KR20230082355A - 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별을 위한 단일염기 다형성 마커세트 및 이의 용도 - Google Patents
서양계 호박의 순도검정 및 품종판별을 위한 단일염기 다형성 마커세트 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별을 위한 단일염기 다형성 마커세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 서양계 호박 형질의 순도검정 및 품종을 판별하는데 필요한 시간과 비용을 절감하거나 판단의 정확도를 높일 수 있다.
Description
본 발명은 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별을 위한 단일염기 다형성 마커세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물의 품종간 구분은 여러 가지 목적에 따라 필요한 연구이다. 예를 들면, 국제식물신품종보호동맹 UPOV(International Uion for the Protection of New Varieties of Plant)의 설립 이후 품종보호권 설정은 종자 회사와 육종가의 큰 관심사가 되었고, UPOV의 회원국인 우리나라 또한 품종보호를 위하여 품종구분에 객관적인 기준을 설정 혹은 수치화하는 계량화의 필요성을 인식하게 되었다.
일반적인 품종 구분은 표현형에 근거하여 구분되어 왔다. 하지만 표현형은 환경요인에 많은 영향을 받기 때문에 통계적으로 많은 실험을 요구한다. 또한 품종간 구별에 있어 표현형은 객관적 기준이 불분명하고 체감적인 차이를 반영하지 못한다. 이런 어려움을 극복하기 위해 DNA 분자 마커를 개발하기 시작했다.
DNA 분자 마커는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSR(simple sequence repeat), SNP(Single-nucleotide polymorphism) 등 여러 가지 종류가 있다. 이중에 SNP 마커는 DNA 염기 변이 형태의 가장 흔한 유형이며 다형성 마커 개발에 높은 성공의 결과를 나타내는 방법 중 하나이다.
호박(Cucurbita spp.)은 2003년부터 수요 증대로 재배면적이 2007년까지 지속적으로 증가하였다가 이후 증감을 거듭하였고 재배면적은 2003년 8,791 ha에서 2018년 9,206 ha로 증가하였고 생산량도 2018년 31만톤 이상으로 2000년 27만톤 비해 약 1.1배 증가하였다. 국내 호박 종자시장도 2018년에 117억 규모로 2014년에 비해 약 1.5 배 이상 증가하여 향후에도 성장세를 이어갈 것으로 예측된다(종자협회, 2019). 호박의 경제적 중요성이 증가함에 따라 신품종 육성이 활발히 이루어지고 있으며 지적재산권인 품종보호권 강화 및 유사복제품종 개발 차단의 중요성이 강조되고 있다.
본 발명의 일 목적은 서열번호 1 내지 42의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 전부를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 조성물을 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 a) 서양계 호박 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하고, 서열번호 1 내지 42번으로 표시되는 각각의 염기서열의 61번째 위치에 존재하는 단일염기다형성 전부의 유전자형을 결정하는 단계; 및 b) 상기 단일염기다형성의 유전자형을 분석하여 서양계 호박의 순도 및 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1 내지 42의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 전부를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 42의 염기서열은 아래와 같다:
| 서열번호 | Assays ID | Chr. | SNP Pos (bp) | Sequence |
| 1 | CmaSPT01 | Cma_Chr01 | 1166024 | TAGTTGTACTTAGTTTGTGTGCCCCTTCTACAGGGAAATCAGCATGTGCAAATGGCTGGA[A/G]ATGCTTCTCATGGGAGTCACGTGGATGCTTCTGCTAAAGGTGAAACGTACGGCCAGCAGC |
| 2 | CmaSPT02 | Cma_Chr01 | 2366000 | CACAAGAGGACACCAGAAATTACCAAGTTCAACTTGTACGCACTTACACAAGAAGAGTTT[A/T]TAGGGAAAGAAAATGGGACACTAGCCAAAACAAAACTTATTTTACCTGGGGCTGCAGGGA |
| 3 | CmaSPT3 | Cma_Chr01 | 8031509 | AATAGCTATGGTTGCAACAAAAGCAGCAATTGAAGCGAGACCAAGATTCTTATACAAAAC[T/C]AACAGGGCCAGTACAACTTGAAAAACCACCAGCCAAACATCATGCATATACCAACTGAAC |
| 4 | CmaSPT4 | Cma_Chr02 | 4510484 | GGCAAACGCCGGTCCAGACACAAATGGCTCACAATTCTTCATCACTACAGTCACAACTAG[T/C]TGGTAAACTCCTGTCTGCCACGATTTTGTTTCATGCTTGATTTGATTGATTACTAAAAGG |
| 5 | CmaSPT5 | Cma_Chr02 | 4768207 | TGAAGCTTTCAGAGAAGCCACATGTGGCTGTTTGTAGTTCCAACAATGAAAATTCAGCCA[T/G]CTGAGTTTGATTCTCCACAAATCCGATCGATCTGTTATAATTTGCAGAAGCAGCCTTCTC |
| 6 | CmaSPT6 | Cma_Chr03 | 3701046 | GGCAATACCTACGAGACCAACTACCGGAGCTGCGACGAATAGCCAACTTCGTCGACCTCT[G/C]CCTGAATTGTAACTATTACTAACAGCAGGGTCTATGTTGCTCAGCTCCTCTCCTTGGCTG |
| 7 | CmaSPT7 | Cma_Chr04 | 8943024 | CCTGCGCACCCAAATCAGCTGTTGACGATGGAGCCTCAATGCATGTCTGTAGTTTAGTCA[G/C]AATGGAAAGCAGCTCTCATATTATATATATGCACATCAGAATCTCGATAGCTCGAATATT |
