CN104762403B - 与大豆油脂含量显著关联的GmDGK7基因分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与大豆油脂含量显著关联的GmDGK7基因分子标记及其应用，以解决大豆高油育种缺乏与油脂含量紧密连锁的分子标记问题。所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SeqIDNo.1所示，在第154位有1个G154‑A154碱基突变，导致SNP‑dCAPs多态性。此外，本发明还涉及扩增该分子标记的引物对如序列表SeqIDNo.2和SeqIDNo.3所示，以及该分子标记和引物对在筛选含高、低油脂的大豆和大豆油脂含量分子标记辅助选择中的应用。

Description

与大豆油脂含量显著关联的GmDGK7基因分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及大豆分子标记辅助育种，属于大豆遗传育种领域，具体涉及一种与大豆油脂含量显著关联的GmDGK7基因分子标记及其应用。
背景技术
大豆是最重要的油料作物，大豆油占全球植物油产量的28％，脂肪酸约占大豆种子质量的20％。脂肪酸在若干疾病的预防和治疗中起重要作用，包括癌症，心脏疾病和近视。大豆油脂还能作为生物柴油的重要原料。因此，提高大豆种子的油脂含量不仅对人类健康起重要作用，而且对我国经济和能源问题有重要意义。
大豆油脂含量是复杂的数量性状，受多基因控制及环境的影响。目前已有大量关于大豆油脂含量的QTL定位研究，但由于定位区间比较大，与油脂含量显著关联的分子标记不多，在育种中已知的能够提高油脂含量的基因十分有限。到现在为止，只报道了少数与大豆油脂合成相关的重要基因，如：FAD2-1A(Glyma10g42470)及FAD2-1B(Glyma20g24530)(Pham A T,et al.2010)、DGAT(Vaziri N D,et al.2004)、LACS(Pulsifer I P,etal.2012)、AAPT1(Qi Q,et al.2003)、GmbZIP123(Song Q X,et al.2013)和ACCase(Ralston A W,et al.1948)。因此挖掘和利用新的与油脂含量显著相关的基因及其分子标记，对准确筛选、培育高油大豆品种具有重要实践意义。
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异即SNP为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记—形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记技术因其具有多态性高、检测方便、快速、准确等特点，在大豆油脂育种中发挥了极其重要的作用。一方面通过寻找与油脂基因显著关联的分子标记，能够直接或间接地定位油脂基因；另一方面，应用与油脂基因显著关联的分子标记，能够把多个基因聚合在同一个品种中，从而实现基因累加，提高油脂育种的效率；更为重要的是，应用分子标记能够在基因型水平上对油脂基因进行深入评价和鉴定，为分子标记辅助育种奠定基础。
大豆油脂含量QTL定位中常用的SSR标记一般距离控制油脂的基因距离较远，尚不能用于分子标记辅助育种。虽然大豆油脂相关基因已有报道，但基于油脂代谢相关基因开发的功能分子标记非常少。有少数与脂肪酸代谢基因相关的SNP标记(如FAD2基因)已被用于大豆高油酸的分子育种，但关于大豆高油的分子育种尚缺乏功能分子标记。另外，SNP标记分型一般需要特殊的仪器，难以在常规实验室中分型，限制了其广泛推广到育种单位。
发明内容
本发明的目的是为了解决大豆高油育种缺乏与油脂含量紧密连锁的分子标记问题，故提出了一种与大豆油脂含量显著关联的基因GmDGK7分子标记及其应用，该分子标记不仅与油脂含量显著关联，而且位于GmDGK7基因的5'-UTR区，并在不同遗传背景的材料中验证了其有效性，具有筛选含高、低油脂的大豆和大豆油脂育种中的用途，为标记辅助选育高油大豆新品种提供了一种有用的分子标记。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与大豆油脂含量显著关联的基因GmDGK7分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示序列，在第154位有1个G154-A154碱基突变，导致SNP-dCAPs多态性。
所述功能分子标记的碱基突变位点位于大豆GmDGK7基因的5'-UTR区。
所述分子标记由SNP标记转换为SNP-dCAPs标记，可以在常规实验室中分型，能广泛推广到育种单位。
具体地说，所述分子标记的获得是通过以下步骤实现的：
(1)根据已知油脂相关同源基因分析，选择一个油脂代谢相关基因GmDGK7，编码甘油二酯激酶7(diacylglycerol kinase 7，DGK7)；
(2)通过数据库(http://www.soykb.org/)提供的SNP信息查找该候选基因内部(包括UTR区)的SNP位点，根据数据库中的SNP多态性计算最小等位基因频率MAF，选择MAF≥10％的SNP位点；
(3)再根据SNP位点所在区域和突变类型，排除内含子区域和同义突变，同时通过dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)分析SNP的酶切位点。
(4)最终在13号染色体上1043846位置发现了SNP位点，在扩增区域的154位置发现了酶切位点。
本发明还提供了一种用于扩增所述功能分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的引物1如序列表Seq ID No.2所示，引物2如序列表Seq ID No.3所示；
