CN104946742B - 一种基于单引物扩增反应的dna分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，属生物技术领域。包括以下步骤：设计并合成单引物，提取样品基因组DNA作为模板，利用单引物和样品DNA模板在常规PCR反应体系和反应程序下进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后，检测单引物在基因组基因外显子区域中的两个结合位点间的多态性;其中单引物的序列长度为17bp，5’端的6个碱基填充序列为富含AT碱基的限制性内切酶酶切位点序列，中间核心区序列是由8个GC碱基随机组成，最后3’端是3个选择性碱基。本发明中的引物通用性好，本发明的DNA分子标记方法具有操作简单、稳定性高、重复性好、数量丰富、特异性高、多态性高、结果可靠等优点。

Description

一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法。

背景技术

DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接在DNA水平上检测生物个体之间的差异，能够从DNA水平直接反映生物的遗传本质，是生物个体DNA水平上遗传变异的直接反映。它具有数量丰富、信息量大、多态性高、检测不受季节、环境和个体发育阶段的影响、检测手段简单迅速等优点，已被广泛应用于遗传多样性分析、亲缘关系评价、指纹图谱构建、遗传连锁图谱构建、QTL或基因定位与克隆和分子标记辅助选择育种等领域。

自1980年首次提出分子标记的概念以来，DNA分子标记的研究不断有文献报道，特别是上世纪90年代以来，发展十分迅速。目前被广泛应用的DNA分子标记技术主要有：DNA限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)、随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、简单序列重复间多态性(Inter-Simple Sequence Repeats,ISSR)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment LengthPolymorphism,AFLP)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)、特殊序列扩增区(Sequence Characterized Amplified Regions,SCAR)、相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism,SRAP)、靶位区域扩增多态性(Target RegionAmplified Polymorphism,TRAP)、目标起始密码子多态性(Start Codon TargetedPolymorphism，SCoT)和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)等(Bostein et al.,1980；Williams et al.,1990；Zietkiewicz et al.,1994；Vos et al.,1995；Tautz and Renz 1984；Paran and Miehelmore 1993；Li and Quiros 2001；Hu andVick 2003；Collard and Mackill 2009)。按照分类的不同，上述DNA分子标记技术既可以被分为基于分子杂交(如RFLP)和基于PCR技术这两大类分子标记技术，而基于PCR技术上的DNA分子标记技术按照所用引物性质的不同可以分为基于随机引物扩增(如RAPD)的分子标记技术和基于特异引物扩增(如SSR)的分子标记技术，按照所用引物数量的不同可分为基于单引物扩增的分子标记技术和基于双引物扩增的分子标记技术(熊发前等，2010a)；也可以被分为随机DNA分子标记、目的基因分子标记和功能性分子标记(Andersen and Lübberstedt 2003)。