| 8 | CmaSPT8 | Cma_Chr05 | 1245092 | TTGATCACCTCCGACACACGCATCGGAGGACTGGATTTGGTGCCGACCATTTCTTGAATG[A/G]TTAGTTAAATGTGAGGCAGCTTTACCTGGAACATCAATACCTACAAATTTTACCGGTATA |
| 9 | CmaSPT9 | Cma_Chr05 | 5770482 | CGGCTGTATGAAGAGAAGGATAAAATGCACGCACTGAACGGAATGGAATACTCATTTGCT[A/G]TCGCTGCCGCTTCCTTCAGGACAGCATACAGTCTGAACAAGACCTTGTATCTTTGGTATA |
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| 11 | CmaSPT11 | Cma_Chr06 | 3465647 | TCTTCCCTGCAGTGCAAATCAAGATCTTCCCCTTCACCTTCTTCGGATTAAGCGTTCCCT[T/C]GCCGCAAAATTTCCTGCAATTAACGCCAATTTCAATTTCATAATCATCGAAGCAGCAGTT |
| 12 | CmaSPT12 | Cma_Chr06 | 9531280 | TGTTAAAATTCATCAGTTCAGTCCAGTTTTTGAACAAAAATGAGAAGAATCAAGGCAATA[A/C]GCAAGAATTTTTGTACCATCTTAGAGACACAATTGGAGATTGGAATGGCGGCTTTGGCTC |
| 13 | CmaSPT13 | Cma_Chr07 | 260780 | ACCGCTCTTACATTGCCCTTGGCAGCTATCAGGTCTGTTCGTGCACATTAGTGTGGTTGT[A/T]AAGTATATTGGTGATTGCTTTCAACTTGATTTGATACTCTGTCGTACTCTTTCAGCTAGT |
| 14 | CmaSPT14 | Cma_Chr07 | 5112390 | CGGTGGTTCAACCATGTTCCCTGGCATTGCTGATAGAATGAGCAAGGAGATCGCAGCGTT[A/G]GCCCCGAGCAGCATGAAGATTAAGGTGGTTGCACCGCCTGAAAGGAAGTACAGTGTGTGG |
| 15 | CmaSPT15 | Cma_Chr08 | 1984175 | ATTAGATTTGCTCTTCCGAAGCCATTCATCGCCCCTATGGGCTTCTCTATCTCTGGCGGA[A/C]AATTCAGCCACCTCTTCAGTTGTTGACTCGAAGACTGGAATGTCATTTCCGTCAGTAATC |
| 16 | CmaSPT16 | Cma_Chr08 | 6284315 | TCTGTAAAGTCTGAGAATAGTTGTATGAATTCAATTTTTATTGCCTTGCACTTGGTTCAT[G/C]TGGTGCTCATCTGTTTATCTTGAATTATGACAATAAATTCCTCTTATCTGCTATTTCCTT |
| 17 | CmaSPT17 | Cma_Chr09 | 400414 | TTGATGATGCCATCAACGATGGGGTCGATGTATTATCCTTATCTCTCGGTACGCCCTACT[A/T]CTACAAACCGGAATTGGCGACCGACCCCATTGCCATCGGAGCCTTTCATGCAGTTGAGAA |
| 18 | CmaSPT18 | Cma_Chr09 | 2341391 | TAGAGTTCATACTGCAGCTTCCCCTTTCCATCAACATGGCATCAGCAGGCACCGAACGGT[T/C]GGATTTTACATGAACCCCTGTATGGAGCAATCCAGGAGGTGAGGTGAATTCCAGTTCTTC |
| 19 | CmaSPT19 | Cma_Chr10 | 7111 | TCTATGACAAACAAGTTAAGAACAAAGCAGACCAGAGTCAGGACTCTAAAAGAAATTGTC[G/C]CCTGTGATAATATAATATAGCCATAGAGAACTGGTTCAATTCACGGACTTTATACAAATA |
| 20 | CmaSPT20 | Cma_Chr10 | 2532615 | TTTAACCATCTTAATCAAAAACCGCCATGTGTTTAGCTCTTAAAATGATTGATTCAAAAC[A/G]TACCAGAGTTTGAATGGAAGCAGAGATGAGAATGGTATAATATCGTCCAAGGAAAGAATC |
| 21 | CmaSPT21 | Cma_Chr10 | 5653457 | ACTCAATCCTCTTGGAACACTTCCATGGGTGTCGTTTTCCTCTCTCATACTCGTTCCTTC[G/C]AGAACACTTCTATCGATTGATGTTCTAAAGAACTCCATCAATTGCAATGGTGACTCTTTG |
| 22 | CmaSPT22 | Cma_Chr11 | 1387566 | CCCTATGCTATCCGACGGTGCAAAACCTCGCATCACGAACCCCGCGCGCCATTTCTCTAC[A/G]GACCCAAAGCGCCGATTCGCGGGATTTTGAAGGAAGACGCGTGGTGACAGCAGAGCAGCG |
| 23 | CmaSPT23 | Cma_Chr11 | 6163595 | CCGTTTGCACCGAGCTAAGCCGAGGGACCGTCTGCACCTATGTGTGACATGTGGCAGCAG[A/C]AAAACGAGCCACGTCGTTCGATAGCGTTGGGTCGAGGTACGGGTCACAATCCAATTTGGG |
| 24 | CmaSPT24 | Cma_Chr11 | 11924019 | ACCACGACAAATATAGCTACAAAGGAACTCACTGAATCAGAAAGAAAACAATCAAAATCG[G/C]ATTCGAGGAACTCGAGAAACTCGAGAAACGGATTGGGAACTTTCGCTAGTGTAGCTGCAA |
| 25 | CmaSPT25 | Cma_Chr12 | 1621291 | GGCGAGTTCACAAAGCTAGGTCTCATACTTCTTCCATTGACTTCATCATGCTTTATCTTC[A/T]TCTCTTCTCTGTTCTTTTGGTTTGCTCGTTATGCCTTCTCTGTTTCTATCTTCAAGCGTT |
| 26 | CmaSPT26 | Cma_Chr12 | 5793362 | ACGTCTGCAGCATCCAATTCTTCATACAGTGCATAATTGATCCTAAATTGAATAGAAACA[A/G]ACAATCAGCAAATATTCACAAAATCTCCATCCTTACCAAATTAGAGATGATAAACATAGG |
| 27 | CmaSPT27 | Cma_Chr13 | 5235699 | CCCCAACACTTCAGCAGGAGCTCTTGATAGTTCCTCTGGTGTCAATGAGATTGAGTCGTC[A/G]AGAAAATGAATTTCACCAGCCAACCGATCAGGTGATCTCACATCGAGTCTTGCAAGGTTT |
| 28 | CmaSPT28 | Cma_Chr14 | 4062455 | AAACCACCAAGAATCTGGAAGTTGAGCTAGAACAAGAACAAGCTGCTCTAGAAAACGATG[A/T]ATCCATCAACTTTGGAAAATTGGCATCTAAACCTTCCAAAGTTGAAGCAGAACAAGATAT |