Seq ID No.2：5'-ACTATTTCGTCTTTGCCTGC-3'；
Seq ID No.3：5'-TTGCTTCTTCAACTCCTCCT-3'。
本发明还提供了所述分子标记或引物对在大豆油脂含量分子标记辅助选择中的应用。
本发明进一步提供了一种大豆油脂含量分子标记辅助选择的方法，具体步骤为：
(1)根据权利要求1所述分子标记设计引物，以被检测大豆基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增程序为95℃预变性5min，94℃40s，53.5℃30s，72℃1.5min，30个循环，72℃延伸10min；
(2)PCR产物进行胶回收，回收后分别用限制性内切酶BsgI酶于37℃酶切2h；
(3)酶切产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离后用Bio-Rad凝胶成像系统进行检测和记录；
(4)对应扩增产物不可以切开，则SNP位点碱基为A，对应扩增产物可以切开，则SNP位点碱基为G；碱基为A的大豆品种籽粒油脂含量低，碱基为G的大豆品种油脂含量高。
有益效果：
1、本发明所公开的SNP-dCAPS分子标记是位于油脂代谢相关基因GmDGK75'-UTR区的分子标记，不仅与油脂含量显著关联，而且可以追踪大豆油脂相关基因GmDGK7的多态性。
2、在大豆育种过程中，利用本发明公开的分子标记，可快速鉴定和筛选高油脂和低油脂的大豆，进行分子标记辅助选择，提高育种效率，加速育种进程。
3、本发明公开的SNP-dCAPS分子标记可采用PCR扩增和酶切检测，不需要特殊的SNP分型仪器，有利于在大多数实验室和大豆育种单位推广。
附图说明
图1所示为本发明实施例3中GmDGK7基因SNP-dCAPS分子标记在不同油脂含量的大豆品种中的基因型分析的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。下述实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及实验材料均为常规生化试剂。
实施例1：扩增GmDGK7基因的SNP-dCAPS分子标记的引物对的开发
根据分子标记的序列(如序列表Seq ID No.1所示)在phytozome(http://www.phytozome.net/)中，采用BLAST方法，获得序列一致率等于100％的大豆基因组序列。采用引物设计软件PRIMER5.0，设计特异扩增含有全部或部分分子标记的序列Seq ID No.1的引物对。在phytozome(http://www.phytozome.net/)中，对引物对进行BLAST，检测引物对在大豆中扩增的产物唯一，即为所示分子标记序列。
利用premier 5.0软件在SNP位点上下游设计引物：
(1)引物的长度一般为15-30bp；
(2)引物序列在模板内有较高的相似性，尤其是3’端，否则容易导致错配；
(3)引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响，不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A；引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败；
(4)引物序列的GC含量一般为40-60％，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。
(5)引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
(6)引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；
根据以上条件，利用低油脂材料小粒黑和大黑豆及高油脂材料吉农15和南农99-10筛选候选引物对，得到了所述的分子标记SNP-dCAPs的引物对序列为：
Seq ID No.2：5'-ACTATTTCGTCTTTGCCTGC-3'；
Seq ID No.3：5'-TTGCTTCTTCAACTCCTCCT-3'；
实施例2：GmDGK7基因的SNP-dCAPS分子标记的制备
(1)采用CTAB法提取大豆基因组DNA，具体步骤如下：
步骤一：取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0)15ml，混匀。
步骤二：65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀。冷却至室温后加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min。
步骤三：取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。
步骤四：勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH 8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100μg/μl。
(2)PCR扩增，具体步骤如下：
步骤一：反应体系(20μl)：4μl模板DNA(30ng/μl)，0.6μl引物(10μM)，1.5μl dNTPs(2.5mM)，2.0μl10×PCR Buffer(含15mM Mg2+)，0.2μl Taq酶(5U/μl)和11.7μl ddH2O。