常规的DNA分子标记技术是使用一对引物进行PCR扩增的，而有一大类DNA分子标记技术只使用一条单引物进行PCR扩增，也被称为基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术。单引物扩增反应是指在一个PCR反应中只使用一条单引物，这一条单引物同时充当上游引物和下游引物的作用，当这一条单引物在基因组DNA上的两结合位点之间的距离不是很远的时候，两结合位点之间的序列便可得到有效扩增。自上世纪90年代以来，越来越多的基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术被开发出来并得到越来越多地关注和应用，比如RAPD(Williams J G K，Kubelik A R，LivakK J，et al.DNA Polymorphisms Amplified byArbitrary Primers Are Usefulas Genetic Markers[J].Nucl Acid Res.1990，18：6531-6535)、ISSR(Zietkiewicz et al.,1994)、ISTR(Rohde 1996)、IRAP(Kalendar et al.,1999)、IMP(Chang et al.,2001)、SCoT(Collard and Mackill 2009a；熊发前等，2009)、CDDP(Collard and Mackill 2009b；熊发前等，2010b)、iPBS(Kalendar et al.,2010)、HFO-TAG(Levi and Wechter 2010)和CBDP(Singh et al.,2013)。这些基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术的技术核心是单引物的设计。其中，RAPD技术中所使用的单引物是完全随机设计的；ISSR技术中所使用的单引物是根据简单重复序列(SSR)来设计的；ISTR技术和IRAP技术中所使用的单引物是根据LTR反转录转座子中的LTR序列来设计的；IMP技术中所使用的单引物是根据MITE转座子中的TIR序列来设计的；SCoT技术中所使用的单引物是根据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性序列来设计的；CDDP技术中所使用的单引物是根据不同物种中同时存在的保守DNA序列或蛋白质序列(如转录因子WRKY、MYB、ERF、KNOX和开花控制MADS-BOX及生长素结合蛋白ABP1)来设计的；iPBS技术中所使用的单引物是根据LTR反转录转座子中毗邻5’LTR序列的保守性的tRNA结合位点(Primer BindingSite,PBS)序列来设计的；HFO-TAG技术中所使用的单引物是根据存在于大量西瓜的unigenes中的长度为8-10bp的高频率短序列来设计的；CBDP技术中所使用的单引物是根据植物启动子中存在保守一致序列“GGCCAATCT”来设计的。总之，自上世纪九十年代以来，DNA分子标记技术的开发及应用进展十分迅速，新的DNA分子标记技术不断出现，基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术也在同步涌现。一般来说，后面出现的DNA分子标记技术大都吸收了前面的优点且克服了它们的部分不足，使之不断优化，但现有的DNA分子标记技术缺陷仍然十分明显，存在着引物退火温度低、引物设计复杂、引物数量少、操作重复性差和趋向于扩增非功能编码区域等缺点。

因此，开发一种引物设计简便、引物合成费用低、利用率高、引物退火温度高，操作简单、高效、重复性好、特异性高、多态性高的新型DNA分子标记技术十分必要。目前，还没有一种针对基因外显子区域扩增的基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种针对基因外显子区域扩增的基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术，弥补现有分子标记技术的不足之处。本发明所提供的DNA分子标记方法除具有操作简单、稳定性高、重复性好、数量丰富、特异性高、多态性高、结果可靠等优点外，因提供的单引物设计是根据真核生物基因组中的基因外显子区域富含GC的原理来设计的，引物可以在真核生物间通用，大大减少了引物的合成费用，也大大提高了引物的使用利用率。

本发明采用的技术方案如下：

一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，包括以下步骤：根据真核生物基因组中基因外显子区域富含GC设计并合成单引物，提取样品基因组DNA作为模板，利用设计好的单引物和所提取的样品DNA模板在常规PCR反应体系和PCR反应程序下进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶电泳分离后检测单引物在基因组基因外显子区域中的两个结合位点间的多态性。

所述的单引物是指一个PCR反应中只使用一条固定引物，这一条固定引物同时充当正向引物和反向引物的角色，该固定引物是基于真核生物基因组中基因区富含GC来设计的，引物序列长度17bp，5’端的6个碱基填充序列为富含AT碱基的限制性内切酶酶切位点序列，中间核心区序列是由8个GC碱基随机排列组成，这14个碱基组成核心序列，最后3’端是3个选择性随机碱基。

进一步地，所述单引物的序列可以为下述Mme1～Mme15中的任意一种，引物序列走向为5’端到3’端：

Mme1 GAATTCCGGCGGCGATA(SEQ ID NO.1)

Mme2 GAATTCCGGCGGCGATC(SEQ ID NO.2)

Mme3 GAATTCCGGCGGCGATG(SEQ ID NO.3)

Mme4 GAATTCCGGCGGCGAAC(SEQ ID NO.4)

Mme5 GAATTCCGGCGGCGTGC(SEQ ID NO.5)

Mme6 GAATTCCGGCGGCGTAC(SEQ ID NO.6)

Mme7 GAATTCCGGCGGCGTCG(SEQ ID NO.7)

