CN116162721A - 一种区分南瓜果实大小的分子标记及鉴定方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种区分南瓜果实大小的分子标记及鉴定方法和应用，所述分子标记包括SEQ ID NO.1所示的第一引物Atlantic Giant‑allele‑F、SEQ ID NO.2所示的第二引物Hubbard‑allele‑F和如SEQ ID NO.3所示的第三引物Common‑R。本发明的区分南瓜果实大小的KASP分子标记(Cma.Chr4.19480431‑KASP)，在PCR扩增后不用酶切和电泳，可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率，为育种家筛选携带Cma.Chr4.19480431的南瓜育种材料提供了一种高通量、低成本快速检测的方法，加快了育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种区分南瓜果实大小的分子标记及鉴定方法和应用。
背景技术
南瓜种Cucurbita maxima中的一些品种拥有自然界最大的果实，通常被称为巨型南瓜(Giant pumpkin)。目前经常被用来进行南瓜种植比赛或园区展示栽培的品种是Atlantic giant，该品种由加拿大人Howard Dill于1979年选育而成。Hubbard南瓜的平均单果重约为5kg左右，而Atlantic giant的单果重可达200kg(Savage等，2015)。近年来，一方面因为种植者和种子公司对单果重这一性状的不断定向选择，另一方面由于土壤、肥料、水分、温度等栽培条件的改善，巨型南瓜的单果重记录被不断刷新。2021年，意大利StefanoCutrupi种出了重达1226kg的南瓜，创造了新的吉尼斯世界记录(Guinness WorldRecords，2021)。根据近年来南瓜单果重世界记录的更新速度，这一记录有望在几年内被再次刷新。
目前，世界各国，无论是美洲、欧洲还是亚洲，都拥有大量的巨型南瓜栽培爱好者，成立了很多协会，每年会举办很多活动。在我国，带有观光、展示、科普、教育性质的农业园区在全国范围内十分普遍，江苏省几乎每个市县都有。而巨型南瓜因其体形巨大、游客好评率高、很能体现科技水平，几乎成了这些园区的“标配”。因为巨型南瓜外形吸引人、贮藏期长，一些形状好、个头大的巨型南瓜很受某些顾客群体的青睐，单果价格可达几千元甚至上万元。栽培巨型南瓜，一开始可能仅仅是出于好玩和好奇，并无农业上的实用价值。但随着人们生活水平的提高，这方面的社会需求正逐渐增大，这个种植“游戏”正变得越来越具备社会经济价值。
果实大小是瓜类作物重要的品质和产量性状。因此，科学家们利用不同的遗传工具对不同植物果实大小的遗传机制进行了广泛的研究。植物果实的大小是由植物细胞的数量和大小决定的，其膨大是因为器官生长过程中的细胞增殖和细胞扩张。许多控制细胞增殖的关键成分已在不同的植物中被鉴定出来。因为竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allelespecific PCR，KASP)是一种一步法的基因型鉴定技术，可以通过荧光信号判断目标位点的基因型，所以KASP标记具有省时省力，费用低廉等特点，逐步成为了分子标记辅助育种中常用的标记类型(Steele and QuinTulloch et al.，2018)。但是目前为止，未见相关文献公开如何区分南瓜果实大小的分子标记及应用。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种区分南瓜果实大小的分子标记及鉴定方法和应用，目的是开发一个区分南瓜果实大小的KASP分子标记，降低对大量样本进行Cma.Chr4.19480431分子标记辅助选择的成本，提高育种效率。
基于上述目的，本发明提供了一种区分南瓜果实大小的分子标记，所述分子标记包括SEQ ID NO.1所示的第一引物Atlantic Giant-allele-F、SEQ ID NO.2所示的第二引物Hubbard-allele-F和如SEQ ID NO.3所示的第三引物Common-R。
采用所述区分南瓜果实大小的分子标记鉴定南瓜大小的方法，包括如下步骤：
步骤一、提取南瓜待测样本的基因组DNA；
步骤二、采用所述分子标记对待测样本的基因组DNA进行PCR扩增以得到PCR产物；
步骤三、对PCR产物进行基因分型检测，根据基因分型检测的结果判断待测样本中是否具有Cma.Chr4.19480431A和Cma.Chr4.19480431G。
所述第一引物Atlantic Giant-allele-F的5'端为VIC荧光信号标签，VIC荧光信号标签的序列如SEQ ID NO.4所示。
VIC荧光信号标签序列：5'-VIC-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'
所述第二引物Hubbard-allele-F的5'端为FAM荧光信号标签，FAM荧光信号标签的序列如SEQ ID NO.5所示。
FAM标签序列为：5'-FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'。
作为一种可选的实施方式，所述步骤二中PCR扩增的反应体系为0.8μL：待测样品DNA 20-50ng，烘干后加入100μM两条特异性引物各0.0013μL，100μM通用引物0.0033μL，2×KASP Master Mix 0.3945μL，超纯水0.3996μL。
优选的，所述步骤二中PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环。
作为一种可选的实施方式，所述步骤三中基因分型的方法为PCR扩增反应结束后，利用Arraytape扫描系统对扩增产物进行荧光扫描及荧光数据读取，转化的图形根据形状分类，聚合在接近X轴的显示三角形的样本的基因型为连接VIC荧光标签序列的Cma.Chr4.19480431A基因型，聚合在接近Y轴上的显示方形的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的Cma.Chr4.19480431G基因型，中间显示圆形的样本的基因型为杂合型。
