CN104673904A

CN104673904A - 甘蔗鞭黑粉菌SCoT-PCR特异性引物筛选及应用

Info

Publication number: CN104673904A
Application number: CN201510071587.XA
Authority: CN
Inventors: 沈万宽; 徐刚红; 罗明珠; 陈双; 吴夏明
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104673904B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了甘蔗鞭黑粉菌SCoT-PCR特异性引物筛选及应用；所述引物序列如SEQ ID NO：1～10所述。将该引物10条引物对来自不同地域和寄主的10个甘蔗鞭黑粉菌交配型菌株进行扩增，共扩增86条带，平均每条扩增8.6条带，多态性比率为59.3%。所筛选出来的特异性引物具有较高的多态性检测效率，能够进行甘蔗鞭黑粉菌的遗传多样性分析；对以后甘蔗抗病品种的选育提供理论指导。

Description

甘蔗鞭黑粉菌SCoT-PCR特异性引物筛选及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，公开了甘蔗鞭黑粉菌SCoT-PCR特异性引物筛选及应用。

背景技术

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是世界上最重要的糖料作物及较有发展潜力的可再生生物质能源作物。由甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起的甘蔗黑穗病是一种世界性重要甘蔗病害，目前我国甘蔗主栽品种均普遍感染黑穗病，且田间发病率较高，经济损失十分严重。抗病育种是防治甘蔗黑穗病最有效最经济的方法，但至今我国蔗区甘蔗鞭黑粉菌生理小种不清楚，甘蔗抗黑穗病育种存在较大的盲目性，抗黑穗病育种效果不明显。基于病原菌遗传分化研究，有利于揭示病原菌的生理分化或生理小种分化。AFLP、ISSR、SSR、RAPD、SRAP等分子标记已先后应用于甘蔗鞭黑粉菌的遗传多样性研究，但它们都是传统意义上的随机DNA分子标记，或是扩增非编码区域，或随机在基因组中扩增，难以真实反映甘蔗鞭黑粉菌在致病力等重要功能性状上的遗传分化。

目标起始密码子多态性（start codon targeted polymorphism，SCoT）分子标记是一种新型的、基于翻译起始位点的目的基因标记技术，其根据ATG翻译起始位点侧翼保守序列来设计单引物，扩增产生偏向候选功能基因区显性多态性标记。SCoT标记结合了RAPD标记和ISSR标记的优点，可获得丰富的遗传信息，并能有效地产生与性状相关联的分子标记。该标记技术已被应用于水稻、花生、龙眼、葡萄、甘蔗、白灵菇、金针菇等植物和少数食用菌种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、重要性状基因标记、基因差异表达和遗传多样性分析等研究。但SCoT分子标记应用于甘蔗鞭黑粉菌，甚至植物病原真菌至今尚未见报道。建立稳定、可重复、高效的反应体系，筛选出多态性丰富的引物是SCoT标记应用于甘蔗鞭黑粉菌的基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有对于甘蔗黑穗病遗传分化研究技术的缺陷，提供一种针对于甘蔗鞭黑粉菌的SCoT-PCR特异性引物。

本发明的第二个目的是提供上述特异性引物的应用。

本发明的第三个目的是提供一种分析甘蔗鞭黑粉菌遗传多样性的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

甘蔗鞭黑粉菌SCoT-PCR特异性引物，所述引物序列如SEQ ID NO：1～10所述。

SCoT 标记作为一种基于 PCR 技术的新型分子标记，具有操作简单、成本低廉、引物设计简单且具有通用性、多态性高、能有效产生和性状连锁的标记等诸多优点。建立稳定的 SCoT-PCR 反应体系和反应程序后，便可对大量样品进行标记分析。但PCR反应受诸多因素的影响，因此确定合适的反应参数是成功应用 SCoT-PCR 标记技术的前提。

PCR 反应体系优化的方法很多，一般采用单因素试验和正交试验。单因素试验能对每项因素逐项优化，操作简单，能设计较广的浓度范围和较多的梯度，不同因素水平扩增效果对比鲜明，能从中轻易选出该因素的最佳用量或合适的用量范围，但单因素试验不能考察 PCR 体系中各组分的交互作用，也不能保证各组分最佳浓度的组合就是最佳反应体系。正交试验设计具有均衡分散、整齐可比、效应明确的特性，可综合考察反应体系中各因素及其交互作用，较快地找到最优的水平组合，但正交试验设计的浓度梯度范围较小，容易偏离适合 PCR 反应的浓度范围。本研究在单因素试验建立甘蔗鞭黑粉菌 SCoT-PCR 反应体系中各因素的适宜浓度范围的基础上，再设计正交试验以快速确立最适 SCoT-PCR 反应体系。

