CN118186141A - 一种与南瓜瓜把长度主效qtl紧密连锁的snp位点、分子标记、引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与南瓜瓜把长度主效QTL紧密连锁的SNP位点、分子标记、引物对及其应用，属于植物分子遗传育种领域。所述SNP位点位于南瓜11号染色体的2718950bp处，其多态性为G/C。所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，在所述核苷酸序列第24bp处存在G/C碱基突变。所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物R。本发明提供的分子标记可对南瓜进行基因型鉴定，通过基因型来准确和高效的筛选出短把或长把的南瓜品种。

Description

一种与南瓜瓜把长度主效QTL紧密连锁的SNP位点、分子标记、 引物对及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子遗传育种领域，特别是涉及一种与南瓜瓜把长度主效QTL紧密连锁的SNP位点、分子标记、引物对及其应用。

背景技术

南瓜(Cucurbita moschata Duch)是重要经济作物，既可以菜粮兼用又可以深加工成高附加值产品。南瓜果实腔顶端到瓜蒂处长度可以表征南瓜的瓜把长度，瓜把长度是南瓜重要的商品性状，不仅直接影响果实的大小与形状，也影响果实的商品品质和产量。无把南瓜的均一性好于有把南瓜。

南瓜瓜把长度和果实形状的变化受到多种因素的影响，是一个有多个数量性状遗传位点、激素和环境因子共同调控的复杂过程。许多调控果实长度的重要基因和QTLs已经在一些园艺作物中被报道。然而，到目前为止，关于果实长度的遗传分析与基因定位研究多集中在番茄、黄瓜等模式植物上，而调控南瓜瓜把长度和果实形状的基因仍不清楚，从而导致在应用上缺乏与南瓜瓜把长度性状紧密连锁且操作性较强的分子标记来辅助南瓜品质育种的工作。因此，在南瓜分子标记辅助选择南瓜育种方面，仍需进一步确定调控南瓜瓜把长度的目标基因，并开发稳定高通量的分子标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种与南瓜瓜把长度主效QTL紧密连锁的SNP位点、分子标记、引物对及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的分子标记与南瓜瓜把长度呈现高度紧密连锁的特征，再利用KASP技术获得SNP分型，能够准确且高效地鉴定南瓜瓜把长度性状。同时，该分子标记可用于南瓜分子标记辅助选择育种，可以加速南瓜优良品种的育种进程。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供SNP位点在鉴定南瓜瓜把长短的品种中的应用，所述SNP位点位于南瓜11号染色体的2718950bp处，其多态性为G/C。

本发明还提供一种与南瓜瓜把长度主效QTL紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，在所述核苷酸序列第24bp处存在G/C碱基突变。

本发明还提供用于检测所述的SNP分子标记的KASP引物组，所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物R。

本发明还提供一种所述的SNP分子标记的检测试剂或检测试剂盒，包含所述的KASP引物组。

本发明还提供所述的KASP引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒在鉴定南瓜瓜把长短的品种中的应用。

本发明还提供一种鉴定南瓜瓜把长短的品种的方法，包括：

以待测南瓜样品基因组DNA为模板，利用所述的KASP引物组对模板进行PCR扩增，根据扩增结果进行基因型分型鉴定；

若鉴定的基因型为CC，则所述待测南瓜为瓜把长的品种，若鉴定的基因型为GG，则所述待测南瓜为瓜把短或无瓜把的品种。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板10-100ng，2×PARMS Master mix5μL，上游引物F10.15μL，上游引物F20.15μL，下游引物R 0.4μL，H₂O补足至10μL；

所述PCR扩增的反应程序为：94℃热启动激活15min；94℃变性20s，65-57℃梯度复性/延伸60s，每个循环降0.8℃，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸60s，32个循环。

