油菜锌含量性状QTL位点qBnZn-3A1的获得：
(1)收集327份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50K Illumina SNP芯片对每个样本进行基因型分析。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜Darmor基因组(Chalhoub et al.,2014)中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得21,243个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。
(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入STRUCTURE v.2.3.4进行群体结构分析，将327份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用SPAGeDi软件计算327份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(4)利用油菜水培培养体系(含0.22mg/L锌元素)，将327份材料种植于水培温室；培养至五叶期后，采集菜苗样品进行锌含量测定。设置3次生物学重复，每个样本取5株材料均匀粉碎，通过火焰原子吸收法测定样品中锌含量。
(5)结合基因型数据、群体结构和油菜苗期锌含量数据，利用TASSEL 5.0软件(Bradbury et al.,2007)进行关联分析，在A03染色体上检测到与油菜锌含量显著关联的SNP标记Bn-A03_9886351，最高可解释5.3％的表型变异，该SNP变异位点(由G到A的变异)位于甘蓝型油菜Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)基因组A03染色体的第9886351位碱基处，该SNP位点紧密连锁的锌含量性状QTL位点被命名为qBnZn-3A1。
检测甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组A03染色体上第9886351位碱基的试剂在油菜锌富集能力筛选育种中的应用，属于本发明的保护范围。
检测包含有甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组A03染色体上第9886351位碱基的油菜序列的试剂在油菜锌富集能力筛选育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
以上所述应用中，优选的，所述的油菜序列为SEQ ID NO.2所示。
针对甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组A03染色体上第9886351位碱基设计的引物在油菜锌富集能力筛选育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
以上所述的应用中，申请人根据上述SNP位点，开发了其正义链的KASP标记BnZn-3A1，根据该标记设计的引物为：
qBnZn-3A1低锌含量等位基因型特异引物BnZn-3A1-F1：GTGGGGCCAACTAATCTGTGA
qBnZn-3A1高锌含量等位基因型特异引物BnZn-3A1-F2：TGGGGCCAACTAATCTGTGG
反向引物BnZn-3A1-R：CCACCGGAGATTTATATGATCGT。
上述引物，需根据KASP标记开发的原则，在使用前需加上KASP标记的通用接头。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次获得了与油菜锌含量显著关联的主效QTL位点qBnZn-3A1，最高可解释5.3％的表型变异，可有效应用于油菜锌含量性状的遗传改良。
(2)首次研究发现了与油菜锌含量显著关联的分子标记BnZn-3A1，为油菜锌含量性状的预先选择提供了可靠的分子标记来源。
(3)利用分子标记BnZn-3A1可在油菜幼苗生长期快捷地对油菜品种或品系中qBnZn-3A1的优异等位变异进行选择，能够极大减轻育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快富含锌元素油菜的育种进程。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。在本发明中，如未特殊说明，所述甘蓝型油菜基因组均以Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)为参照。本发明的甘蓝型油菜参考：Whole-Genome Resequencing of a Worldwide Collection of Rapeseed AccessionsReveals the Genetic Basis of Ecotype Divergence。
实施例1：
油菜锌含量性状主效QTL位点qBnZn-3A1的获得：
(1)收集327份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50K Illumina SNP芯片对每个样本进行基因型分析。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜Darmor基因组(Chalhoub et al.,2014)中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得21,243个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。
(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入STRUCTURE v.2.3.4进行群体结构分析，将327份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用SPAGeDi软件计算327份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(4)利用油菜水培培养体系(含0.22mg/L锌元素)，将327份材料种植于水培温室；培养至五叶期后，采集菜苗样品进行锌含量测定。设置3次生物学重复，每个样本取5株材料均匀粉碎，通过火焰原子吸收法测定样品中锌含量。