因此，本研究综合应用单因素试验和正交试验，建立适宜的甘蔗鞭黑粉菌SCoT标记体系，并应用该体系筛选多态性引物及进行少量菌株遗传多样性研究，以期为SCoT标记技术应用于大量甘蔗鞭黑粉菌遗传多样性分析提供基础。

本发明所述SCoT-PCR特异性引物的反应体系总体积为25μL，其中10×Buffer 2.5μL；DNA模板用量为12.5～125 ng；dNTPs浓度为0.14～0.23mmol/L；引物浓度为0.28～0.46μmol/L；rTaq DNA 聚合酶用量为0.70～1.15U；Mg²⁺ 浓度为1.4～2.3mmol/L。

优选地，所述反应体系总体积为25μL，其中10×Buffer 2.5μL、DNA模板12.5 ng、dNTPs 0.17 mmol/L、引物0.46 μmol/L、Mg²⁺ 1.7mmol/L、rTaq DNA 聚合酶0.85U。

对 SCoT-PCR 反应体系中的5个不同影响因素进行梯度试验，结果表明，在一定范围内 DNA 模板、引物、dNTPs 的用量对扩增效果的影响较小，而 Mg²⁺ 和 rTaq DNA 酶的用量对扩增效果的影响较为显著，因此，当特定物种进行 SCoT 标记时，应对其反应体系进行优化，从而保证反应体系的稳定性和可靠性。

现有技术中存在一些SCoT的通用引物，而这些引物并非针对甘蔗鞭黑粉菌的特异性引物，本发明在现有技术的基础上针对甘蔗鞭黑粉菌设计了一些引物，但这些引物不一定都能用于SCoT-PCR，因此，发明人在优化出针对甘蔗鞭黑粉菌的SCoT-PCR反应体系的基础上，筛选出了10条条带清晰，多态性丰富，重复性好的SCoT特异性引物；10条引物对来自不同地域和寄主的10个甘蔗鞭黑粉菌交配型菌株进行扩增，均能获得清晰稳定，多态性丰富的扩增结果。

甘蔗鞭黑粉菌基因组相较于龙眼、甘蔗等植物基因组小得多，功能性状基因相对较少，导致扩增条带少，多态性比率低；本发明所筛选出的特异性引物可用于甘蔗鞭黑粉菌遗传多样性分析。

本发明利用筛选到的特异性引物对供试的10份地理来源和寄主来源不同的甘蔗鞭黑粉菌交配型菌株基因组DNA进行SCoT标记研究，10条引物共扩增86条带，平均每条扩增8.6条带，多态性比率为59.3%；所筛选出来的特异性引物具有较高的多态性检测效率，能够进行甘蔗鞭黑粉菌的遗传多样性分析。

基于SCoT特异性引物的UPGMA 聚类分析初步表明聚类结果与菌株地理来源有一定的相关性，这与应用 ISSR 和 RAPD 分子标记技术对中国华南蔗区35个甘蔗鞭黑粉菌交配型分离物进行遗传多样性研究的结果基本一致，也与应用 RAPD 和 SRAP 分子标记技术对采自中国福建、云南、广东、广西、海南、江西6 省甘蔗品种上的23个甘蔗鞭黑粉菌双核菌丝分离物进行遗传多样性研究的结果基本一致。

本发明还提供所述特异性引物在抗黑穗病甘蔗品种选育中的应用。

本发明还提供一种分析甘蔗鞭黑粉菌遗传多样性的方法，所述方法为：提取供试甘蔗鞭黑粉菌的基因组DNA，应用SEQ ID NO：1～10所示的10条特异性引物，分别对供试甘蔗鞭黑粉菌的基因组DNA进行SCoT-PCR，根据10条引物扩增出的基因组DNA多态性条带，用相关软件对供试甘蔗鞭黑粉菌进行UPGMA聚类分析。

这里多态性条带是指：一条引物用于扩增10个菌株，若每个菌株在相同的位置有相同大小的条带，则这条带就不是多态性条带，反之，只要有一个菌株在该位置没有条带，则这条带就是多态性条带。