本发明还提供所述区分南瓜果实大小的分子标记在南瓜育种中的应用。
本发明还提供所述区分南瓜果实大小的分子标记在南瓜品种鉴定中的应用。
本发明还提供所述区分南瓜果实大小的分子标记在鉴定南瓜果实试剂盒中的应用。
本发明通过对102株“Atlantic giant”דHubbard”F2代开展了第三代全基因组重测序工作，构建了高质量遗传图谱，获得了决定果实大小的13个重要QTLs和候选基因。对于发生在4个候选基因上的3个SNP和2个InDel开发了可用于分子辅助育种的KASP。其中对于南瓜4号染色体上的第19480431位的SNP位点设计的命名为Cma.Chr4.19480431-KASP的KASP成功区分了南瓜果实大小。
本发明的有益效果：本发明的区分南瓜果实大小的KASP分子标记(Cma.Chr4.19480431-KASP)，是根据南瓜4号染色体上的第19480431位的SNP位点设计的，根据该发明提供的Cma.Chr4.19480431-KASP标记进行基因分型，在PCR扩增后不用酶切和电泳，可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率，为育种家筛选携带Cma.Chr4.19480431的南瓜育种材料提供了一种高通量、低成本快速检测的方法，加快了育种进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明Cma.Chr4.19480431-KASP分型图；其中，聚合在接近X轴的显示三角形的样本的基因型为连接VIC荧光标签序列的Cma.Chr4.19480431A基因型，聚合在接近Y轴上的显示方形的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的Cma.Chr4.19480431G基因型，中间显示圆形的样本的基因型为杂合型，左下角显示五角形的样本为空白对照(NTC)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。
实施例1
1、南瓜材料
本发明使用的材料包括Cma.Chr4.19480431A基因型的南瓜品种Atlantic Giant和Cma.Chr4.19480431G基因型的南瓜品种Hubbard。来源于以‘Atlantic Giant’和‘Hubbard’为亲本构建的F2群体。供试材料种植于扬州大学(119 26′e,32 24′n)塑料大棚中。
2、南瓜叶片DNA提取
利用植物基因组DNA提取试剂盒(中国北京天根)，根据生产企业说明书(https://www.tiangen.com/？productShow/t1/1/id/15.html)，从幼嫩叶片中提取了AtlanticGiant、Hubbard、40株“Atlantic Giant”דHubbard”F2以及6种果实大小相关表型具有差异的Cucurbita maxima品种的基因组DNA。
3、KASP分子标记设计
根据南瓜4号染色体上的第19480431位的SNP位点设计了KASP分子标记Cma.Chr4.19480431-KASP,根据SNP位点上下游的序列，设计一条反向向通用引物Common-R(如SEQ ID NO.3所示)，两条等位基因特异引物Atlantic Giant-allele-F(如SEQ ID NO.1所示)和Hubbard-allele-F(如SEQ ID NO.2所示)，引物序列如下：
Atlantic Giant-allele-F：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTGCGGTAATTCCCAGTTGA-3’；
Hubbard-allele-F：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTGCGGTAATTCCCAGTTGG-3’；
Common-R：5’-CAAGTGTCAAGCAAGTTGTTCTTCTTG-3’
其中，Atlantic Giant-allele-F和Hubbard-allele-F引物中划线序列分别对应VIC和FAM荧光标签序列，Atlantic Giant-allele-F和Hubbard-allele-F引物3’端最后一个碱基分别与南瓜4号染色体上的第19480431位的SNP位点处的碱基互补。PCR扩增反应和KASP基因分型由华智生物技术有限公司完成。
4、KASP分子标记Cma.Chr4.19480431-KASP的实施
(1)PCR扩增反应
将提取的DNA分别加入全裙边96孔板，配制反应体系进行PCR扩增反应。
KASP反应测试在Douglas Arraytape基因分型平台上进行。PCR反应体系为0.8μL：样品DNA 20ng-50ng烘干后加入100μM两条特异性引物各0.0013μL，100μM通用引物0.0033μL，2×KASP Master Mix 0.3945μL，超纯水0.3996μL。
PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环。
(2)KASP分子标记Cma.Chr4.19480431-KASP的基因分型
反应结束后，利用Arraytape扫描系统对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。如图1所示，根据检测的形状分类，聚合在接近X轴的显示三角形(11个)的样本的基因型为连接VIC荧光标签序列的Cma.Chr4.19480431A基因型，聚合在接近Y轴上的显示方形(15个)的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的Cma.Chr4.19480431G基因型，中间显示圆形的样本的基因型为杂合型，左下角显示五角形的样本为空白对照。