| 29 | CmaSPT29 | Cma_Chr14 | 5315189 | CTATAAATCGAATCGATTCCATCTCATTTCCTCAGGCAGCAATTTCCAAAGCGAAGGCGT[A/T]TTTCGGTGATCCTTCTCGAGTTCTTCACCGGATAACGCCGCACAAATCCAGATCCAAAAC |
| 30 | CmaSPT30 | Cma_Chr14 | 13223193 | AAATCCGCGCAGATCTCCTCTCCGGCGAAGAATTTCTTGTCGCCAAGGCATTGTTCTTAG[T/G]AATTCGATCGTCTCTGCCCTAGCTTTCTCCCTTTCTTCACTGCTGCGGGAACCGATTAAT |
| 31 | CmaSPT31 | Cma_Chr15 | 826428 | AAAGAGAAAACTCACAGCAAAAGCAACGATTGCTGAAGATAAAGCGAGAAATCCATACTT[G/C]GCCATGCCTTCAGAGAGGCCAACAAAGGTGTTCGCAACACCGAACATAATCCTCCAGAGC |
| 32 | CmaSPT32 | Cma_Chr15 | 2898973 | TGGAAGTCTAGAATCACGACTGTCAATTCTATCTTGTTGCCGAATATTTTCATTCATTCC[A/T]GAAAGATCCCTGGATGAATGAGCTGTGCCATAGCTTCCCGGCCAAGCAGCAGCATCAGAT |
| 33 | CmaSPT33 | Cma_Chr16 | 3059938 | CTGATTCCAGAGCTTCTCTAGGACGAGTCGAAACAAGTGCCATGGGGATCTTGTAATGCA[A/T]CAGGACATTCACAAACTCCTTTGATCCAGCTCGTAGTCTGTAAATTCCACCCTGCAATGC |
| 34 | CmaSPT34 | Cma_Chr16 | 7003738 | GATCTCAAAGCTTTAAAAAGATTTGTGGTTCGTAAGATATGCATGAAAGCAGCAAAAAGT[G/C]GGAGCGAACCTGACAAATATCATCAACTTTGTTGCTCCAAGAGCTTCTTTGACATGTTGC |
| 35 | CmaSPT35 | Cma_Chr17 | 5410180 | TATGATCAGCTCTCTCTTTCGACCAATGTTGAGTGTGCAAAGAAGCCGTGGTCACACCCA[T/C]GCTCGCTTCATTACCAAAATTAAGAGCATTGTAACTCATCAGTTTCGCGCCTCCGTCGCT |
| 36 | CmaSPT36 | Cma_Chr17 | 9119655 | GGAACTCGGAACCTAGAAATCGTTTGTAGTAAAATAGATGATAATGAGCAATTAGGAATT[A/T]CCTGAAATGGAGGACAGACATCTTGGATTCATGTGGCAGAAGTCCACACGCAGTAATTGG |
| 37 | CmaSPT37 | Cma_Chr18 | 1727363 | TCTCTTTTTCTTTGCCCTGCTGCACGATCTTTTTCTGATGTTCGAAACGACATTTTAAAA[A/G]ACAAATGGGAGAAGGAAAAACAGGCTAGTTTATCCATTACGAGTGAGCTTTATTCTCATA |
| 38 | CmaSPT38 | Cma_Chr19 | 175180 | GTAAAAGAAATTTGATGAGAACTAGAGAAGATTATCATACCTGGTGATGGCAGGGGAGAA[G/C]CTGATGCTGCAAGATATGATCAAGACCAACGTTAAAACTCATAAAATCTAAGAAATTGTT |
| 39 | CmaSPT39 | Cma_Chr19 | 7705932 | GGATGCGGGCAATAAGAGGTATAGATTGAAGGGAGGTTTCGAAGAAGGAAGAGGAGGCAG[A/G]GATGGGGGAAGAAAGAACTCGCTTGAAGAGAAGCCATGCTAATTCGGGGCTTTTGGAATT |
| 40 | CmaSPT40 | Cma_Chr20 | 1671948 | TTCTCACCTTTAGAATAGCCACCTTTCATACAATCAAATGCTTCGCTCATAAAGTTCGAG[T/G]TCTTTTTATTGCATAGTATCTGGCACTCTAACAAAGATTTTCCATCTTCCAGCAGTATAT |
| 41 | CmaSPT41 | Cma_Chr20 | 2481036 | TGATTCTGGTCAAGATGAGTTCGATTACGACTCGACTCCGGTACCGGAGGATGTCAAAGA[A/G]GGACATTTTGCAGTTGTGGCAGTTGATGCTGAGGAGCCGAAACGGTTTGCTGTTCCGTTG |
| 42 | CmaSPT42 | Cma_Chr20 | 3801765 | GCGCTTGGCTTGGCTACGGAGGGCGGCAGGACCGACTACGACGTTGCCGCAGTTGACGGT[A/G]GCGGAGGTGCGGTCGAGATAGTTGGCGTAGGCGAGGAGGAGGAAGGTGATGGAGGTGGCG |
상기 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)은 DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 말한다. '다형성'이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. "대립유전자"는 한 쌍의 상동염색 체에서 서로 대응하는 부위, 즉 상동하는 유전자자리에 위치하는 대립형질에 대응하는 유전자를 말하며, 같은 염색체 위치 (same chromosomallocus)를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태 (alternative forms) 중 하나를 뜻한다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, CC (A로 표시), CT (H로 표시) 또는 TT (B로 표시)). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 있어서 단일염기다형성은 서열번호 1 내지 42의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 것일 수 있다.
상기 61번째 염기는 서열번호 1 내지 42번 중 어느 하나의 염기서열 상에서 61번째 염기이다. 서열번호 1 내지 42번의 염기서열은 각각 서양계 호박의 염색체 상에 존재하는 단일염기다형성 및 측면 서열(Flanking sequence)을 포함한다. 상기 서열번호 1 내지 42번에서, 각각의 61번째 염기는 서양계 호박의 염색체 상에 존재하는 단일염기다형성으로, 서양계 호박의 순도 및 품종식별과 관련된 것을 선별한 것이다. 상기 단일염기다형성의 대립유전자형을 분석하면 양친과 자손의 염기 차이를 비교하여 서양계 호박의 순도 및 품종판별 하는데 유용할 수 있다.