本发明还提供所述的KASP引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒在以下任一项中的应用：

筛选或预测南瓜瓜把长短的品种；

改良南瓜种质资源；

分子标记辅助选育南瓜瓜把长度不同的品种。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以实验室收集的268份南瓜材料作为自然群体材料，利用高通量测序技术，对南瓜瓜把长度性状的全基因组关联分析，开发与南瓜果实把长紧密连锁的SNP位点以及分子标记，在南瓜11号染色体2718950bp处发现一处与南瓜瓜把长度主效QTL紧密连锁的SNP位点，并根据该SNP位点开发出一段分子标记。该SNP位点和分子标记能够用于建立无把或短把南瓜果实的辅助选择育种体系，加速南瓜优良种质的育种进程。

本发明首次公开了与南瓜瓜把长度紧密连锁的分子标记，该分子标记可对南瓜进行基因型鉴定，通过基因型来准确和高效的筛选出短把或长把的南瓜品种。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为部分GWAS南瓜群体瓜把长度图，其中，A为长瓜把和短瓜把极端差异的个体外观横截切面图，B为部分GWAS南瓜群体瓜把长度数据图；

图2为南瓜瓜把长度性状全基组关联分析图，其中，A为曼哈顿图，为遗传标记效应值即经F检验的全基因组P值按染色体上物理位置排序图，横坐标为基因组坐标，纵坐标-log₁₀P，P值越小关联性越强，表现为纵坐标越大，B为关联分析Quantile-Quantile图；

图3为SNP位点在瓜把长度极端差异的44份遗传背景较远的自然群体中的KASP标记基因分型图，无把或短把个体聚团在靠近X轴的位置(纯合GG基因型，蓝点)，极端长把个体聚团在靠近Y轴的位置(纯合CC基因型，绿点)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1与南瓜瓜把长度主效QTL紧密连锁的SNP分子标记的获得

1、GWAS种质资源信息

1.1材料与试剂

本发明所用的中国南瓜的自然群体共有268个材料，来自于中国的有214份，来自于国外的有54份。

1.2瓜把长度在GWAS群体里的变异范围

成熟南瓜果实收获后沿横截面切开，量取果实腔顶端到瓜蒂处长度表征瓜把长度。瓜把长度范围从0cm到30cm(图1)。

2、南瓜瓜把长度性状全基因组关联分析

2.1基因DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB法)对268份自然群体的基因组DNA进行提取，2％琼脂糖凝胶电泳检测提取质量与DNA浓度，将浓度稀释至50～100ng/μL待用。

2.2重测序数据的分析

基于二代重测序平台Illumina Hi-Seq，对GWAS群体建库和重测序，经过DNA质检，建库，上机测序并过滤，最终得到clean reads data共1452.15Gb，平均每个样品5.37GB，对基因组的平均测序深度达到：16.58×，测序最大深度为：30.6，最低深度为：9.28。比对中国南瓜参考基因组，计算得到所有样品比对的平均覆盖度为：96.38％，最低覆盖度为：68.78％，最高覆盖度为：99.37％。经过滤得到了1,157,313个高质量SNP位点。并且染色体上的SNP的平均密度为0.2Kb/SNP。重测序数据表明，数据的深度以及质量可以满足在后续的研究中使用。

2.3南瓜瓜把长度全基因组关联分析

利用GEMMA分析软件，采用混合线性模型(Mixed Linear Model,MLM)对相关性状进行关联分析，通过关联的显著度(P-value)，筛选出潜在的候选SNPs。运行分析得出与瓜把长度关联的SNP的P值，manhattan plot图中设定-log₁₀(P)≥10值为紧密关联SNP，瓜把长度显著关联到11号染色体的一个区段，此位点的-log₁₀(P)＝11.73(图2)。该SNP位点位于南瓜基因组(Cucurbita moschata(Rifu)Genome，http://cucurbitgenomics.org/organism/9)11号染色体2718950bp处，其多态性为G/C，短把或无把为G，长把为C。

