CN118166148A - 一种与南瓜果实大小主效qtl紧密连锁的snp位点、分子标记、引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物分子遗传育种领域，特别是涉及一种与南瓜果实大小主效QTL紧密连锁的SNP位点、分子标记、引物对及其应用。本发明以实验室收集的268份南瓜材料作为自然群体材料，利用高通量测序技术，对南瓜果实大小性状的全基因组关联分析，开发与果实大小紧密连锁的SNP位点以及分子标记。该NP位点和分子标记能够用于建立大果南瓜果实的辅助选择育种体系，加速南瓜优良种质的育种进程。本发明首次公开了与果实大小紧密连锁的SNP位点分子标记，该分子标记可对南瓜进行基因型鉴定，通过基因型来准确和高效的筛选出大果或小果的南瓜品种。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子遗传育种领域，特别是涉及一种与南瓜果实大小主效QTL紧密连锁的SNP位点、分子标记、引物对及其应用。
背景技术
全基因组关联分析(GWAS，Genome-wideAssociation Study)基于群体中基因组内存在的变异信息与性状进行关联分析，有助于挖掘性状相关的新的调控位点、解析新的生物学调控机制及推动精准分子育种。单核苷酸多态性(SNP，Single NucleotidePolymorphism)因重复性高且数量丰富而被广泛应用于分子标记连锁图谱构建或全基因组关联分析的基因定位，推动了葫芦科作物遗传定位研究的发展。竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应(KASP，Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)是一种基于单核苷酸多态性(SNP)的新型基因分型技术，可以在基因组水平上准确判断SNP和插入缺失多态性(Indel)，并已广泛应用于生命科学研究和医学领域。
南瓜是菜粮兼用作物，果实的大小直接决定了产量。不同品种的南瓜果实大小差异巨大，变异丰富，最大的巨型南瓜超过1吨，普通的常见南瓜平均约1-2公斤。然而人们对南瓜果实大小的遗传基础和分子调控知之甚少，所涉及的QTL位点发现较少。现在的研究认为光合作用因素控制了南瓜果实的大小(Nakata,Y.,Taniguchi,G.,Takazaki,S.,Oda-Ueda,N.,Miyahara,K.,and Ohshima,Y.(2012).Comparative analysis of cells andproteins of pumpkin plants for the control offruit size.Journal ofBioscienceand Bioengineering 114,334-341)，巨型南瓜拥有更大的叶片，更高的净光合速率，韧皮部糖分含量更高(Pan,L.,Chen,C.,Wang,M.,Shen,Y.,Yang,Y.,Wang,A.,Dai,H.,Zhang,Z.,and Miao,M.(2021).Comparative analysis of assimilate synthesis,translocation and partitioning between two Cucurbita maxima cultivars“Atlantic giant”and“Hubbard”.ScientiaHorticulturae 289,110411.)。外源施加萘乙酸和油菜素内脂能显著提高净光合速率，增强韧皮部糖分合成，最终增大了南瓜果实(Chen,C.,Wu,X.-M.,Pan,L.,Yang,Y.-T.,Dai,H.-B.,Hua,B.,Miao,M.-M.,and Zhang,Z.-P.(2022).Effects of Exogenous&alpha；-Naphthaleneacetic Acid and 24-Epibrassinolide on Fruit Size and Assimilate Metabolism-Related Sugars andEnzyme Activities in Giant Pumpkin.International Journal of MolecularSciences 23,13157.)。虽然发现了上述与南瓜果实大小有关的生化途径，但是具体的分子机制并不清楚，也无相关的QTL被鉴定到。随着高通量测序技术的成熟，特别是大量的SNP(单碱基扩增多态性)标记的开发，应用高密度遗传图谱的方法开展植物性状基因定位成为挖掘植物基因的热点之一。利用高通量测序技术开发大量的SNP标记，开发性状连锁的分子标记进行品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期提高育种效率。因此，进行南瓜果实大小的基因定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立早期辅助选择技术体系，对果实大小的遗传改良具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与南瓜果实大小主效QTL紧密连锁的SNP位点、分子标记、引物对及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。该分子标记与南瓜果实的大小呈现高度紧密连锁的特征，再利用KASP技术获得SNP分型，能够准确且高效地鉴定南瓜果实大小性状。同时，该分子标记可用于南瓜分子标记辅助选择育种，可以加速南瓜优良品种的育种进程。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了SNP位点在鉴定南瓜果实大小中的应用，所述SNP分子标记位于南瓜6号染色体2512772bp的位置处，其多态性为G/A。
进一步优选的，本发明所述南瓜的基因信息可以从网站http://cucurbitgenomics.org/organism/9(Cucurbita moschata(Rifu)Genome，)查找。