상기 제제는 선택된 단일염기다형성에 해당하는 염기를 포함하는 연속염기와 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 연속 염기는 5 내지 121개의 염기로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 제제는 서열번호 1 내지 41번의 염기서열 중 어느 하나에서, 61번째 위치한 대립유전자 중 어느 하나의 염기 및 이의 측면 서열의 전부 또는 일부로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 상보적인 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 각 서열번호의 염기서열은 61번째 염기에 단일염기다형성이 위치하고, 61번째 염기를 기준으로 상류(upstream) 및 하류(downstream) 방향으로 각각 60bp의 측면 서열(flanking sequence)이 SNP에 연결되어 있다. 각 서열번호의 염기서열에는 1개의 단일염기다형성이 위치한다. 상기 연속 염기의 길이는 SNP 유전자형 판단 방법에 따라 길이가 달라질 수 있다.
일 구체예에 따르면 상기 제제는 검출 또는 증폭하고자 하는 폴리뉴클레오티드에 해당하는 서열번호의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성을 식별하기 위한 것일 수 있다. 상기 제제는 서열번호 중 어느 하나의 61번째 염기에 해당하는 단일염기다형성 대립유전자형 중 어느 하나의 염기 및 이와 연속적인 측면서열의 전부 또는 일부를 포함하는 프라이머일 수 있다.
일 구체예에 따르면 상기 제제는 프로브, 프라이머 및 이들의 조합 중 어느 하나일 수 있다.
용어 "프로브"는 특정 표적 서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 상기 프로브는 단일염기다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나 특이적 결합을 이룰 수 있는 것일 수 있다. 상기 프로브는 단일염기다형성의 염기 차이에 따라 결합력의 차이가 있는 것일 수 있다. 상기 프로브는 라벨링(labeling)되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있는 것일 수 있다.
용어 "프라이머"는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머는 선택한 SNP 분석 방법에 따라 통상 기술자에게 알려진 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 상기 프라이머 서열은 서열번호 1 내지 42번의 염기서열 중 일부 연속염기와 동일하거나 상보적일 수 있다. 상기 프라이머의 길이는 다양한 인자, 예를 들어 온도 및 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 41의 식별하기 위한 프라이머들은 아래의 표 2와 같다:
| 서열번호 | Assays ID | Chr. | SNP Pos (bp) | Primer Seq Allele X (FAM) | Primer Seq Allele Y (HEX) | Primer Seq common |
| 1 | CmaSPT01 | Cma_Chr01 | 1166024 | AATCAGCATGTGCAAATGGCTGGAA | CAGCATGTGCAAATGGCTGGAG | CCACGTGACTCCCATGAGAAGCAT |
| 2 | CmaSPT02 | Cma_Chr01 | 2366000 | GTACGCACTTACACAAGAAGAGTTTA | GTACGCACTTACACAAGAAGAGTTTT | GGCTAGTGTCCCATTTTCTTTCCCTA |
| 3 | CmaSPT3 | Cma_Chr01 | 8031509 | TTTTCAAGTTGTACTGGCCCTGTTA | TCAAGTTGTACTGGCCCTGTTG | GCAATTGAAGCGAGACCAAGATTCTTATA |
| 4 | CmaSPT4 | Cma_Chr02 | 4510484 | CGTGGCAGACAGGAGTTTACCAA | GTGGCAGACAGGAGTTTACCAG | CTCACAATTCTTCATCACTACAGTCACAA |
| 5 | CmaSPT5 | Cma_Chr02 | 4768207 | CGGATTTGTGGAGAATCAAACTCAGA | TGTGGAGAATCAAACTCAGC | TGTGGCTGTTTGTAGTTCCAACAATGAAA |
| 6 | CmaSPT6 | Cma_Chr03 | 3701046 | AGCCAACTTCGTCGACCTCTG | AGCCAACTTCGTCGACCTCTC | CAACATAGACCCTGCTGTTAGTAATAGTT |
| 7 | CmaSPT7 | Cma_Chr04 | 8943024 | ATATATAATATGAGAGCTGCTTTCCATTC | ATATATAATATGAGAGCTGCTTTCCATTG | GGAGCCTCAATGCATGTCTGTAGTT |
| 8 | CmaSPT8 | Cma_Chr05 | 1245092 | TGGTGCCGACCATTTCTTGAATGA | GGTGCCGACCATTTCTTGAATGG | CAGGTAAAGCTGCCTCACATTTAACTAA |
| 9 | CmaSPT9 | Cma_Chr05 | 5770482 | GAACGGAATGGAATACTCATTTGCTA | GAACGGAATGGAATACTCATTTGCTG | CAGACTGTATGCTGTCCTGAAGGAA |
| 10 | CmaSPT10 | Cma_Chr06 | 597363 | CAACGTTAAAGTGCGGTCAGGCT | AACGTTAAAGTGCGGTCAGGCC | GGTGAAGAACTGGTATCCAGTTTCTTTAT |
| 11 | CmaSPT11 | Cma_Chr06 | 3465647 | CGTTAATTGCAGGAAATTTTGCGGCA | GTTAATTGCAGGAAATTTTGCGGCG | CCTTCACCTTCTTCGGATTAAGCGTT |
| 12 | CmaSPT12 | Cma_Chr06 | 9531280 | GAACAAAAATGAGAAGAATCAAGGCAATAA | AACAAAAATGAGAAGAATCAAGGCAATAC | CTCCAATTGTGTCTCTAAGATGGTACAAA |
| 13 | CmaSPT13 | Cma_Chr07 | 260780 | CAAGTTGAAAGCAATCACCAATATACTTT | CAAGTTGAAAGCAATCACCAATATACTTA | GTCTGTTCGTGCACATTAGTGTGGTT |
| 14 | CmaSPT14 | Cma_Chr07 | 5112390 | GAGCAAGGAGATCGCAGCGTTA | AGCAAGGAGATCGCAGCGTTG | GCGGTGCAACCACCTTAATCTTCAT |
| 15 | CmaSPT15 | Cma_Chr08 | 1984175 | GGCTTCTCTATCTCTGGCGGAA | GCTTCTCTATCTCTGGCGGAC | GTCAACAACTGAAGAGGTGGCTGAA |
