CN109504797A - 一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨树早花的snp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨树早花的SNP标记及其应用。本发明公开了一种梨早花紧密相关的SNP分子标记引物及其应用。一种与梨早花紧密相关的SNP标记Pef072‑01,引物:SEQ ID NO.1;SEQ ID NO.2。利用该特异引物基于高分辨率溶解曲线可对梨树开花早晚进行良好分型。本发明提供的梨早花分子标记引物可用于梨早花的分子标记辅助选择育种,对于加快梨品种的遗传改良进程,提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传育种领域,涉及一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨树早花的SNP标记及其应用。
背景技术
梨果不仅具有风味多汁、酸甜爽口等特性,而且富含膳食纤维和多种营养成分,具有生津、润燥、清热、化痰,抗氧化的功能,因而深受消费者喜爱。梨是世界范围的主要栽培果树树种,在五大洲的87个国家均有栽培。梨也是我国的第三大果树树种。我国梨的栽培面积和产量均居世界第一。相较于其他果树物种,梨具有更强的适应性,其在中国的南北方均有广泛种植。这种对气候的广泛适应性取决于梨树开花的时间。例如,控制梨树的开花时间可以帮助梨树应对早春的多雨、霜冻等天气,避免了恶劣天气对梨树产量的影响;同时,一些早花的梨品种也会提早成熟、提前上市。目前,我国梨的主栽品种中果实的花期都比较集中,一旦遭遇不良气候条件,就会引起整个梨产业的巨大波动。因此,培育不同花期的梨品种对生产的意义重大,也是最近几年我国梨品种改良的重要目标之一。
梨新品种的选育主要以杂交选育为主,而杂交选育通常是通过表型进行的,并且梨的童期较长,利用传统的育种技术选育新的品种需要很长的时间,因此培育出品质优良、适应性强、丰产耐贮的综合性状优良的新品种具有很大困难。利用分子标记辅助选择(MAS)育种技术可以提高选择效率,加快育种步伐。随着测序技术的不断发展,SNP(singlenucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)位点已经成为主流的分子标记。SNP指在基因组上单个核苷酸的变异所形成的核苷酸序列多态性,是目前认为最具有研发潜力的检测技术,与其他已知分子标记相比具有以下优势:一是在基因组中分布密度更高更均匀;二是易实现数据整合比较;三是通量高,检测位点数可达到几百万个;四是部分标记与功能基因甚至植物表型相关[1,2]。SNP分子标记检测技术近年来被广泛应用于大豆[3]、花生[4]、水稻[5]和小麦[6]等植物的分子辅助育种。
目前有关梨树花期的研究甚少,对梨早花的SNP分子标记开发及应用尚未有报道。因此,开展梨早花的SNP分子标记开发,并建立自然群体辅助选择技术体系,对于提高育种效率,节约生产成本显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是利用梨的重测序数据信息,开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨早花的SNP特异标记Pef072-01。通过该分子标记可以预测早花的梨品种,为实现梨树开花早晚的早期鉴定和筛选提供分子标记辅助育种的技术支持。
与梨早花紧密相关的SNP标记Pef072-01,位于登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr1的第7074631个碱基处;该标记在早花品种中为A,晚花品种中为G。
本发明所述的SNP标记Pef072-01在鉴定梨早花中的应用。
本发明所述的SNP标记Pef072-01在梨树开花早晚的早期鉴定和筛选的分子育种中的应用。
与梨早花紧密相关的SNP标记引物对,由Pef072-01-F:SEQ ID NO.1和Pef072-01-R:SEQ ID NO.2组成。
本发明所述的SNP标记引物对在鉴定梨早花中的应用。
本发明所述的SNP标记引物对在改良梨树开花早晚的分子育种中的应用。
本发明发现登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr1的第7074631个碱基处存在一个与梨早花相关的位点(Pef072-01)。Pef072-01位点在早花品种中为A,晚花品种中为G。通过检测该位点的基因型,可以预测梨树开花的早晚,以实现梨树开花早晚的早期鉴定和筛选。
一种基于高分辨率溶解曲线筛选梨树早花的方法,采用本发明所述的SNP标记引物对对梨树开花早的对照梨品种以及待鉴定的梨品种进行高分辨率溶解曲线分析,通过对待鉴定梨品种的高分辨率溶解曲线与上述对照梨品种的高分辨率溶解曲线的比较,鉴定该梨品种是否为早花的品种。所述的早花的对照梨品种选自:武巴;所述的晚花的对照梨品种选自:翠冠。
所述的高分辨率溶解曲线反应体系按照LightCycler 480High ResolutionMelting Master试剂盒中的说明书进行,HRM分析在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行。