步骤二：反应条件：95℃预变性5min，循环阶段：94℃变性40s；53℃退火30s；72℃延伸1.5min，循环30次，最后72℃延伸10min，PCR产物于4℃保存。100V恒定电压下，2％琼脂糖凝胶电泳25分钟进行分离。
(3)切胶回收扩增：
使用Takara胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行回收。
(4)酶切，具体步骤如下：
步骤一：反应体系(20μl)：2μl PCR产物(100ng/μl)，4μl CutSmart缓冲液，0.2μlBsgI酶(5U/μl)和13.8μl ddH2O，37℃反应2h。
步骤二：100V恒定电压下，2％琼脂糖凝胶电泳25分钟进行分离。
实施例3：GmDGK7基因的SNP-dCAPS分子标记在代表性低油和高油大豆品种中的基因型分析
油脂含量的测定方法：气相色谱仪为美国Thermo-Trace GC，色谱柱为Agilent毛细管柱122-3232DB-FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)；检测器为氢火焰离子检测器(FID)，检测器温度恒温250℃；进样口温度为220℃；柱温为200℃；进样量为1μL，分流进样方式，分流比25∶1；载气为氮气，氮气流速为30.0ml·min-1、氢气流速为35.0ml·min-1、空气流速为350.0ml·min-1；升温程序为：200℃保持1min，然后以8℃·min-1的速率升至210℃保持5min，再以5℃·min-1的速率升至220℃保持5min。用脂肪酸标准品作对照物质，配制一系列浓度梯度的标准品溶液测定相应的峰值，求出斜率、截距绘制标准曲线。运用毛细管气相色谱分离经过甲酯化的脂肪酸组份，通过色谱数据软件Chrom-Card Trace-Focus GC，利用峰面积百分比法测得各组份相对百分含量；利用标准曲线，计算材料中各脂肪酸百分含量和油脂含量。
如图1所示为GmDGK7基因的SNP-dCAPS标记，用引物对含SNP的片段进行PCR扩增后用BsgI酶切产物的2％琼脂糖凝胶电泳图。其中，从左至右的泳道依次为：小粒黑、大黑豆、宿县小黑豆、鄂豆4号、晋豆22、晋豆26、吉农15、南农99-10，编号分别为1、2、3、4、5、6、7、8。其中1、2、3、4为PCR产物无法切开的条带，5、6、7、8为PCR产物切开的条带，分别区分SNP位点碱基A和G，碱基为A的大豆品种1、2、3、4籽粒油脂含量＜16％，碱基为G的大豆品种5、6、7、8油脂含量＞23％。
实施例4：GmDGK7基因的SNP-dCAPS分子标记与油脂含量的关联分析及在筛选含高、低油脂大豆品种中的应用
通过运用TASSEL 5软件，首先输入表型油脂及组分含量，再次输入SNP-dCAPS分子标记检测的基因型，结合表2部分数据，利用一般线性模型即GLM模型对SNP-dCAPS分子标记和气相色谱法测定的200份大豆品种籽粒油脂含量进行关联分析，检测SNP位点对表型的关联度和效应值。本发明的SNP位点在200份育成大豆品种中的最小等位基因频率是14.25％(最小等位基因为G)。SNP位点与油脂含量显著关联(显著性分布为-log10P＝10.45)。SNP的G基因型对油脂含量具有较大的正效应(为1.71％)(见表1)。
表1：候选基因SNP与大豆油脂相关性状的关联分析
表2：200份育成品种油脂含量和SNP位点碱基
(5)通过对200份大豆品种籽粒油脂含量及SNP-dCAPS分子标记的分析，SNP的G基因型对高油脂(＞21％)的筛选效率为74％，即SNP的基因型为G的大豆材料中有74％为高油脂材料(见表2)。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种与大豆油脂含量显著关联的GmDGK7基因分子标记在大豆油脂含量分子标记辅助选择中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，在第154位有1个G154-A154碱基突变，导致SNP-dCAPs多态性。
2.根据权利要求1所述的与大豆油脂含量显著关联的GmDGK7基因分子标记在大豆油脂含量分子标记辅助选择中的应用，其特征在于，所述分子标记的碱基突变位点位于大豆GmDGK7基因的5'-UTR区。
3.一种用于扩增与大豆油脂含量显著关联的GmDGK7基因分子标记的引物对在大豆油脂含量分子标记辅助选择中的应用，所述引物对的引物1如序列表Seq ID No.2所示，引物2如序列表Seq ID No.3所示；
Seq ID No.2：5'-ACTATTTCGTCTTTGCCTGC-3'；
Seq ID No.3：5'-TTGCTTCTTCAACTCCTCCT-3'。
4.一种大豆油脂含量分子标记辅助选择的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)根据权利要求1中的GmDGK7基因分子标记设计引物，以被检测大豆基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增程序为95℃预变性5min，94℃40s，53.5℃30s，72℃1.5min，30个循环，72℃延伸10min；
(2)PCR产物进行胶回收，回收后分别用限制性内切酶BsgI酶于37℃酶切2h；
(3)酶切产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离后用Bio-Rad凝胶成像系统进行检测和记录；
(4)对应扩增产物不可以切开，则SNP位点碱基为A，对应扩增产物可以切开，则SNP位点碱基为G；碱基为A的大豆品种籽粒油脂含量低，碱基为G的大豆品种油脂含量高。
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