Mme8 GAATTCCGGCGGCGTGA(SEQ ID NO.8)

Mme9 GAATTCCGCCGCCGATA(SEQ ID NO.9)

Mme10 GAATTCGGCGGCGGATC(SEQ ID NO.10)

Mme11 ATCGATCGGCGGCGATC(SEQ ID NO.11)

Mme12 ATATATCGGCGGCGATA(SEQ ID NO.12)

Mme13 ATATATCGGCGGCGATC(SEQ ID NO.13)

Mme14 ATATATCGGCGGCGATG(SEQ ID NO.14)

Mme15 ATATATCGGCGGCGTCG(SEQ ID NO.15)

本发明中，所述的PCR反应程序为：94℃预变性4min；然后按94℃变性30s，45℃-55℃退火1min，72℃延伸90s，总共35个循环；最后一步72℃延伸10min，4℃保存备用。

本发明中，所述扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，是指将PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后溴化乙锭(EB)染色，在凝胶成像系统下拍照、保存图像和记录结果。

本发明中，所述单引物是指在一个PCR反应中只使用一条引物，一条引物过常规PCR扩增，得到真核生物基因组中基因外显子结合位点间序列的PCR产物，从而检测单引物在基因组中基因外显子区域中的两个结合位点间的多态性。本发明中，所述多态性主要来自于以下二个方面：一是引物结合位点处的点突变造成的多态性；二是引物结合位点之间序列插入、缺失及内含子长度差异引起的长度多态性。

本发明的方法除具有操作简单、稳定性高、重复性好、数量丰富、特异性高、多态性高、结果可靠等优点外，因提供的单引物设计是根据真核生物基因组中的基因外显子区域富含GC碱基的原理来设计的，引物可以在真核生物间通用，大大减少了引物的合成费用，也大大提高了引物的使用利用率，同时产生的多态性标记与基因外显子序列紧密连锁，为功能型标记，可用于研究真核生物的遗传多态性、亲缘关系、种质鉴定、遗传连锁图谱构建、基因定位和分子标记辅助选择育种等。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明有益效果和优点在于：

1.本发明中所提供的一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，虽然像RAPD、ISSR一样，都是基于单引物扩增反应的，但该方法中所使用的单引物是根据真核生物基因组中基因外显子区富含GC来设计的，PCR扩增时一条单引物可同时锚定结合在基因组中的基因外显子区中的两个位点，产生的扩增产物包括外显子区甚至外显子临近的内含子区，产生的多态性标记多来自于基因内多态性，与基因编码序列紧密相关，为功能型标记，方便进行分子标记辅助选择育种。

2.本发明中所提供的一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法采用常规PCR进行扩增，PCR扩增退火温度较高(45℃-55℃)，克服了SRAP和TRAP标记技术因起始退火温度较低(35℃)而较易产生假阳性的缺点，特异性高，扩增结果稳定可靠，从而克服了SRAP和TRAP标记的缺陷。

3.本发明中所提供的一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法中，所使用的单引物是根据真核生物基因组中的基因外显子区域富含GC碱基的原理来设计的，引物可以在真核生物间通用，大大减少了引物的合成费用，也大大提高了引物的使用利用率；另外，本发明中的引物只要根据所述原理来设计，就可以大批量设计，从而方便各种研究。

4.本发明中所提供的一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法是建立在PCR基础上的分子标记系统，操作简单高效、重复性好、数量丰富、特异性高、多态性高、结果可靠、条带易于分离及可测序，不需使用同位素。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1为本发明的一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术示意图。

图2为引物Mme4(A)和Mme9(B)在16种花生材料中的扩增结果；其中M为Marker，编号1到16分别为冷水大麻壳、瑶上小麻壳、临桂麻壳长腰、平乐子、荔浦番鬼豆、资源花生、全县番鬼豆、全州方壳子、桂花17、桂花771、桂花836、桂花1026、A.moticola(PI468199)、A.duranensis(PI262133)、A.duranensis(PI219823)、A.ipaensis(PI？)。

