CN101942504A - 一种dna分子标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA分子标记方法，所述方法是将SCoT标记引物与ISSR标记引物组合使用形成的一种新的标记方法SC-SSR。本发明方法操作简单，稳定性好，多态性高；综合了SCoT标记方法和ISSR标记方法的优势，也就是说不仅具有ISSR的多态性优势，而且可以使扩增位点与表达序列紧密连锁，可获得更丰富的遗传信息；本发明方法是直接在原有引物基础上进行组合，引物可以在物种间通用，大大减少了合成引物的费用，同时也大大提高了引物的使用率。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA分子标记方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接在DNA水平上检测生物个体之间的差异，是生物个体在DNA水平上遗传变异的直接反映。目前广泛使用的基于PCR基础的分子标记如RAPD、SSR、AFLP等或是扩增非编码区域，或是随机在基因组中扩增，普遍距离编码序列较远或很难在目标性状基因附近存在标记位点，此类DNA分子标记通称为随机DNA分子标记（random DNA markers，RDMs）；随着结构及功能基因组学的飞速发展，基于目的基因开发形成的目的基因标记（gene targeted markers，GTMs）成为一类新型分子标记类型，如EST标记，SRAP标记，TRAP标记，IFLP标记，SSCP，SNP标记等。但是每种分子标记方法均有其优势和不足之处，如RAPD方法简单、成本低，但重复性较差、检测位点不多；SSR多为共显性、重复性好，但位点较少、引物开发成本高；ISSR标记是一种基于微卫星序列发展起来的十分有效的分子标记，对传统意义上SSR之间的DNA序列进行PCR扩增，而不是扩增SSR本身，但ISSR是一种显性标记（部分共显性）；AFLP谱带多，但分析程序复杂、成本高，有时要用到同位素，而且甲基化敏感的限制酶由于基因组DNA的甲基化可导致“假多态性”产生，识别AATT位点的Mse I酶常会引起一些物种基因组中标记分布不均衡；EST标记普遍多态性低，SRAP标记和TRAP标记触及的表达序列较少，IFP和SSCP，SNP标记则是根据已知基因序列开发来的，成本较高。
最近，Collard和Mackill (Collard B.C.Y., and Mackill D.J., 2009, Start codon targeted (SCoT) polymorphism: a simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants, Plant. Mol. Biol. Rep., 27(1): 86-93)开发的目标起始密码子多态性（startcodon targeted polymorphism, SCoT）分子标记技术也是一种目的基因分子标记，其依据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩增。SCoT标记作为一种基于PCR技术的新型分子标记具有操作简单、引物具有通用性、成本低廉、多态性高、可获得丰富的遗传信息等诸多优点，能更好地反映物种的遗传多样性和亲缘关系（Collard B.C.Y., and Mackill D.J., 2009, Start codon targeted (SCoT) polymorphism: a simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants, Plant. Mol. Biol. Rep., 27(1): 86-93）。SCoT标记不仅可以作为ISSR和RAPD的有效补充，而且是一种能跟踪性状的新的分子标记，但是引物的来源有限，虽然理论上能覆盖全基因组，但是初期的引物设计和筛选工作比较繁琐。因此为使辅助选择育种时的目标性更强，选择余地更大，分子标记技术还有一定的发展空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA分子标记方法。
本发明的技术方案在于采用了一种DNA分子标记方法，其采用常规的PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，但其PCR反应所使用的引物为组合引物，其中一个引物为SCoT标记引物，另一个引物为ISSR标记引物。
所述的反应程序中，退火温度为45-55℃，在应用SC-SSR 标记于特定物种时应对扩增程序进行优化，保证标记分析体系的稳定性和可靠性。
将综合SCoT分子标记和ISSR分子标记发展而来的这种新的分子标记方法命名为SC-SSR（Start Codon-Simple Sequence Repeat，起始密码子微卫星多态性分子标记技术）。由于SC-SSR标记的引物包括依据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性序列开发而来引物，因而使得到的位点与表达序列紧密连锁，为它的应用提供了一个广阔的前景；SC-SSR标记是基于PCR的标记系统，所以操作更简便；使用优化的退火温度，保证了扩增结果的稳定性；上游引物与下游引物之间可自由组配，因而用少数的引物可进行多种组合，大大减少了合成引物的费用，同时也大大提高了引物的使用率。SC-SSR的多态性来源于三方面：一是ATG翻译起始位点区域与SSR之间的区域（图1，Product A)；二是SCoT单引物可同时结合在双链DNA的正负链上的ATG翻译起始位点区域，从而扩增出两结合位点之间的序列（图1，Product B)；三是ISSR引物扩增位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组区段（图1，Product C)。上述DNA分子标记方法可以用在葡萄基因工程领域，包括用于种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、重要性状基因的标记、gDNA与cDNA指纹分析及图位克隆、辅助选择育种等方面。