优选地，所述UPGMA聚类分析具体过程为：对SCoT扩增产物的电泳结果进行人工比对、校正，有条带记为1，无条带记为0，形成0、1矩阵。利用POPGENE 1.32软件计算有效等位基因数（Ne）、Nei's基因多样性指数（H）、Shannon's信息指数（I）；利用NTSYS-pc 2.1软件，进行相似性分析形成相似系数矩阵，按UPGMA方法进行聚类分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过优化的SCoT-PCR 反应体系筛选出了针对甘蔗鞭黑粉菌的特异性引物，将该引物10条引物对来自不同地域和寄主的10个甘蔗鞭黑粉菌交配型菌株进行扩增，共扩增86条带，平均每条扩增8.6条带，多态性比率为59.3%。所筛选出来的特异性引物具有较高的多态性检测效率，能够进行甘蔗鞭黑粉菌的遗传多样性分析；对以后甘蔗抗病品种的选育提供理论指导。

附图说明

图1为模板浓度对SCoT-PCR反应的影响；其中，M：DL 2000 marker； 1～7：6.25ng，12.5ng，25ng，50ng，75ng，100ng，125ng；1'～7' 是1～7的重复试验。

图2为dNTPs浓度对SCoT-PCR反应的影响；其中，M：DL 2000 marker；1～7：0.11 mmol/L，0.14 mmol/L，0.17 mmol/L，0.20 mmol/L，0.23 mmol/L，0.26 mmol/L，0.29 mmol/L；1'～7' 是1～7的重复试验。

图3为引物浓度对SCoT-PCR反应的影响；其中，M：DL 2000 marker；1～7：0.16μmol/L，0.22μmol/L，0.28μmol/L，0.34μmol/L，0.40μmol/L，0.46μmol/L，0.52μmol/L；1'～7' 是1～7的重复试验。

图4为 rTaq DNA 聚合酶用量对SCoT-PCR反应的影响；其中，M：DL 2000 marker；1～7：0.55U，0.70U，0.85U，1.00U，1.15U，1.30U，1.45U；1'～7' 是1～7的重复试验。

图5为Mg²⁺浓度对SCoT-PCR反应的影响；其中， M：DL 2000 marker；1～7：1.1 mmol/L，1.4 mmol/L，1.7 mmol/L，2.0 mmol/L，2.3 mmol/L，2.6 mmol/L，2.9 mmol/L；1'～7' 是1～7的重复试验。

图6为SCoT-PCR反应体系正交试验优化结果；其中，M：DL 2000 marker；处理组合1～16；1'～16' 是1～16的重复试验。

图7为部分引物对10个菌株的SCoT-PCR扩增；其中，M：DL 2000 marker；泳道1～10：1～10号菌株 A：引物Ss-SCoT2 ；B：引物Ss-SCoT10 ；C：引物Ss-SCoT12。

图8为10个菌株SCoT标记UPGMA聚类分析图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 SCoT-PCR反应体系的优化

（一）供试材料

1、供试菌株

2、供试引物

本发明共设计30条引物，委托上海生工生物工程有限公司合成。

（二）实验方法

1、DNA的提取、扩增程序及产物检测

甘蔗鞭黑粉菌交配型菌株基因组DNA的提取采用CTAB法，具体参考“甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系的优化”，对所提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳初步检测其质量，再用紫外分光光度计测定DNA样品的浓度和纯度，并将DNA稀释至50ng/μL，-20℃保存备用。PCR扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性45s，50℃退火50s，72℃延伸2 min，循环35次；72℃延伸8min。扩增反应结束后，取8μL扩增产物于2.0%琼脂糖凝胶（含Gold view染液）中进行电泳，电泳结束后在凝胶成像系统上采集图像。

2、单因素试验

选用10号菌株基因组DNA为模板，引物Ss-SCoT12，在预备试验体系，即总体积25 μL中10×Buffer（Mg²⁺ free）2.5μL、dNTPs 0.2mmol/L、Mg²⁺ 2.0 mmol/L、引物0.2 μmol/L、rTaq DNA聚合酶1U、模板25ng的基础上，针对影响SCoT-PCR反应体系的5个主要因素设置5因素7水平的单因素试验，每个因素重复2次。具体的因素和水平见表3。

3、正交试验

在单因素试验筛选出的合适因素水平的基础上，以10号菌株基因组DNA为模板，引物Ss-SCoT12，进行5因素、4水平的正交优化试验（L₁₆ (4⁵)），处理组合见表4，每个组合重复2次。