图3为引物Mme8(A)和Mme9(B)在8份甘蔗材料中的扩增结果；其中M为Marker，编号1到8分别为桂糖21号、新台糖22号、桂糖30号、桂糖31号、桂糖32号、桂糖34号、桂糖35号、拔地拉。

图4为引物Mme9(A)和Mme10(B)在11份玉米材料中的扩增结果；其中M为Marker，编号1到11分别为正大619、兆丰788、桂单688、桂单591、兆丰688、桂单0810、桂单589、云瑞88、玉美头105、南校9665、桂单901。

图5为引物Mme2(A)和Mme4(B)在9份马铃薯材料中的扩增结果；其中M为Marker，编号1到9分别为中薯11号、中薯7号、中薯14号、费乌瑞它、中薯8号、冀张薯8号、中薯13号、中薯6号、中薯17号。

图6为引物Mme2(A)和Mme7(B)在16份菜心材料中的扩增结果；其中M为Marker，编号1到16分别为特青60天粗条菜心、澳洲008全年油绿甜菜心、澳洲超级608、香港45天油青甜菜心、名优308超冠甜菜心王、澳洲50短柄粗条菜心、桂柳十月柳叶菜心、菜兴利国际新一代碧绿油菜心49、绿宝701、3-1菜心、3-6-1菜心、5-3菜心、5-4菜心、5-14菜心、6-6菜心、6-6-1菜心。

图7为引物Mme6(A)和Mme7(B)在4份真菌材料中的扩增结果；其中M为Marker，编号1到4分别为镰刀菌、毛霉、曲霉、白僵菌。

图8为引物Mme1(A)、Mme4(B)和Mme14(C)在不同材料中的扩增条带模式；其中M为Marker，编号1到5分别为桂花1026、拔地拉、桂单688号、澳洲超级608和立枯丝核菌。

其中，图2-图8中最左列M为DNA Marker的电泳条带，在此为DL2000，大小从上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，白色箭头所指的位置为该标记在不同品种间表现为多态。

具体实施方式

本发明的一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术示意图见图1。该技术中所使用的一条单引物是根据真核生物基因组中基因外显子区富含GC来设计的，PCR扩增时，单引物可同时锚定结合在基因组中的基因外显子区中的两个位点，得到真核生物基因组中基因外显子结合位点间序列的PCR产物，从而检测单引物在基因组中基因外显子区域中的两个结合位点间的多态性。多态性主要来自于以下二个方面：一是引物结合位点处的点突变造成的多态性；二是引物结合位点之间序列插入、缺失及内含子长度差异引起的长度多态性。

下面通过对16种花生、8种甘蔗、11种玉米、9种马铃薯、16种菜心和4份真菌材料的实施例对本发明做进一步详细说明，所举实例只是为了更好的理解本发明方法，并不具有任何限制作用，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围，即在上述引物基础上按照本发明的原理设计出来的引物均包含在本发明的技术方案的保护范围中。