本发明提供了一种与南瓜果实大小主效QTL紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，且该核苷酸序列第22位有一个G/A碱基突变。
本发明提供了用于检测上述的SNP分子标记的KASP引物组，所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物R。
本发明提供了一种上述的SNP分子标记的检测试剂或检测试剂盒，包含上述的KASP引物组。
本发明提供了上述的SNP分子标记、上述的KASP引物组或上述的检测试剂或检测试剂盒在鉴定南瓜果实大小中的应用。
本发明提供了一种鉴定南瓜果实大小的方法，包括：
以待测南瓜样品基因组为模板，利用上述的KASP引物组对模板进行KASP PCR扩增，根据扩增结果进行基因型分型。
优选的，若基因分型结果为GG或GA，则判定待测南瓜为大果品种；若基因分型结果为AA，则判定待测南瓜为小果品种。
本发明提供了上述的SNP分子标记、上述的KASP引物组或上述的检测试剂或检测试剂盒在筛选或预测大果南瓜品种中的应用。
本发明提供了上述的SNP分子标记、上述的KASP引物组或上述的检测试剂或检测试剂盒在改良南瓜种质资源中的应用。
本发明提供了上述的SNP分子标记、上述的KASP引物组或上述的检测试剂或检测试剂盒在南瓜育种中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以实验室收集的268份南瓜材料作为自然群体材料，利用高通量测序技术，对南瓜果实大小性状的全基因组关联分析，开发与果实大小紧密连锁的SNP位点以及分子标记。该SNP位点和分子标记能够用于建立大果南瓜果实的辅助选择育种体系，加速南瓜优良种质的育种进程。本发明首次公开了与南瓜果实大小紧密连锁的分子标记，该分子标记可对南瓜进行基因型鉴定，通过基因型来准确和高效的筛选出大果或小果的南瓜品种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为部分GWAS南瓜群体外观图；
图2为是南瓜果实大小性状全基组关联分析图，左侧为曼哈顿图，为遗传标记效应值即经F检验的全基因组P值按染色体上物理位置排序图，横坐标为基因组坐标，纵坐标-log10P，P值越小关联性越强，表现为纵坐标越大，右侧为关联分析Quantile-Quantile图；
图3为SNP位点在果实大小极端差异的77份遗传背景较远的自然群体中的KASP标记基因分型图，图中所示，极端小果的个体聚团在靠近X轴的位置(纯合AA，蓝点)，极端大果的个体聚团在靠近Y轴的位置(纯合GG，绿点)，极端大果靠近对角线位置(杂合GA，红点)，灰点为实验过程中的负对照，即没有模板DNA的处理。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1与南瓜果实大小主效QTL紧密连锁的SNP分子标记的获得
1、GWAS种质资源信息
1.1材料与试剂
本发明所用的中国南瓜的自然群体共有268个材料，来自于中国的有214份，来自于国外的有54份。
1.2果实大小在GWAS群体里的变异范围
成熟南瓜果实收获后沿横截面切开，量取果实腔体最宽处直径为表征果实大小。果实直径范围从4cm到40cm(图1)。
2、南瓜果实大小性状全基因组关联分析
2.1基因DNA提取
采用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB法)对268份自然群体的基因组DNA进行提取，2％琼脂糖凝胶电泳检测提取质量与DNA浓度，将浓度稀释至50～100ng/μL待用。
2.2重测序数据的分析
基于二代重测序平台Illumina Hi-Seq，对GWAS群体建库和重测序，经过DNA质检，建库，上机测序并过滤，最终得到clean reads data共1452.15Gb，平均每个样品5.37GB，对基因组的平均测序深度达到：16.58×，测序最大深度为：30.6，最低深度为：9.28。比对中国南瓜参考基因组，计算得到所有样品比对的平均覆盖度为：96.38％，最低覆盖度为：68.78％，最高覆盖度为：99.37％。经过滤得到了1,157,313个高质量SNP位点。并且染色体上的SNP的平均密度为0.2Kb/SNP。重测序数据表明，数据的深度以及质量可以满足在后续的研究中使用。
2.3南瓜果实大小全基因组关联分析
利用GEMMA分析软件，采用混合线性模型(Mixed Linear Model,MLM)对相关性状进行关联分析，通过关联的显著度(P-value)，筛选出潜在的候选SNPs。运行分析得出与果实大小关联的SNP的P值，manhattan plot图中设定-log10(P)≥10值为紧密关联SNP，果实大小显著关联到6号染色体的一个区段，此位点的-log10(P)＝12.43(图2)。该SNP位点位于南瓜6号染色体1868206bp处，其多态性为G/A，大果为A，小果为G。
实施例2KASP技术用于南瓜果实大小的基因分型
本发明设计了扩增实施例1中SNP位点的特异性引物对，包括两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物，两条正向引物5’端分别连有不同的检测接头序列；该组特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示；
正向引物序列由通用接头序列、普通扩增引物序列和分型位点序列三部分组成，具体如下所示：
上游引物F1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCATTTCCAGAATCAGAAACCG，SEQ ID NO.1，其中加粗斜体部分为FAM标签序列；
上游引物F2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCATTTCCAGAATCAGAAACCA，SEQ ID NO.2，加粗斜体部分为HEX标签序列；
下游引物R：GTTAAATGTTAAGCAAGCCCCG，SEQ ID NO.3.