（三）实验结果

1、单因素实验结果

模板DNA浓度对SCoT-PCR反应的影响：由图1可见，当模板用量6.25 ng时，电泳条带较暗，缺带；模板用量在12.5～125ng时，都能扩增出清晰可辨、完整一致的条带，说明模板浓度对SCoT-PCR反应影响不大。因此，在25 μL体系中，模板浓度在12.5～125ng均可行。考虑成本和扩增效果，本试验选择12.5ng～75ng作为后续正交试验的模板浓度梯度范围。

dNTPs浓度对SCoT-PCR反应的影响：由图2可见，当dNTPs用量在0.11～0.14 mmol/L时，扩增条带模糊，且有缺失，重复性不好；在0.23～0.29 mmol/L时，条带数量多，但略有弥散且有条带缺失；用量在0.17～0.20 mmol/L时，条带丰富、清晰、且重复性好。因此，dNTPs用量以0.17 mmol/L最佳，本研究选择0.14～0.23 mmol/L作为后续正交试验的dNTPs浓度梯度范围。

引物浓度对SCoT-PCR反应的影响：由图3可见，引物浓度对SCoT-PCR反应有较明显的影响。引物浓度在0.16～0.22μmol/L时，扩增条带模糊、量少。在0.28～0.52 μmol/L之间都能扩增到清晰的条带，dNTPs浓度在0.34μmol/L时扩增效果最佳。本研究选择0.28～0.46 μmol/L作为后续正交试验的引物浓度梯度范围。

rTaq DNA聚合酶用量对SCoT-PCR反应的影响：由图4可见，rTaq DNA聚合酶用量为0.55U和0.70U时扩增条带有缺失且产量少，用量1.15U～1.45U时非特异性增强，电泳条带模糊，分离界限不清。用量在0.85U和1.00U时均能扩增出清晰完整条带，差异不大，但1.00U时效果更佳。本研究选择0.70U、0.85U、1.00U、1.15U作为后续正交试验中 rTaq DNA聚合酶的梯度范围。

Mg²⁺浓度对 SCoT-PCR 反应的影响：由图5可见，当 Mg²⁺用量为1.1 mmol/L时扩增条带缺失，用量为1.4 mmol/L时，条带完整但是条带暗，产量少；Mg²⁺浓度在1.7～2.9mmol/L时能扩增产量丰富的条带，但在2.6～2.9 mmol/L扩增出现非特异性条带，背景噪音增大，1.7 mmol/L是最佳。本研究选择1.4～2.3 mmol/L作为后续正交试验中Mg²⁺浓度的梯度范围。

2、SCoT-PCR 正交试验结果

以单因素试验确定的各因素浓度梯度范围进行L₁₆（4⁵）正交试验。在PCR产物上样量相同的前提下，由图6可见，各因素不同浓度组合形成的反应体系扩增结果存在明显差异。其中组合1几乎无扩增条带，组合5、6、16扩增条带严重缺失，组合2、3、9、11、12、13、14、15也出现不同程度的缺带现象且条带模糊。组合4、7、8、10都能扩增出稳定的9条带，并且2次重复试验结果一致，但是组合4扩增产物背景噪音较大，条带清晰度相对较差。组合7，10相对于组合8扩增产物量少，电泳条带稍暗些，组合8重复性更好。因此，试验结果确定正交试验的最优体系是组合8，即25μL体系中，10×Buffer（Mg²⁺ free）2.5μL、DNA模板12.5 ng、dNTPs 0.17 mmol/L、引物0.46 μmol/L、 Mg²⁺ 1.7mmol/L、rTaq DNA 聚合酶0.85U。

实施例2 SCoT-PCR优化体系的验证及引物筛选

根据实施例1优化试验所得反应体系，以引物Ss-SCoT2、Ss-SCoT10、Ss-SCoT12对供试的10个菌株进行扩增，以验证该反应体系的稳定性和可靠性。由图7可见，不同菌株扩增条带均清晰可辨，主带稳定，多态性丰富，表明该体系可用于甘蔗鞭黑粉菌SCoT-PCR扩增反应。

应用该体系，以10号菌株DNA为模板，从参试的30条引物中筛选出能产生清晰扩增产物，多态性丰富的10条引物，即：Ss-SCoT2、Ss-SCoT10、Ss-SCoT12、Ss-SCoT13、Ss-SCoT14、Ss-SCoT15、Ss-SCoT19、Ss-SCoT20、Ss-SCoT28、Ss-SCoT29。各引物的多态性统计结果见表5，10条引物共扩增出86条带，其中多态性带51条，多态性比率59.3%，每条引物扩增条带数5～14条，扩增产物的片段大小主要集中500～2500bp，多态性比率在50%～85.71%之间，引物Ss-SCoT14的多态性比率最高；各引物有效等位基因数（Ne）的变化范围为1.23～1.64，平均值1.38，Ne值最高的引物是Ss-SCoT19；各引物的Nei's 基因多样性指数（H）的变化范围为0.16～0.33，平均值为0.22，最高的引物为Ss-SCoT19；Shannon's信息指数（I）变化范围为0.26 ～0.46，平均值为0.33，最高的引物为Ss-SCoT19。可见，所筛选的10条SCoT引物具有较高的多态性检测效率，能够进行甘蔗鞭黑粉菌的遗传多样性分析。