基因分型结果显示，在Atlantic Giant、Hubbard、40株“Atlantic Giant”דHubbard”F2单株以及6种果实大小相关表型具有差异的Cucurbita maxima品种中有11个基因型与亲本‘Atlantic Giant’相同，是Cma.Chr4.19480431A基因型，22个单株为杂合子，17个单株与亲本‘Hubbard’基因型相同，是Cma.Chr4.19480431G基因型。
5、Cma.Chr4.19480431基因型的测序验证
为了验证Cma.Chr4.19480431-KASP标记的准确性，对Atlantic Giant、Hubbard、40株“Atlantic Giant”דHubbard”F2单株以及6种果实大小相关表型具有差异的Cucurbita maxima品种样品进行PCR扩增，然后进行测序。对测序结果序列进行比对后发现，在Atlantic Giant、Hubbard、40株“Atlantic Giant”דHubbard”F2单株以及6种果实大小相关表型具有差异的Cucurbita maxima品种中的DNA样品中，11份样品显示基因型与‘Atlantic Giant’相同，22份样品显示杂合基因型，17份样品显示与‘Hubbard’基因型相同，测序分析的结果与Cma.Chr4.19480431-KASP标记基因分型的结果完全一致(图1,表1)。这一结果说明了Cma.Chr4.19480431-KASP标记能准确的在群体中筛选出是大南瓜Cma.Chr4.19480431A基因型的个体和是小南瓜Cma.Chr4.19480431G基因型的个体。
表1 Cma.Chr4.19480431测序结果
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种区分南瓜果实大小的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括SEQ ID NO.1所示的第一引物Atlantic Giant-allele-F、SEQ ID NO.2所示的第二引物Hubbard-allele-F和如SEQ ID NO.3所示的第三引物Common-R。
2.采用权利要求1所述区分南瓜果实大小的分子标记鉴定南瓜大小的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、提取南瓜待测样本的基因组DNA；
步骤二、采用所述分子标记对待测样本的基因组DNA进行PCR扩增以得到PCR产物；
步骤三、对PCR产物进行基因分型检测，根据基因分型检测的结果判断待测样本中是否具有Cma.Chr4.19480431A和Cma.Chr4.19480431G。
3.根据权利要求2所述区分南瓜果实大小的分子标记鉴定南瓜大小的方法，其特征在于，所述第一引物Atlantic Giant-allele-F的5'端为VIC荧光信号标签，VIC荧光信号标签的序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求2所述区分南瓜果实大小的分子标记鉴定南瓜大小的方法，其特征在于，所述第二引物Hubbard-allele-F的5'端为FAM荧光信号标签，FAM荧光信号标签的序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求2所述区分南瓜果实大小的分子标记鉴定南瓜大小的方法，其特征在于，所述步骤二中PCR扩增的反应体系为0.8μL：待测样品DNA 20-50ng，烘干后加入100μM两条特异性引物各0.0013μL，100μM通用引物0.0033μL，2×KASP Master Mix 0.3945μL，超纯水0.3996μL。
6.根据权利要求2所述区分南瓜果实大小的分子标记鉴定南瓜大小的方法，其特征在于，所述步骤二中PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环。
7.根据权利要求2所述区分南瓜果实大小的分子标记鉴定南瓜大小的方法，其特征在于，所述步骤三中基因分型的方法为PCR扩增反应结束后，利用Arraytape扫描系统对扩增产物进行荧光扫描及荧光数据读取，转化的图形根据形状分类，聚合在接近X轴的显示三角形的样本的基因型为连接VIC荧光标签序列的Cma.Chr4.19480431A基因型，聚合在接近Y轴上的显示方形的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的Cma.Chr4.19480431G基因型，中间显示圆形的样本的基因型为杂合型。
8.权利要求1所述区分南瓜果实大小的分子标记在南瓜育种中的应用。
9.权利要求1所述区分南瓜果实大小的分子标记在南瓜品种鉴定中的应用。
10.权利要求1所述区分南瓜果实大小的分子标记在鉴定南瓜果实试剂盒中的应用。
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| CN117887895A (zh) * | 2024-03-14 | 2024-04-16 | 浙江大学海南研究院 | 南瓜果实长度性状的kasp分子标记及其用途 |
| CN118166148A (zh) * | 2024-04-07 | 2024-06-11 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 一种与南瓜果实大小主效qtl紧密连锁的snp位点、分子标记、引物对及其应用 |
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2022
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| CN118166148B (zh) * | 2024-04-07 | 2024-09-20 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 一种与南瓜果实大小主效qtl紧密连锁的snp位点、分子标记、引物对及其应用 |
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