| 16 | CmaSPT16 | Cma_Chr08 | 6284315 | AATTCAAGATAAACAGATGAGCACCAC | AATTCAAGATAAACAGATGAGCACCAG | TCAATTTTTATTGCCTTGCACTTGGTTCAT |
| 17 | CmaSPT17 | Cma_Chr09 | 400414 | GGTCGCCAATTCCGGTTTGTAGT | GGTCGCCAATTCCGGTTTGTAGA | TATCCTTATCTCTCGGTACGCCCTA |
| 18 | CmaSPT18 | Cma_Chr09 | 2341391 | ATCAGCAGGCACCGAACGGTT | CAGCAGGCACCGAACGGTC | ATTGCTCCATACAGGGGTTCATGTAAAAT |
| 19 | CmaSPT19 | Cma_Chr10 | 7111 | CTATGGCTATATTATATTATCACAGGC | CTCTATGGCTATATTATATTATCACAGGG | AGCAGACCAGAGTCAGGACTCTAAA |
| 20 | CmaSPT20 | Cma_Chr10 | 2532615 | CTGCTTCCATTCAAACTCTGGTAT | CTGCTTCCATTCAAACTCTGGTAC | CCGCCATGTGTTTAGCTCTTAAAATGATT |
| 21 | CmaSPT21 | Cma_Chr10 | 5653457 | AGAACATCAATCGATAGAAGTGTTCTC | AGAACATCAATCGATAGAAGTGTTCTG | CGTTTTCCTCTCTCATACTCGTTCCTT |
| 22 | CmaSPT22 | Cma_Chr11 | 1387566 | GCGAATCGGCGCTTTGGGTCT | CGAATCGGCGCTTTGGGTCC | AACCCCGCGCGCCATTTCTCTA |
| 23 | CmaSPT23 | Cma_Chr11 | 6163595 | ATGTGTGACATGTGGCAGCAGA | ATGTGTGACATGTGGCAGCAGC | GCTATCGAACGACGTGGCTCGTT |
| 24 | CmaSPT24 | Cma_Chr11 | 11924019 | GAATCAGAAAGAAAACAATCAAAATCGG | GAATCAGAAAGAAAACAATCAAAATCGC | CTCGAGTTTCTCGAGTTCCTCGAAT |
| 25 | CmaSPT25 | Cma_Chr12 | 1621291 | CCATTGACTTCATCATGCTTTATCTTCA | CCATTGACTTCATCATGCTTTATCTTCT | CATAACGAGCAAACCAAAAGAACAGAGAA |
| 26 | CmaSPT26 | Cma_Chr12 | 5793362 | GCATAATTGATCCTAAATTGAATAGAAACAA | GCATAATTGATCCTAAATTGAATAGAAACAG | GGATGGAGATTTTGTGAATATTTGCTGATT |
| 27 | CmaSPT27 | Cma_Chr13 | 5235699 | GGTGTCAATGAGATTGAGTCGTCA | GTGTCAATGAGATTGAGTCGTCG | CTGATCGGTTGGCTGGTGAAATTCAT |
| 28 | CmaSPT28 | Cma_Chr14 | 4062455 | GATGCCAATTTTCCAAAGTTGATGGATT | GATGCCAATTTTCCAAAGTTGATGGATA | AACAAGAACAAGCTGCTCTAGAAAACGAT |
| 29 | CmaSPT29 | Cma_Chr14 | 5315189 | AGCAATTTCCAAAGCGAAGGCGTA | AGCAATTTCCAAAGCGAAGGCGTT | GAAGAACTCGAGAAGGATCACCGAA |
| 30 | CmaSPT30 | Cma_Chr14 | 13223193 | TGTCGCCAAGGCATTGTTCTTAGT | GTCGCCAAGGCATTGTTCTTAGG | AAGCTAGGGCAGAGACGATCGAATT |
| 31 | CmaSPT31 | Cma_Chr15 | 826428 | GAAGATAAAGCGAGAAATCCATACTTG | GAAGATAAAGCGAGAAATCCATACTTC | GAACACCTTTGTTGGCCTCTCTGAA |
| 32 | CmaSPT32 | Cma_Chr15 | 2898973 | AGCTCATTCATCCAGGGATCTTTCT | AGCTCATTCATCCAGGGATCTTTCA | GACTGTCAATTCTATCTTGTTGCCGAATA |
| 33 | CmaSPT33 | Cma_Chr16 | 3059938 | GCCATGGGGATCTTGTAATGCAA | GCCATGGGGATCTTGTAATGCAT | CGAGCTGGATCAAAGGAGTTTGTGAA |
| 34 | CmaSPT34 | Cma_Chr16 | 7003738 | ATGATATTTGTCAGGTTCGCTCCC | ATGATATTTGTCAGGTTCGCTCCG | GTTCGTAAGATATGCATGAAAGCAGCAAA |
| 35 | CmaSPT35 | Cma_Chr17 | 5410180 | AAGAAGCCGTGGTCACACCCAT | GAAGCCGTGGTCACACCCAC | GCGAAACTGATGAGTTACAATGCTCTTAA |
| 36 | CmaSPT36 | Cma_Chr17 | 9119655 | AAGATGTCTGTCCTCCATTTCAGGT | AAGATGTCTGTCCTCCATTTCAGGA | CTCGGAACCTAGAAATCGTTTGTAGTAAA |
| 37 | CmaSPT37 | Cma_Chr18 | 1727363 | GCCTGTTTTTCCTTCTCCCATTTGTT | CCTGTTTTTCCTTCTCCCATTTGTC | CGATCTTTTTCTGATGTTCGAAACGACAT |
| 38 | CmaSPT38 | Cma_Chr19 | 175180 | TGATCATATCTTGCAGCATCAGC | CTTGATCATATCTTGCAGCATCAGG | ACCTGGTGATGGCAGGGGAGAA |
| 39 | CmaSPT39 | Cma_Chr19 | 7705932 | CGAAGAAGGAAGAGGAGGCAGA | GAAGAAGGAAGAGGAGGCAGG | TCAAGCGAGTTCTTTCTTCCCCCAT |
| 40 | CmaSPT40 | Cma_Chr20 | 1671948 | AAATGCTTCGCTCATAAAGTTCGAGT | AATGCTTCGCTCATAAAGTTCGAGG | CTTTGTTAGAGTGCCAGATACTATGCAAT |
| 41 | CmaSPT41 | Cma_Chr20 | 2481036 | CGGTACCGGAGGATGTCAAAGAA | GGTACCGGAGGATGTCAAAGAG | CAGCATCAACTGCCACAACTGCAAA |
| 42 | CmaSPT42 | Cma_Chr20 | 3801765 | ACGTTGCCGCAGTTGACGGTA | CGTTGCCGCAGTTGACGGTG | CCTCCTCGCCTACGCCAACTAT |
상기 프라이머는 서양계 호박 순도 및 품종 판별을 위한 KASP 마커를 증폭시키기 위한 프라이머일 수 있다.