一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，包括以下步骤：

1.材料准备

1.1实验材料：本实例共选取了花生[1.冷水大麻壳、2.瑶上小麻壳、3.临桂麻壳长腰、4.平乐子、5.荔浦番鬼豆、6.资源花生、7.全县番鬼豆、8.全州方壳子、9.桂花17、10.桂花771、11.桂花836、12.桂花1026、13.A.moticola(PI468199)、14.A.duranensis(PI262133)、15.A.duranensis(PI219823)、16.A.ipaensis(PI？)]、甘蔗(1.桂糖21号、2.新台糖22号、3.桂糖30号、4.桂糖31号、5.桂糖32号、6.桂糖34号、7.桂糖35号、8.拔地拉)、玉米(1.正大619、2.兆丰788、3.桂单688、4.桂单591、5.兆丰688、6.桂单0810、7.桂单589、8.云瑞88、9.玉美头105、10.南校9665、11.桂单901)、马铃薯(1.中薯11号、2.中薯7号、3.中薯14号、4.费乌瑞它、5.中薯8号、6.冀张薯8号、7.中薯13号、8.中薯6号、9.中薯17号)、菜心(1.特青60天粗条菜心、2.澳洲008全年油绿甜菜心、3.澳洲超级608、4.香港45天油青甜菜心、5.名优308超冠甜菜心王、6.澳洲50短柄粗条菜心、7.桂柳十月柳叶菜心、8.菜兴利国际新一代碧绿油菜心49、9.绿宝701、10.3-1菜心、11.3-6-1菜心、12.5-3菜心、13.5-4菜心、14.5-14菜心、15.6-6菜心、16.6-6-1菜心)和真菌(1.镰刀菌、2.毛霉、3.曲霉、4.白僵菌)六大种真核生物样品来检测该分子标记方法中所使用的单引物的多态性和通用性。

1.2实验仪器：低温高速离心机、凝胶成像系统、PCR仪、水平电泳仪、-40℃冰箱、紫外-可见光分光光度计、水浴锅、漩涡振荡器、移液枪。

1.3实验试剂：CTAB、Tris-HCL(pH8.0)，EDTA，β-巯基乙醇、NaCl、NH₄Ac、Tris平衡酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、RNA酶、DNA Polymerase(大连宝生物工程有限公司)，dNTPs(上海生工生物工程有限公司)，1×TAE。

2.实验方法

2.1引物设计：所述的单引物是指一个PCR反应中只使用一条固定引物，这一条固定引物同时充当正向引物和反向引物的角色，该固定引物是基于真核生物基因组中的基因外显子区富含GC来设计的，引物序列长度17bp，5’端的6个碱基填充序列为富含AT碱基的限制性内切酶酶切位点序列，中间核心区序列是由8个碱基长短的GC碱基随机排列组成，这14个碱基组成核心序列，最后3’端是3个随机添加的选择性碱基。本发明具体实施方式中所选用的引物的序列、引物的GC含量和熔点温度Tm如表1所示：

表1实施例中所有引物的序列

引物编号	序列(5’-3’)	GC含量	Tm
				Mme1	GAATTCCGGCGGCGATA	58.82％	54℃
Mme2	GAATTCCGGCGGCGATC	64.71％	56℃
				Mme3	GAATTCCGGCGGCGATG	64.71％	56℃
Mme4	GAATTCCGGCGGCGAAC	64.71％	56℃
				Mme5	GAATTCCGGCGGCGTGC	70.59％	58℃
Mme6	GAATTCCGGCGGCGTAC	64.71％	56℃
				Mme7	GAATTCCGGCGGCGTCG	70.59％	58℃
Mme8	GAATTCCGGCGGCGTGA	64.71％	56℃
				Mme9	GAATTCCGCCGCCGATA	58.82％	54℃
Mme10	GAATTCGGCGGCGGATC	64.71％	56℃
				Mme11	ATCGATCGGCGGCGATC	64.71％	56℃
Mme12	ATATATCGGCGGCGATA	47.06％	50℃
				Mme13	ATATATCGGCGGCGATC	52.94％	52℃
Mme14	ATATATCGGCGGCGATG	52.94％	52℃
				Mme15	ATATATCGGCGGCGTCG	58.82％	54℃

2.2引物合成：将待合成的引物序列发到上海生工生物工程有限公司进行合成，合成后的粉末状引物先用离心机短暂离心，再用超纯水或TE溶液将其配成终浓度10μmol/L，-20℃保存备用。