高分辨率溶解曲线反应体系为20μL:含有30ng梨基因组DNA模板,1×Master Mix,2.5mmol/L MgCl2,200nM权利要求1所述的SNP标记引物对;扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR):95℃预变性10min,然后95℃变性10s、65-53℃退火10s、每循环下降0.5℃,72℃延伸10s的程序进行45个循环;PCR循环结束后进行熔解,其程序为:95℃1min,40℃1min,65℃1s,再从70℃连续升温至95℃,每升高0.04℃,收集荧光1次,最后降温至40℃;最后,在LightCycler480II的Gene Scanning软件中自动生成扩增产物的熔解曲线。
有益效果
本发明发现登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr1的第7074631个碱基处存在一个与梨早花相关的位点(Pef072-01),通过检测该位点的基因型,可以预测梨树开花的早晚,以实现早花品种的早期鉴定和筛选。基于上述发现,申请人开发了上述位点的SNP标记引物。利用开发的SNP标记引物,对66个梨自然群体进行差异基因型检测,能很好地用于鉴早花群体,与梨树实际开花时间相符。群体试验表明,开发的SNP标记特异引物可以对自然群体早花品种进行良好分型。因此,具有良好的应用价值,可实现对早开花梨品种的预先选择和辅助育种。
附图说明
图1SNP标记Pef072-01开发的HRM特异标记引物,66个梨自然群体个体中检测的归一化平移溶解曲线,可良好分型。
(a)Pef072-01标记引物检测的归一化平移溶解曲线。
(b)检测个体的排列,A1-C9为早花群体,D1-F9晚花群体。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例,本领域技术人员可以确定本发明的基本特征,并且在不偏离本发明精神和范围的情况下,可以对本发明做出各种改变和修改,以使其适用各种用途和条件。
实施例1梨树开花时间的收集
梨树开花时间的调查参照Cao等(2006)的方法进行[7]。将梨树5%的花开放的时间作为初花期的时间,每隔两天去田间调查一次,并记录各个品种的初花期时间。66个梨自然群体初花期时间见表1。
表1 66个梨自然群体早花期时间的调查
注:序号1-33为早花品种,34-66为晚花品种。
实施例2利用SNP标记位点Pef072-01开发HRM特异引物
从砀山酥梨全基因组数据库中搜索出第1条染色体上SNP标记Pef072-01的DNA序列,选取的该位点前后300bp的序列,依据引物设计原则,开发设计SNP标记引物(表2)。利用设计的SNP标记引物在砀山酥梨的基因组DNA上进行PCR扩增,引物均扩增正常,PCR产物符合预测大小。
表2 SNP标记引物
实施例3利用HRM(high-resolution melting,高分辨率溶解曲线)技术对梨树开花早晚进行分型
HRM反应体系按照LightCycler 480High Resolution Melting Master试剂盒中的说明书进行,HRM分析是在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行。20μL反应体系:含有30ng梨基因组DNA模板,1×Master Mix,2.5mmol/L MgCl2,200nM权利要求1或2所述的引物;扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR):95℃预变性10min,然后95℃变性10s、65-53℃(每循环下降0.5℃)退火10s、72℃延伸10s的程序进行45个循环。PCR循环结束后进行熔解,其程序为:95℃1min,40℃1min,65℃1s,再从70℃连续升温至95℃,每升高0.04℃,收集荧光1次,最后降温至40℃。最后,在LightCycler480II的Gene Scanning软件中自动生成扩增产物的熔解曲线。
利用实施例2得到的SNP标记引物对66个梨自然群体进行HRM分析(图1)。
Pef072-01引物分型结果:
线型1—蓝色曲线,37个体线型相似,其中23个体为早花品种;线型2—红色曲线,11个体线型相似,为杂合基因型,其中11个体为晚花品种;线型3—绿色曲线,10个体线型相似,其中8个体为晚花品种;线型4—粉色曲线,4个体线型相似,PCR产物中存在其他SNP位点,其中4个体为晚花品种。统计分析表明,66个个体分型为四种基因型,分离比例为37:11:10:4。根据Pef072-01引物分型结果将66个自然群体开花早晚的生理数据进行Fisher’sexact test(p-value=6.30E-03)。
因此,通过对梨树5%的花开放的时间点的数据收集结果与HRM分型结果的比较分析,证明Pef072-01标记的基因型与梨树开花早晚有关,能很好地用于检测梨早花个体。
主要参考文献
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2.Rafalski A:Applications of single nucleotide polymorphisms in cropgenetics.Current Opinion in Plant Biology 2002,5(2):94-100.