상기 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"는 PCR 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의 (homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 조성물을 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 키트는 PCR 키트, 마이크로어레이, 또는 KASP 키트일 수 있다.
상기 PCR 키트는 상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 PCR 키트는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 완충 용액을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 DNA 중합효소는 예를 들면, E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우(klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파아지 T7 중합효소인 것일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유하는 것일 수 있다. 또한 상기 PCR 키트는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분을 포함할 수 있다. 상기 PCR 키트는 안내서를 포함하는 것일 수 있다. 상기 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충 용액 제조방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물일 수 있다.
상기 마이크로어레이(microarray)는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 프로브가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것일 수 있다.
상기 KASP 분석용 키트는 KASP용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 것일 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 a) 서양계 호박 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하고, 서열번호 1 내지 42번으로 표시되는 각각의 염기서열의 61번째 위치에 존재하는 단일염기다형성 전부의 유전자형을 결정하는 단계; 및 b) 상기 단일염기다형성의 유전자형을 분석하여 서양계 호박의 순도 및 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별 방법을 제공한다.
상기 a) 단계에서는 시료로부터 분리된 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들어, 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 복제효소(replicase)를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 b) 단계에서는 분석된 단일염기다형성의 유전자형을 분석하여 서양계 호박의 순도 및 품종을 식별할 수 있다. 구체적으로, 서양계 호박 F1 의 분석된 단일염기다형성의 유전자형을 이의 양친 호박의 유전자형과 비교하여 순도 검정 및 품종을 판별하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 본 발명의 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 조성물은 서양계 호박 F1 품종을 판별할 수 있고, F1 종자의 순도를 검정하여 양친에 의한 교배 여부를 정확하고 신속히 판단할 수 있다.
따라서 본 발명은 서양계 호박 종자 분쟁 발생 시 품종의 진위성 검정과 품종보호 출원 시 대조 품종의 선정, 그리고 종자 유통 관리 등 다양한 방면에서 활용될 수 있다.
도 1은 서양계 호박 핵심계통 40개 중 38개에 대한 유전자형 분석 결과(A사 및 B사)(빨간색 : FAM 형광, 녹색 : HEX 형광, 파란색 : 이형접합형, 흰색 : 결측값)를 나타낸 것이다.
도 2는 서양계 호박 F1품종(5개) 및 양친 계통에 대한 유전자형 분석 결과(C사)를 나타낸 것이다.
도 3은 서양계 호박 육종에 활용되고 있는 다양한 육성재료 40계통에 대한 유전자형 분석 결과(A사, B사 및 D사)를 나타낸 것이다.
도 4는 서양계 호박 SNP 분자표지 활용한 유전자형 분석 결과(예시 : 4개 프라이머에 대한 결과)를 나타낸 것이다.
도 5는 효용성이 검정된 서양계 호박 SNP 42개 마커세트의 위치를 나타낸 물리적지도(파란색 : 효용성 검정된 42개 SNP 위치)를 나타낸 것이다.
도 6은 서양계 호박 핵심계통 및 육성재료(총 78개)에 대한 유전적 계통수 분석 및 분류 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 서양계 호박 핵심계통 및 육성재료(총 78개)에 대한 군집화(clustering) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 서양계 호박 F1 및 양친 계통(총 15개)에 대한 유전적 계통수 분석 및 분류 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 서양계 호박 F1품종(5개) 및 양친 계통에 대한 유전자형 분석 결과(C사)를 나타낸 것이다.
도 3은 서양계 호박 육종에 활용되고 있는 다양한 육성재료 40계통에 대한 유전자형 분석 결과(A사, B사 및 D사)를 나타낸 것이다.
도 4는 서양계 호박 SNP 분자표지 활용한 유전자형 분석 결과(예시 : 4개 프라이머에 대한 결과)를 나타낸 것이다.
도 5는 효용성이 검정된 서양계 호박 SNP 42개 마커세트의 위치를 나타낸 물리적지도(파란색 : 효용성 검정된 42개 SNP 위치)를 나타낸 것이다.
도 6은 서양계 호박 핵심계통 및 육성재료(총 78개)에 대한 유전적 계통수 분석 및 분류 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 서양계 호박 핵심계통 및 육성재료(총 78개)에 대한 군집화(clustering) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 서양계 호박 F1 및 양친 계통(총 15개)에 대한 유전적 계통수 분석 및 분류 결과를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
1-1. 시험 재료
서양계 호박의 다양한 육종 조합에 이용할 수 있는 SNP를 선발하기 위하여, 호박 자원 226개를 수집하였고 다양한 형질에서 특성이 중복되지 않는 서양계 호박 핵심계통 40개를 선발하였다(A사 및 B사 분양).
개발할 마커세트 검정을 위한 재료로 단호박, 대목(서양계) F1 5개 품종과 그것의 양친인 10계통, 그리고 나머지 육성계통 40개를 활용하였다 (A사, B사, C사, D사 분양).
1-2. 서양계 호박 핵심계통의 GBS 분석, 계통 간 SNP 탐색 및 선발
CTAB방법으로 고순도 gDNA를 분리하였고, Nanodrop을 이용하여 A260/280 값이 1.8이상이고 농도가 100ng/μL 이상의 기준에 충족함을 확인하였다.
제한효소 ApeKI를 이용하여 GBS 라이브러리를 구축하였으며, 해당 라이브러리를 Illumina Nextseq 500 장비를 이용하여 서양계 호박 핵심계통별로 염기서열 분석을 실시하였다.
SAM Tools 프로그램을 이용하여 핵심계통의 SNP calling을 진행하였고, SNP filtering을 진행하여 선발조건을 만족하는 SNP를 선발하였다.
1-3. KASP 마커세트 형태로 개발하여 종묘회사 육성 계통 및 F
1
품종에 적용
선발된 SNP는 KASPTM 유전자형 분석시스템 맞춤 프라이머(또는 탐침) 세트로 개발하였으며, 이를 활용하면 짧은 시간 내에 다수의 시료에 대한 다수의 분자표지 검정이 가능하다.