2.3DNA提取：其中16种花生材料、9种马铃薯材料和16种菜心材料的基因组DNA采用下述方法提取，详细步骤如下：取新鲜花生嫩叶、马铃薯嫩叶和菜心嫩叶样品，每种取0.3-0.5g，用剪刀剪碎，放入研钵中并在研钵中加入1g的PVP，分多次倒入足量的液氮，将叶片样品充分研磨成粉末状，将全部粉末样品转移到事先加入了1.0mlCTAB提取液且经过65℃预热的2ml离心管中，再加入20μlβ-巯基乙醇，于65℃水浴锅中温浴60min，期间上下颠倒混匀，以便DNA充分析出；然后在冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min后除去底部残渣，吸取上清液到另外一支2ml离心管，并在上清液中加入0.5μl的RNaseA，上下充分颠倒混匀，静置5min，加入与上清液等体积的氯仿抽提，上下充分颠倒混匀，静置5min；然后在冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min，吸取上清液并加入与上清液等体积且事先在-40℃预冷的无水乙醇于-40℃冰箱中沉淀30min，用白色小枪头或牙签将沉淀挑出来到新的1.5ml离心管中，用75％vol乙醇洗涤沉淀一遍，再用600μl DEPC水充分溶解沉淀，再加入600μl Tris平衡酚充分混匀抽提，静置5min，冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min，取上清液并在上清液中加入与上清液等体积的事先预冷的无水乙醇于-40℃冰箱中沉淀30min，再次用白色小枪头或牙签将白色沉淀挑出来到新的1.5ml离心管中，用75％vol乙醇洗涤沉淀一遍，短时间(5min以内)晾干后，用200μl DEPC水或TE溶解沉淀。

其中，8份甘蔗样品和11份玉米样品的基因组DNA采用下述方法提取，详细步骤如下：取新鲜甘蔗嫩叶和玉米嫩叶样品每种0.3-0.5g，用剪刀剪碎，放入研钵中并加入1g的PVP，多次倒入足量的液氮，将叶片样品充分研磨成粉末状，将全部粉末样品转移到事先加入了1.0ml CTAB提取液且经过65℃预热的2ml离心管中，并加入20μlβ-巯基乙醇，于65℃水浴锅中温浴60min，期间上下颠倒混匀，以便DNA充分析出，然后在冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min后除去底部残渣，吸取上清液到新的2ml离心管并在上清液中加入0.5μl的RNaseA，上下充分颠倒混匀，静置5min，加入与上清液等体积的氯仿抽提，上下充分颠倒混匀，静置5min，冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min，吸取上清液并再次加入与上清液等体积的氯仿抽提，冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min，吸取上清液并加入与上清液等体积的事先在-40℃预冷的无水乙醇于-40℃冰箱中沉淀30min，用白色小枪头或牙签将沉淀挑出来到新的1.5ml离心管中，用75％vol乙醇洗涤沉淀一遍，短时间(5min以内)晾干后，用200μl DEPC水或TE溶解沉淀。

其中，4份真菌样品的基因组DNA采用下述方法提取，详细步骤如下：取一粒常温保存的菌核放到加有硫酸链霉素的PDA培养基平板上，28℃培养两天，用口径5mm的打孔器打成菌饼，挑取两块菌饼接种到装有100mL PSB培养基(马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL)的三角瓶中，28℃培养3-5天，在产生菌核前收集菌丝体，用无菌水冲洗2次，无菌条件下风干，再将干燥的新鲜菌丝体放入加有少许经灭菌的石英砂的研钵中，加入液氮后充分研磨，充分研磨后转移到1.5mL离心管中，加入事先在65℃预热的600μL CTAB提取液，振荡混匀后放入水浴锅中，65℃恒温水浴30min，每10min振荡混匀一次，接着将提取液在冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min后取上清液转入另一支1.5ml离心管中，加与上清液等体积的氯仿/tri s饱和酚/异戊醇混合液[V(氯仿):V(tris饱和酚):V(异戊醇)＝24:24:1]充分摇匀，于冷冻离心机中以转速为12000r/min离心10min，取上清液移入另一离心管中，加入上清液2.5倍体积且经-30℃预冷的无水乙醇和上清液10％体积的3mol/L NaAc溶液(pH 6.0)沉淀，于冷冻离心机中以转速为12000r/min离心10min，弃上清液，将沉淀用70％vol的酒精洗2～3次，晾干，加200μL TE(含10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.0)缓冲液充分溶解后加入RNase于水浴锅中37℃恒温酶解1h。重复用氯仿/Tris饱和酚/异戊醇混合液抽提1-2次，直至中间层无明显沉淀，移取上清液至一新的离心管中，加上清液2.5倍体积且在-20℃预冷的无水乙醇和上清液10％体积的3mol/L NaAc溶液(pH 6.0)沉淀，于冷冻离心机中以转速为12000r/min离心10min，弃上清液，用70％vol的酒精洗沉淀2～3次，晾干，加50μL TE(含10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.0)缓冲液充分溶解后-20℃保存。