3.Lee,Y.G.,Jeong,N.,Kim,J.H.,Lee,K.,Kim,K.H.,Pirani,A.,Ha,B.K.,Kang,S.T.,Park,B.S.,and Moon,J.K.Development,validation and genetic analysis of alarge soybean SNP genotyping array.Plant Journal 2015,81,625-636.
4.Clevenger,J.,Chu,Y.,Chavarro,C.,Agarwal,G.,Bertioli,D.J.,Lealbertioli,S.C.,Pandey,M.K.,Vaughn,J.,Abernathy,B.,and Barkley,N.A.Genome-wide SNP Genotyping Resolves Signatures of Selection and TetrasomicRecombination in Peanut.Molecular Plant 2017,10,309-322.
5.Yu,H.,Xie,W.,Li,J.,Zhou,F.,and Zhang,Q.A whole-genome SNP array(RICE6K)for genomic breeding in rice.Plant Biotechnology Journal 2014,12,28-37.
6.Winfield,M.O.,Allen,A.M.,Burridge,A.J.,Barker,G.L.A.,Benbow,H.R.,Wilkinson,P.A.,Coghill,J.,Waterfall,C.,Davassi,A.,and Scopes,G.High-densitySNP genotyping array for hexaploid wheat and its secondary and tertiary genepool.Plant Biotechnology Journal 2016,14,1195-1206.
7.CaoY.F.,LiuF.Z.,HuH.J.,and ZhangB.B.Descriptors and Data Standardfor Pear (Pyrus spp.2006.
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨树早花的SNP标记及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catcacaggc tcattgttcg t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaggttcac cttgccattc c 21
Claims (9)
1.与梨早花紧密相关的SNP标记Pef072-01,其特征在于位于登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr1的第7074631个碱基处;该标记在梨早花品种中为A,晚花品种中为G。
2.权利要求1所述的SNP标记Pef072-01在鉴定梨早花中的应用。
3.权利要求1所述的SNP标记Pef072-01在梨早花早期鉴定和筛选的分子育种中的应用。
4.与梨早花紧密相关的SNP标记引物对,其特征在于由Pef072-01-F:SEQ ID NO.1和Pef072-01-R:SEQ ID NO.2组成。
5.权利要求4所述的SNP标记引物对在鉴定梨早花中的应用。
6.权利要求4所述的SNP标记引物对在梨早花早期鉴定和筛选的分子育种中的应用。
7.一种基于高分辨率溶解曲线筛选梨早花的方法,其特征在于采用权利要求4所述的SNP标记引物对对梨早花的对照梨品种以及待鉴定的梨品种进行高分辨率溶解曲线分析,通过对待鉴定梨品种的高分辨率溶解曲线与上述对照梨品种的高分辨率溶解曲线的比较,鉴定该梨品种是否为早花的品种;其中所述的早花的对照梨品种选自:武巴;所述的晚花的对照梨品种选自:翠冠。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于所述的高分辨率溶解曲线反应体系按照LightCycler 480High Resolution Melting Master试剂盒中的说明书进行,HRM分析在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行。
9.根据权利要求4所述的方法,其特征在于高分辨率溶解曲线反应体系为20μL:含有30ng梨基因组DNA模板,1×Master Mix,2.5mmol/L MgCl2,200nM权利要求4所述的SNP标记引物对;扩增程序采用降落式PCR:95℃预变性10min,然后95℃变性10s、65-53℃退火10s、每循环下降0.5℃,72℃延伸10s的程序进行45个循环;PCR循环结束后进行熔解,其程序为:95℃1min,40℃1min,65℃1s,再从70℃连续升温至95℃,每升高0.04℃,收集荧光1次,最后降温至40℃;最后,在LightCycler480II的Gene Scanning软件中自动生成扩增产物的熔解曲线。
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