本发明的优势在于：(1)本发明方法是建立在PCR基础上的单引物扩增，操作简单，并且特定的退火温度，保证了扩增结果的稳定性；(2)与ISSR标记相比，本发明方法是一种目的基因分子标记，能有效产生和性状连锁的标记，方便分子标记辅助育种；与SCoT标记相比，本发明方法因为还扩增了SSR区间；并且本方法除了可以扩增出单独的ISSR标记产生的多态性片段和单独的SCoT标记产生的多态性片段，还可以产生两种标记引物组合所形成的多态性片段，多态性更强；(3)本发明方法是直接在原有引物基础上进行组合，引物可以在物种间通用，大大减少了合成引物的费用，同时也大大提高了引物的使用率。
附图说明
图1为SC-SSR标记方法扩增产物的多态性示意图；
图2为SC-SSR标记引物SCoT 20/UBC 835在12个葡萄材料中扩增结果；
图3为SCoT标记引物SCoT 20在12个葡萄材料中扩增结果；
图4为ISSR标记引物UBC 835在12个葡萄材料中扩增结果；
其中图2-图4中的标号含义如下：M为DL 2000 DNAMarker的电泳条带，1-12代表12种葡萄品种，其对应的是相应材料扩增产物的电泳条带，1为98-2，2为洛浦早生，3为巨峰，4为京秀，5为瑞比尔，6为森田尼，7为赤霞珠，8为霞多丽，9为藤稔，10为美人指，11为夏黑，12为意大利。
具体实施方式
实施例1
本实施例SC-SSR标记方法的步骤如下：
（1）PCR扩增
PCR扩增的模板为12个葡萄品种（包括98-2、洛浦早生、巨峰、京秀、瑞比尔、森田尼、赤霞珠、霞多丽、藤稔、美人指、夏黑、意大利）的基因组DNA，引物为SCoT引物20（SCoT 20，具体序列如表1所示）和ISSR引物835（UBC 835，具体序列如表2所示）。PCR扩增的反应体系采用常规的体系进行配制，反应条件为94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸8min；
（2）电泳检测（所用的电泳检测方法属于常规的检测方法）
首先制备1.5%的琼脂糖凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，EB染色，紫外光下观察、拍照，电泳检测结果如图2所示。
实施例2
本实施例SC-SSR标记方法的步骤如下：
（1）PCR扩增：所使用的模板和反应体系与实施例1相同，引物为SCoT引物4（SCoT 4，具体序列如表1所示）和ISSR引物863（UBC 863，具体序列如表2所示），反应条件为94℃预变性3min；94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸8min；
（2）电泳检测（所用的电泳检测方法属于常规的检测方法）
首先制备8%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染并在可见光下观察、拍照。
实施例3
本实施例SC-SSR标记方法的步骤如下：
（1）PCR扩增：所使用的模板和反应体系与实施例1相同，引物为SCoT引物13（SCoT 13，具体序列如表1所示）和ISSR引物881（UBC 881，具体序列如表2所示），反应条件为94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸8min；
（2）电泳检测（所用的电泳检测方法属于常规的检测方法）
首先制备5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染并在可见光下观察、拍照。
实施例4
本实施例为对比例，采用SCoT标记方法和ISSR标记方法分别对实施例1中的12个葡萄品种进行PCR扩增和电泳检测，用以与实施例1的检测结果进行对比。其中除了所使用的引物不同之外，其他条件及方法均与实施例1的条件和方法相同，SCoT标记方法使用的引物为SCoT 20，检测结果如图3所示；ISSR标记方法使用的引物为UBC 835，检测结果如图4所示。
由上述的图2-图4显示的结果可以看出，SC-SSR标记方法获得了较多的多态性片段，优于单独的SCoT标记方法和ISSR标记方法，并且其PCR扩增效果与单独的标记引物的扩增效果相当甚至更好，因此本发明方法是一种极为有效的分子标记方法。
所述的引物序列附表如下：
表1 常用的SCoT引物序列
| 引物名称 | 序列（5'to 3’） |
| SC1 | CAACAATGGCTACCACCA |
| SC2 | CAACAATGGCTACCACCC |
| SC3 | CAACAATGGCTACCACCG |
| SC4 | CAACAATGGCTACCACCT |
| SC5 | CAACAATGGCTACCACGA |
| SC6 | CAACAATGGCTACCACGC |
| SC7 | CAACAATGGCTACCACGG |
| SC8 | CAACAATGGCTACCACGT |
| SC9 | CAACAATGGCTACCAGCA |