KASP反应体系为：80ng模板DNA(10-100ng)、2×PARMS Master mix(5μL)、primermix(0.7μL)[F1(0.15μL)、F2(0.15μL)、R(0.4μL)]、H2O(N/A)，Total reaction volume(10μL)，模板DNA为待测南瓜的基因组DNA。
KASP反应程序：94℃热启动激活15min；94℃(20sec)，65-57℃(60sec)，每个循环降0.8℃，10个循环；94℃(20sec)，57℃(60sec)，32个循环。
反应结束后由TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号以图表的形式呈现出来，根据颜色不同，输出基因型结果，图表分为X，Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起。靠近X，Y轴的是纯合基因型(蓝点FAM，绿点HEX表示)，靠近对角线位置的是杂合基因型(红点FAMHEX表示)。小果基因型为A，在靠近Y轴的位置(蓝点FAM)，大果基因型为G，在靠近X轴的位置(绿点HEX)。
其中，PCR产物序列(SEQ ID NO：4)：CCATTTCCAGAATCAGAAACCNGTCCTGCCGTCGGAGAAGAGTGGCTGTCGGAAGGTG ATAGGTCTCCAGGAGAGTGGCTGCTGGGAGCTGATACGTCTCCGATTCCTGATGGTGGG GAAGACGGGGAAGACGGGGAGGACAAGGAAGACGGGGCTTGCTTAACATTTAAC；其中，该序列第22位碱基位置为SNP位点，该位置多态性为G/A。
选取在268份自然群体中果实大小极端差异的39份材料，大小如表1所示，其中小果15份，大果24份，为证实本发明筛选的分子标记的检测准确性，采用此KASP标记对此群体进行分型，分型结果如表1和图3所示：极端小果的个体聚团在靠近X轴的位置(纯合AA，蓝点)，极端大果的个体聚团在靠近Y轴的位置(纯合GG，绿点)，同时靠近对角线位置的大果(杂合基因型，GA，红点FAMHEX表示)。证明该SNP标记与性状紧密连锁。
表139份南瓜果实大小及SNP标记对应的基因型
综上所述可知，本发明以实验室收集的268份南瓜材料作为自然群体材料，利用高通量测序技术，对南瓜果实大小性状的全基因组关联分析，开发与果实大小紧密连锁的SNP位点以及分子标记。该SNP位点和分子标记能够用于建立大果南瓜果实的辅助选择育种体系，加速南瓜优良种质的育种进程。由此可见，本发明提供的SNP位点、分子标记、用于扩增该分子标记的KASP引物组以及检测该分子标记的试剂或试剂盒能够用于预测南瓜果实大小、改良南瓜种质资源以及南瓜育种。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.SNP位点在鉴定南瓜果实大小中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于南瓜6号染色体2512772bp的位置处，其多态性为G/A。
2.一种与南瓜果实大小主效QTL紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，且该核苷酸序列第22位有一个G/A碱基突变。
3.用于检测权利要求2所述的SNP分子标记的KASP引物组，其特征在于，所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物R。
4.一种权利要求2所述的SNP分子标记的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的KASP引物组。
5.权利要求2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂或检测试剂盒在鉴定南瓜果实大小中的应用。
6.一种鉴定南瓜果实大小的方法，其特征在于，包括：
以待测南瓜样品基因组为模板，利用权利要求3所述的KASP引物组对模板进行PCR扩增，根据扩增结果进行基因型分型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，若基因分型结果为GG或GA，则判定待测南瓜为大果品种；若基因分型结果为AA，则判定待测南瓜为小果品种。
8.权利要求2所述的SNP分子标记、权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂或检测试剂盒在筛选或预测大果南瓜品种中的应用。
9.权利要求2所述的SNP分子标记、权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂或检测试剂盒在改良南瓜种质资源中的应用。
10.权利要求2所述的SNP分子标记、权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂或检测试剂盒在南瓜育种中的应用。
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