2.4PCR扩增及电泳检测：PCR反应体系：在200μl离心管中配制20μl下例反应体系：模板DNA(50ng)1μl，10×PCR Buffer 2μl，dNTPs(2.5mM each)0.5μl，单引物(10pmol/μl)1μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，H₂O 15μl；配好后混匀并短暂离心。PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸90s，总共35个循环；最后一步72℃延伸10min，4℃保存备用。电泳检测：首先制备1.5％的琼脂糖凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入上样缓冲液并点样进行电泳，电泳完成后，EB染色，凝胶成像系统下观察、拍照。

2.5数据采集与分析：根据计算机软件分析的要求，对胶图上的条带进行记录和统计，将每一条带视为一个位点，有条带的记为1(强带和弱带均记为1)，无条带的记为0，从而形成0/1数字矩阵，把该数字矩阵输入计算机中，统计扩增总条带数、多态性条带数，计算多态性比例。

2.6结果：由图2-8中显示的电泳结果可见：采用本发明提供的一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，可以从花生、甘蔗、玉米、马铃薯、菜心和真菌中获得丰富的多态性片段，揭示材料内的遗传差异，条带清晰工整、结果可靠稳定。从图8中显示的结果还可以看出：同一条引物在不同材料中(桂花1026、拔地拉、桂单688号、澳洲超级608和立枯丝核菌)扩增产生了不同的条带模式，说明本发明中的引物具有在不同生物间使用的通用性。不同引物在同一种材料中也产生了不同的扩增条带模式，这证明了单引物扩增的有效性。因此本发明方法是一种极为稳定可靠有效的基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法。

Claims (4)

1.一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，其特征在于包括以下步骤：根据真核生物基因组中基因外显子区域富含GC设计并合成单引物，提取样品基因组DNA作为模板，利用设计好的单引物和所提取的样品DNA模板在常规PCR反应体系和PCR反应程序下进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶电泳分离后检测单引物在基因组基因外显子区域中的两个结合位点间的多态性；其中，所述单引物的序列长度为17bp，5’端的6个碱基填充序列为富含AT碱基的限制性内切酶酶切位点序列，中间核心区序列是由8个GC碱基随机排列组成，这14个碱基组成核心序列，最后3’端是3个随机碱基；

所述单引物的序列为下述Mme1～Mme15中的任意一种，引物序列走向为5’端到3’端：

2.根据权利1所述的一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，其特征在于所述的PCR反应程序为：94℃预变性4min；然后按94℃变性30s，45℃－55℃退火1min，72℃延伸90s，总共35个循环；最后一步72℃延伸10min，4℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，其特征在于：所述扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，是将PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下拍照、保存图像和记录结果。

4.一种用于DNA分子标记中的单引物，其特征在于：所述单引物是根据真核生物基因组中基因外显子区域富含GC设计并合成的，所述单引物的序列长度为17bp，5’端的6个碱基填充序列为富含AT碱基的限制性内切酶酶切位点序列，中间核心区序列是由8个GC碱基随机排列组成，这14个碱基组成核心序列，最后3’端是3个随机碱基；

所述单引物的序列为下述Mme1～Mme15中的任意一种，引物序列走向为5’端到3’端：