| SC10 | CAACAATGGCTACCAGCC |
| SC11 | AAGCAATGGCTACCACCA |
| SC12 | ACGACATGGCGACCAACG |
| SC13 | ACGACATGGCGACCATCG |
| SC14 | ACGACATGGCGACCACGC |
| SC15 | ACGACATGGCGACCGCGA |
| SC16 | ACCATGGCTACCACCGAC |
| SC17 | ACCATGGCTACCACCGAG |
| SC18 | ACCATGGCTACCACCGCC |
| SC19 | ACCATGGCTACCACCGGC |
| SC20 | ACCATGGCTACCACCGCG |
| SC21 | ACGACATGGCGACCCACA |
| SC22 | AACCATGGCTACCACCAC |
| SC23 | CACCATGGCTACCACCAG |
| SC24 | CACCATGGCTACCACCAT |
| SC25 | ACCATGGCTACCACCGGG |
| SC26 | ACCATGGCTACCACCGTC |
| SC27 | ACCATGGCTACCACCGTG |
| SC28 | CCATGGCTACCACCGCCA |
| SC29 | CCATGGCTACCACCGGCC |
| SC30 | CCATGGCTACCACCGGCG |
| SC31 | CCATGGCTACCACCGCCT |
| SC32 | CCATGGCTACCACCGCAC |
| SC33 | CCATGGCTACCACCGCAG |
| SC34 | ACCATGGCTACCACCGCA |
| SC35 | CATGGCTACCACCGGCCC |
| SC36 | GCAACAATGGCTACCACC |
表2 常用的ISSR引物序列
| 引物编号 | 序列 | 引物编号 | 序列 |
| 801 | ATATATATATATATATT | 851 | GTG TGT GTG TGT GTG TYG |
| 802 | ATATATATATATATATG | 852 | TCT CTC TCT CTC TCT CRA |
| 803 | ATATATATATATATATC | 853 | TCT CTC TCT CTC TCT CRT |
| 804 | TATATATATATATATAA | 854 | TCT CTC TCT CTC TCT CRG |
| 805 | TATATATATATATATAC | 855 | ACA CAC ACA CAC ACA CYT |
| 806 | TATATATATATATATAG | 856 | ACA CAC ACA CAC ACA CYA |
| 807 | AGAGAGAGAGAGAGAGT | 857 | ACA CAC ACA CAC ACA CYG |
| 808 | AGAGAGAGAGAGAGAGC | 858 | TGT GTG TGT GTG TGT GRT |
| 809 | AGA GAG AGA GAG AGA GG | 859 | TGT GTG TGT GTG TGT GRC |
| 810 | GAG AGA GAG AGA GAG AT | 860 | TGT GTG TGT GTG TGT GRA |
| 811 | GAG AGA GAG AGA GAG AC | 861 | ACC ACC ACC ACC ACC ACC |
| 812 | GAG AGA GAG AGA GAG AA | 862 | AGC AGC AGC AGC AGC AGC |
| 813 | CTC TCT CTC TCT CTC TT | 863 | AGT AGT AGT AGT AGT AGT |
| 814 | CTC TCT CTC TCT CTC TA | 864 | ATG ATG ATG ATG ATG ATG |
| 815 | CTC TCT CTC TCT CTC TG | 865 | CCG CCG CCG CCG CCG CCG |
| 816 | CAC ACA CAC ACA CAC AT | 866 | CTC CTC CTC CTC CTC CTC |
| 817 | CAC ACA CAC ACA CAC AA | 867 | GGC GGC GGC GGC GGC GGC |
| 818 | CAC ACA CAC ACA CAC AG | 868 | GAA GAA GAA GAA GAA GAA |
| 819 | GTG TGT GTG TGT GTG TA | 869 | GTT GTT GTT GTT GTT GTT |
| 820 | GTG TGT GTG TGT GTG TC | 870 | TGC TGC TGC TGC TGC TGC |
| 821 | GTG TGT GTG TGT GTG TT | 871 | TAT TAT TAT TAT TAT TAT |
| 822 | TCT CTC TCT CTC TCT CA | 872 | GAT AGA TAG ATA GAT A |
| 823 | TCT CTC TCT CTC TCT CC | 873 | GAC AGA CAG ACA GAC A |
| 824 | TCT CTC TCT CTC TCT CG | 874 | CCC TCC CTC CCT CCC T |