实施例3 SCoT-PCR在遗传多样性分析中的应用

对SCoT扩增产物的电泳结果进行人工比对、校正，有条带记为1，无条带记为0，形成0、1矩阵。利用POPGENE 1.32软件计算有效等位基因数（Ne）、Nei's基因多样性指数（H）、Shannon's信息指数（I）；利用NTSYS-pc 2.1软件，进行相似性分析形成相似系数矩阵，按UPGMA方法进行聚类分析。

遗传相似性分析结果显示：10个菌株的相似系数值分布在0.6228～0.8953，平均为0.7578，其中同为采自江西赣州 ROC16 的7号菌株和来自江西赣州 ROC16 的8号菌株的相似系数最高（0.8953）；采自广东翁源ROC10的5号菌株和来自江西赣州ROC16的7号菌株的相似系数最小（0.6228），遗传差异最大；总体来说，10个菌株遗传变异不大，但也存在遗传多样性的分化。基于 SCoT 标记的UPGMA聚类（图8），在相似系数为0.75的水平，可将10个菌株分为3大类，其中5号菌株单独聚为一类（Ⅲ），1、2、3、4、6号菌株聚为一类（Ⅰ），7、8、9、10号菌株聚为一类（Ⅱ）；在相似系数为0.79时，可将Ⅰ类和Ⅱ类分别再分为两个亚类Ⅰa、Ⅰb和Ⅱa、Ⅱb，其中Ⅰa包括1、2、3号菌株，1、2号菌株均采自广东湛江；Ⅰb包括4、6号菌株，3、4号菌株采自同一地区广西宜州，虽然不在同一个亚类，但同属于Ⅰ类中；Ⅱa包括来自江西赣州的7、8号菌株，Ⅱb为采自云南开远的9、10号菌株。由聚类结果可知，具有相同地理来源的菌株遗传差异小，亲缘关系近，聚类结果与地理来源有一定的相关性。本研究所建立的甘蔗鞭黑粉菌SCoT-PCR反应体系稳定可靠，所筛选的引物多态性丰富，能用于甘蔗鞭黑粉菌的遗传相似性研究。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

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<213> Ss-SCoT30

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Claims

1.甘蔗鞭黑粉菌SCoT-PCR特异性引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO：1～10所示。

2. 权利要求1所述特异性引物在甘蔗鞭黑粉菌遗传多样性分析中的应用。

3. 权利要求1所述特异性引物在抗黑穗病甘蔗品种选育中的应用。

4. 权利要求1中SEQ ID NO：1～10所示任一条特异性引物的SCoT-PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系总体积为25μL，其中10×Buffer 2.5μL；DNA模板用量为12.5～125 ng；dNTPs浓度为0.14～0.23mmol/L；引物浓度为0.28～0.46μmol/L；rTaq DNA 聚合酶用量为0.70～1.15U；Mg²⁺ 浓度为1.4～2.3mmol/L。

5. 根据权利要求4所述的SCoT-PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系总体积为25μL，其中10×Buffer 2.5μL、DNA模板12.5 ng、dNTPs 0.17 mmol/L、引物0.46 μmol/L、Mg²⁺ 1.7mmol/L、rTaq DNA 聚合酶0.85U。

6. 一种分析甘蔗鞭黑粉菌遗传多样性的方法，其特征在于，所述方法为：提取供试甘蔗鞭黑粉菌的基因组DNA，应用权利要求1中SEQ ID NO：1～10所示的10条特异性引物，分别对供试甘蔗鞭黑粉菌的基因组DNA进行SCoT-PCR，根据10条引物扩增出的基因组DNA多态性条带对供试甘蔗鞭黑粉菌进行UPGMA聚类分析。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用权利要求1所述特异性引物对供试甘蔗鞭黑粉菌的基因组DNA进行SCoT-PCR的反应体系总体积为25μL，其中10×Buffer 2.5μL；DNA模板用量为12.5～125 ng；dNTPs浓度为0.14～0.23mmol/L；引物浓度为0.28～0.46μmol/L；rTaq DNA 聚合酶用量为0.70～1.15U；Mg²⁺ 浓度为1.4～2.3mmol/L。