디자인된 SNP 마커세트는 핵심계통 40개 중 38개에 대하여 적용하였으며, 또한 F1 5개 품종과 그 양친인 10계통 그리고 서양계 호박 육종에 활용되고 있는 다양한 육성재료 40계통 대해 유전자형 분석을 실시하였다.
고속대량(high-throughput) 마커세트의 유전자형 분석 결과를 통해 서양계 호박 육종 시 활용되는 계통들 간의 다형성을 보이는 SNP를 추가로 선발하였으며,
각 계통별로 유전적 다양성(genetic diversity)을 분석하기 위해 유전적 계통수 분석을 실시하였다.
실시예 2: 연구 결과
2-1.
서양계 호박 핵심계통 선발 및 수집
호박 형질인 과크기, 과형, 과피색, 잎형태, 잎의 무늬 유무 및 초세 등에 다양한 특성이 포함되어 있는 226개 자원 중, 서양계 핵심계통으로 40개 선발하여 어린 잎(신초)을 수집하였다(A사 및 B사 분양).
2-2. 서양계 호박 핵심계통의 GBS 분석 및 SNP 탐색
고순도의 gDNA를 추출하여 GBS 라이브러리를 구축하기 위해 ApeKI 제한효소를 사용하여 read로 조각내었다. 조각 양 끝에 서로 다른 adapter를 붙이고 이를 T4 DNA ligase로 ligation 시켰다.
구축된 GBS 라이브러리의 염기서열에 대해 Illumina Nextseq 500 장비를 활용하여 호박 자원별로 시퀀싱을 실시하였으며, 이후 trimmomatic 프로그램을 통하여 adapter 서열을 제거하고 trimming 작업을 실시하였다. 그 결과 수집한 192자원(A사), 34자원(B사)에 대한 각각의 평균 reads 수는 1,765,076 및 2,523,739개였다.
Bowtie2 프로그램을 이용하여 표준유전체에 read mapping을 수행하였으며, 평균 overall read mapping rate는 A사는 84.0%, B사는 81.8%이었다.
VCFtools 프로그램을 이용하여 표준유전체와 수집한 호박 자원 중 서양계 자원(49개) 간의 유전체 변이 정보를 탐색하는 SNP calling을 실시하였으며, 그 결과 7,478개의 최종 SNP를 탐색하였다.
In-house scrip를 이용하여 각 염색체 별 SNP의 개수을 계산하였으며, 각 샘플별 home/hetero genotype의 비율 또한 계산하였다.
2-3. 고속대량 분석시스템(high-throughput) 맞춤 SNP 선발 및 마커세트 개발
A사 및 B사에서 탐색한 총 7,478개의 SNP를 depth가 5x 이상에 해당되는 유전자형 결과를 선발하고 계통 간 유전자형이 다른 것들을 SNP로 분류하여 총 2,659개의 SNP를 선발하였으며, 동형접합성이 0.96이상인 SNP를 2,128개 선발하였다.
선발된 SNP 중 순도검정 및 품종판별 등의 작업에 적합한 SNP를 고르기 위해 PIC(Polymorphism Information Content) 값이 약 0.35~0.5 값을 나타내며, 20개의 염색체에 균등하게 분포하는 SNP를 최종적으로 48개를 확보하였다.
SNP 위치에서 upstream 및 downstream 양방향으로 인접한 60bp 염기서열인 인접 염기서열(flanking 또는 amplicon sequence) 정보를 바탕으로 PCR 증폭을 하는 KASPTM 프라이머 (또는 탐침) 세트를 합성하였다.
2-4. 서양계 호박 계통 및 품종에 KASP 마커세트를 적용하여 효용성 검정
디자인한 48개 KASPTM 프라이머를 서양계 호박 품종개발에 활용되고 있는 다양한 육성계통 및 F1 품종에 대해 적용하여 효용성을 검정하였다.
핵심계통 40개 중 38개와 F1 5개 품종과 그 양친인 10계통, 그리고 서양계 호박 육종에 활용되고 있는 다양한 육성재료 40계통에 대해 유전자형 분석을 분석하였다(도 1 내지 3).
분석결과, 개발된 48개 KASPTM 마커세트 중에 대부분의 계통에서 이형접합성(heterozygote) 유전자형을 나타내거나 형광 탐침으로 탐지하기 모호한 6개를 제외한 42개가 분자표지로서 기능함을 확인하였다(도 4). 효용성이 검정된 SNP 마커세트 42개에 대한 물리적 지도를 작성하였다(도 5).
유전자형 분석으로 효용성이 검정된 최종 42개 KASP 마커세트에 대한 정보를 나타내었다 (표 1).
F1 품종과 육성계통들의 다형성 있는 유전자형 분석 결과를 통해, 개발된 42개의 서양계 호박 SNP 마커세트를 이용하여 순도검정 및 품종판별에 활용할 수 있음을 확인하였다(도 1 내지 3).
분석에 사용된 각 계통들의 유전적 다양성을 분석하기 위해 유전적 계통수(Phylogenetic tree, Dendrogram) 분석을 실시하였다. 계통 발생 분석은 계층적 클러스터링(hierarchical clustering) 방법 중 산술평균을 사용하는 비가중 쌍 그룹 방법(unweighted pair group method with arithmetic mean)을 사용하여 Darwin6 소프트웨어(ver. 6.0.10)(http://darwin.cirad.fr/)에서 수행하였다. 부트스트랩(bootstraps)은 1,000 반복(replicates)으로 결정하였다.
A사 및 D사에서 분양받은 서양계 호박 핵심계통 및 육성재료에 대한 유전적 다양성 분석 결과 크게 2그룹으로 분류되었다. 첫 번째 그룹에서는 서양계 호박 중 주로 식용재료(단호박 등)인 계통이 포함되었고, 두 번째 그룹에서는 대목으로 사용되는 육성재료가 다수 포함되었다 (도 6).
그리고 Darwin6 소프트웨어에서 Factorial analysis를 통해 핵심계통 및 육성계통들의 분포도를 분석하였는데, 유연관계 분석처럼 크게 2가지의 그룹으로 분류되는 것을 확인하였다 (도 7).
B사 및 C사에서 분양받은 서양계 호박 F1 및 양친 계통 총 15개에 대하여 총 42개의 마커세트를 이용하여 유전적 다양성을 분석하였다. F1 및 양친 계통 모두 유전적으로 유사하나 분류되었다 (도 8).