(5)结合基因型数据、群体结构和油菜苗期锌含量数据，利用TASSEL 5.0软件(Bradbury et al.,2007)进行关联分析，在A03染色体上检测到与油菜锌含量显著关联的SNP标记Bn-A03_9886351，最高可解释5.3％的表型变异，该SNP变异位点(由G到A的变异)位于甘蓝型油菜Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)基因组A03染色体的第9886351位碱基处，该SNP位点紧密连锁的锌含量主效QTL位点被命名为qBnZn-3A1。
实施例2：
一种与油菜锌含量性状QTL位点qBnZn-3A1紧密连锁的分子标记引物的获得：
(1)提取甘蓝型油菜A03染色体第9886351位碱基上下游各100bp的序列，按照KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)分子标记引物设计原则，针对其正义链，开发KASP分子标记BnZn-3A1，该标记包括两条竞争性正向引物BnZn-3A1-F1和BnZn-3A1-F2，分别对应上述SNP变异位点的序列碱基A和G，以及一条反向通用引物BnZn-3A1-R，引物序列如下：
BnZn-3A1-F1：gtggggccaactaatctgtga
BnZn-3A1-F2：tggggccaactaatctgtgg
BnZn-3A1-R：ccaccggagatttatatgatcgt
上述引物，需根据KASP标记开发的原则，在使用前需加上KASP标记的通用接头。
其中BnZn-3A1-F1前所加接头序列为gaaggtgaccaagttcatgct，BnZn-3A1-F2前所加接头序列为gaaggtcggagtcaacggatt。
在甘蓝型油菜Westar中扩增的序列为A基因型(即AA基因型)，序列如下所示：gtggggccaactaatctgtgaaatctcggcgtgacgatcatataaatctccggtgg(SEQ ID NO.1所示)。
在甘蓝型油菜Olga中扩增的序列为B基因型(即GG基因型)，序列如下所示：tggggccaactaatctgtggaatctcggcgtgacgatcatataaatctccggtgg(SEQ ID NO.2所示)。
(2)对标记采用竞争性等位基因特异性PCR技术在油菜关联群体中进行基因型分型，扩增使用试剂盒为五引物扩增受阻突变体系(PAMS)，按照PAMS pro SNP GentypingPCR mix试剂盒说明，设计10uL反应体系：2×PARMS master mix 5μL，Allele X primer(10μM)0.15μL，Allele Y primer(10μM)0.15μL，Common R primer(10μM)0.4μL，油菜基因组DNA 10-100ng。扩增程序为：94℃ 15min；94℃ 20s，65-57℃(Touch-down)1min，循环10次；94℃ 20s，57℃ 1min，循环30次；采集1次荧光信号并输出基因型结果。再利用Tassel软件进行关联分析，明确BnZn-3A1与油菜锌含量性状QTL位点qBnZn-3A1显著关联。
利用上述方法，明确BnZn-3A1标记与油菜锌含量性状主效QTL位点qBnZn-3A1显著关联。
实施例3：
基于油菜A03染色体第9886351位碱基设计的引物在油菜锌含量性状筛选育种中的应用，其步骤如下：
(1)挑选出327份材料中经过多代自交已纯合的锌含量较高和较低的材料各25份，应用含0.22mg/L锌元素的油菜水培营养体系培养至五叶期，利用火焰原子吸收法测定菜苗中锌含量。
(2)检查分子标记BnZn-3A1的两种基因型在上述锌含量较高和锌含量较低的材料中分布情况。结果表明，分子标记BnZn-3A1的基因型在25份锌含量较高的材料中11份为A，14份为B，而在25份锌含量较低的材料中17份为A，8份为B(表1)。
(3)T测验结果表明分子标记BnZn-3A1检测出的A和B两类基因型在油菜苗锌含量上存在极显著差异(P<0.01)。
以上的结果足以说明我们制备的分子标记BnZn-3A1与油菜苗中锌含量是高度关联的，因而可用于油菜锌高效性状的分子标记辅助选择。
表1：分子标记BnZn-3A1在油菜菜苗锌含量极端材料中的基因型
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种与油菜锌含量性状QTL紧密连锁的分子标记BnZn-3A1及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtggggccaa ctaatctgtg aaatctcggc gtgacgatca tataaatctc cggtgg 56
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggggccaac taatctgtgg aatctcggcg tgacgatcat ataaatctcc ggtgg 55
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggggccaa ctaatctgtg a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggggccaac taatctgtgg 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaccggaga tttatatgat cgt 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
Claims (4)
1.检测甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组A03染色体上第9886351位碱基的试剂在甘蓝型油菜锌含量筛选育种中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的试剂为引物。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的引物为BnZn-3A1-F1:GTGGGGCCAACTAATCTGTGA，BnZn-3A1-F2:TGGGGCCAACTAATCTGTGG，BnZn-3A1-R：CCACCGGAGATTTATATGATCGT。
4.检测包含有甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组A03染色体上第9886351位碱基的油菜序列的试剂在油菜锌含量筛选育种中的应用，所述的序列为SEQ ID NO. 2所示。
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