| 825 | ACA CAC ACA CAC ACA CT | 875 | CTA GCT AGC TAG CTA G |
| 826 | ACA CAC ACA CAC ACA CC | 876 | GAT AGA TAG ACA GAC A |
| 827 | ACA CAC ACA CAC ACA CG | 877 | TGC ATG CAT GCA TGC A |
| 828 | TGT GTG TGT GTG TGT GA | 878 | GGA TGG ATG GAT GGA T |
| 829 | TGT GTG TGT GTG TGT GC | 879 | CTT CAC TTC ACT TCA |
| 830 | TGT GTG TGT GTG TGT GG | 880 | GGA GAG GAG AGG AGA |
| 831 | ATA TAT ATA TAT ATA TYA | 881 | GGG TGG GGT GGG GTG |
| 832 | ATA TAT ATA TAT ATA TYC | 882 | VBV ATA TAT ATA TAT AT |
| 833 | ATA TAT ATA TAT ATA TYG | 883 | BVB TAT ATA TAT ATA TA |
| 834 | AGA GAG AGA GAG AGA GYT | 884 | HBH AGA GAG AGA GAG AG |
| 835 | AGA GAG AGA GAG AGA GYC | 885 | BHB GAG AGA GAG AGA GA |
| 836 | AGA GAG AGA GAG AGA GYA | 886 | VDV CTC TCT CTC TCT CT |
| 837 | TAT ATA TAT ATA TAT ART | 887 | DVD TCT CTC TCT CTC TC |
| 838 | TAT ATA TAT ATA TAT ARC | 888 | BDB CAC ACA CAC ACA CA |
| 839 | TAT ATA TAT ATA TAT ARG | 889 | DBD ACA CAC ACA CAC AC |
| 840 | GAG AGA GAG AGA GAG AYT | 890 | VHV GTG TGT GTG TGT GT |
| 841 | GAG AGA GAG AGA GAG AYC | 891 | HVH TGT GTG TGT GTG TG |
| 842 | GAG AGA GAG AGA GAG AYG | 892 | TAG ATC TGA TAT CTG AAT TCC C |
| 843 | CTC TCT CTC TCT CTC TRA | 893 | NNN NNN NNN NNN NNN |
| 844 | CTC TCT CTC TCT CTC TRC | 894 | TGG TAG CTC TTG ATC ANN NNN |
| 845 | CTC TCT CTC TCT CTC TRG | 895 | AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC |
| 846 | CAC ACA CAC ACA CAC ART | 896 | AGG TCG CGG CCG CNN NNN NAT G |
| 847 | CAC ACA CAC ACA CAC ARC | 897 | CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G |
| 848 | CAC ACA CAC ACA CAC ARG | 898 | GAT CAA GCT TNN NNN NAT GTG G |
| 849 | GTG TGT GTG TGT GTG TYA | 899 | CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A |
| 850 | GTG TGT GTG TGT GTG TYC | 900 | ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACA |
其中，表中的N = (A , G, C , T) , R = (A , G) ,Y = (C , T) ,B = (C , G, T) ( I. e. not A) ,D = (A , G, T)( I. e. not C) ,H = (A , C , T) ( I. e. not G) ,V = (A , C , G) ( I. e. not T)；上述引物由加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供，引物名称采用UBC+引物编号的方式描述。
上述实施例只涉及了其中的3个引物组合，所举实例只是为了更好的理解本发明方法，并不具有任何限制作用，即上述任何的引物组合或者等同于上述情况的引物组合均包含在本发明的技术方案的保护范围中。
Claims (2)
1.一种DNA分子标记方法，采用常规的PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，其特征在于：PCR反应所使用的引物为组合引物，其中一个引物为SCoT标记引物，另一个引物为ISSR标记引物。
2.根据权利要求1所述的一种DNA分子标记方法，其特征在于：所述的反应程序中，退火温度为45-55℃。
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