상기한 결과들을 요약하면 다음과 같다:
다양한 형질(과형태, 과색, 엽회반 및 초세 등)의 특성을 가지는 서양계 호박 핵심계통을 40개를 선발하였고, 어린 잎에서 DNA를 추출하여 ApeKI 제한효소를 이용하여 GBS 라이브러리를 구축하였다. 해당 염기서열은 Illumina Nextseq 500을 활용하여 분석하였다.
염기서열 신뢰도(depth), 다형성지수(PIC, polymorphism information content), 동형접합성, 분리비, SNP 근접 정도 등의 기준에 따라 335개의 SNP를 선발하였으며 KASPTM 유전자형 분석시스템 맞춤 48개의 SNP 프라이머(또는 탐침) 세트를 개발하였다.
개발된 마커세트는 95개 자원 중 93개 자원에 적용하였다. 핵심계통 40계통 중 38계통에 적용하였고, 또한 종묘회사에서 육종에 활용되고 있는 단호박, 대목(서양계) 등 육성계통 총 40개와 서양계 F1 및 양친 계통 15개에 대하여 검정한 결과, 총 48개 중에 42개의 프라이머(또는 탐침)가 분자표지로서 기능함을 확인하였다.
최종적으로 효용성이 검정된 42개의 마커세트는 각각의 육성계통에 대해 유전자형을 검정할 수 있기 때문에 종자의 순도검정 및 품종의 판별 등에 활용할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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<120> SNP MARKER SET FOR IDENTIFYING CUCURBITA MAXIMA CULTIVARS AND
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ratgcttctc atgggagtca cgtggatgct tctgctaaag gtgaaacgta cggccagcag 120
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cacaagagga caccagaaat taccaagttc aacttgtacg cacttacaca agaagagttt 60
wtagggaaag aaaatgggac actagccaaa acaaaactta ttttacctgg ggctgcaggg 120
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<223> CmaSPT35
<400> 35
tatgatcagc tctctctttc gaccaatgtt gagtgtgcaa agaagccgtg gtcacaccca 60
ygctcgcttc attaccaaaa ttaagagcat tgtaactcat cagtttcgcg cctccgtcgc 120
t 121
<210> 36
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CmaSPT36
<400> 36
ggaactcgga acctagaaat cgtttgtagt aaaatagatg ataatgagca attaggaatt 60
wcctgaaatg gaggacagac atcttggatt catgtggcag aagtccacac gcagtaattg 120
g 121
<210> 37
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CmaSPT37
<400> 37
tctctttttc tttgccctgc tgcacgatct ttttctgatg ttcgaaacga cattttaaaa 60
racaaatggg agaaggaaaa acaggctagt ttatccatta cgagtgagct ttattctcat 120
a 121
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<212> DNA
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<220>
<223> CmaSPT38
<400> 38
gtaaaagaaa tttgatgaga actagagaag attatcatac ctggtgatgg caggggagaa 60
sctgatgctg caagatatga tcaagaccaa cgttaaaact cataaaatct aagaaattgt 120
t 121
<210> 39
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<212> DNA
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<220>
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<400> 39
ggatgcgggc aataagaggt atagattgaa gggaggtttc gaagaaggaa gaggaggcag 60
rgatggggga agaaagaact cgcttgaaga gaagccatgc taattcgggg cttttggaat 120
t 121
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<212> DNA
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ttctcacctt tagaatagcc acctttcata caatcaaatg cttcgctcat aaagttcgag 60
ktctttttat tgcatagtat ctggcactct aacaaagatt ttccatcttc cagcagtata 120
t 121
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<211> 121
<212> DNA
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<220>
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<400> 41
tgattctggt caagatgagt tcgattacga ctcgactccg gtaccggagg atgtcaaaga 60
rggacatttt gcagttgtgg cagttgatgc tgaggagccg aaacggtttg ctgttccgtt 120
g 121
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<212> DNA
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<220>
<223> CmaSPT42
<400> 42
gcgcttggct tggctacgga gggcggcagg accgactacg acgttgccgc agttgacggt 60
rgcggaggtg cggtcgagat agttggcgta ggcgaggagg aggaaggtga tggaggtggc 120
g 121
Claims (6)
- 서열번호 1 내지 42의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 전부를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 1 내지 42번의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 부위를 포함하는 5 내지 121개의 연속염기, 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 제제는 프로브, 프라이머, 및 이들의 조합 중 어느 하나인 것인, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 조성물.
- 제 1 항의 조성물을 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 키트.
- 제 4 항에 있어서, 상기 키트는 PCR 키트, 마이크로어레이, 또는 KASP 키트인 것인, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별용 키트.
- a) 서양계 호박 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하고, 서열번호 1 내지 42번으로 표시되는 각각의 염기서열의 61번째 위치에 존재하는 단일염기다형성 전부의 유전자형을 결정하는 단계; 및
b) 상기 단일염기다형성의 유전자형을 분석하여 서양계 호박의 순도 및 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020210170195A KR102646426B1 (ko) | 2021-12-01 | 2021-12-01 | 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별을 위한 단일염기 다형성 마커세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
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Citations (5)
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| KR20150047016A (ko) * | 2013-10-23 | 2015-05-04 | 대한민국(국립종자원장) | 초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법 |
| KR20190045190A (ko) * | 2017-07-31 | 2019-05-02 | 타키이 슈뵤우 가부시키가이샤 | 서양 호박 식물의 흰가루병 저항성 마커, 흰가루병 저항성 서양 호박 식물, 그것을 이용한 흰가루병 저항성 서양 호박 식물의 제조 방법 및 서양 호박 식물에 대한 흰가루병 저항성의 부여 방법 |
| KR102264690B1 (ko) | 2020-06-18 | 2021-06-14 | 세종대학교산학협력단 | 호박 품종 식별용 마커 조성물 및 이를 이용한 식별 방법 |
| KR20220086087A (ko) * | 2020-12-16 | 2022-06-23 | 대한민국(농촌진흥청장) | 서양계 호박의 여교배 세대단축 육종을 위한 단일염기 다형성 마커세트 및 이의 용도 |
| KR20230040663A (ko) * | 2021-09-16 | 2023-03-23 | 대한민국(농촌진흥청장) | 호박 품종 식별용 마커 조성물 및 이를 이용한 식별 방법 |
-
2021
- 2021-12-01 KR KR1020210170195A patent/KR102646426B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (5)
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