实施例2KASP技术用于南瓜瓜把长度的基因分型

本发明设计了扩增实施例1中SNP位点的特异性引物对，包括两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物，两条正向引物5’端分别连有不同的检测接头序列；该组特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示；

正向引物序列由通用接头序列、普通扩增引物序列和分型位点序列三部分组成，具体如下所示：

上游引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCGACAAGAACCAATATTAATTC G-3’，SEQID NO.1，其中加粗斜体部分为FAM标签序列；

上游引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCGACAAGAACCAATATTAATTC C-3’，SEQID NO.2，加粗斜体部分为HEX标签序列；

下游引物R：5’-TCGATCAATTTCATCAATGATTTTC-3’，SEQ ID NO.3。

以待测南瓜基因组DNA为模板，利用上述特异性引物组和通过KASP技术对南瓜瓜把长度进行基因分型。

反应体系为：DNA(10-100ng)，2×PARMS Master mix(5μL)，primer mix(0.7μL)[F1(0.15μL)，F2(0.15μL)，R(0.4μL)]，H₂O(N/A)，Total reaction volume(10μL)。

反应程序：94℃热启动激活15min；94℃(20sec)，65-57℃(60sec)，每个循环降0.8℃，10个循环；94℃(20sec)，57℃(60sec)，32个循环。

反应结束后由TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号以图表的形式呈现出来，根据颜色不同，输出基因型结果，图表分为X，Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起。靠近X，Y轴的是纯合基因型(蓝点FAM，绿点HEX表示)，靠近对角线位置的是杂合基因型(红点FAMHEX表示)。短把或无把材料基因型为G，在靠近X轴的位置(蓝点FAM)，长把材料基因型为C，在靠近Y轴的位置(绿点HEX)。

其中，PCR产物片段序列：CCGACAAGAACCAATATTAATTCNTGGAAATTAGACAAG GAAATAAGAAAATCATTGATGAAATTGATCGA(SEQ ID NO.4)；其中，该序列第24位碱基位置为SNP位点，该位置多态性为G/C。

选取在268份自然群体中瓜把长度极端差异的44份材料，长度如表1所示，其中长把材料24份，短把或无把材料20份，为证实本发明筛选的分子标记的检测准确性，采用此KASP标记对此群体进行分型，分型结果如表1和图3所示：短把和无把个体聚团在靠近X轴的位置(纯合GG，蓝点)，极端长把的个体聚团在靠近Y轴的位置(纯合CC，绿点)。证明该SNP标记与性状紧密连锁。

表144份南瓜瓜把长度及SNP标记对应的基因型

综上所述可知，本发明以实验室收集的268份南瓜材料作为自然群体材料，利用高通量测序技术，对南瓜瓜把长度性状的全基因组关联分析，开发与果实长度紧密连锁的SNP位点以及分子标记。该SNP位点和分子标记能够用于建立无把或短把南瓜果实的辅助选择育种体系，加速南瓜优良种质的育种进程。由此可见，本发明提供的SNP位点、分子标记、用于扩增该分子标记的KASP引物组以及检测该分子标记的试剂或试剂盒能够用于预测南瓜瓜把长度、改良南瓜种质资源以及南瓜育种。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.SNP位点在鉴定南瓜瓜把长短的品种中的应用，其特征在于，所述SNP位点位于南瓜11号染色体的2718950bp处，其多态性为G/C。

2.一种与南瓜瓜把长度主效QTL紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，在所述核苷酸序列第24bp处存在G/C碱基突变。

3.用于检测权利要求2所述的SNP分子标记的KASP引物组，其特征在于，所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物R。

4.一种权利要求2所述的SNP分子标记的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的KASP引物组。

5.权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂或检测试剂盒在鉴定南瓜瓜把长短的品种中的应用。

6.一种鉴定南瓜瓜把长短的品种的方法，其特征在于，包括：

以待测南瓜样品基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的KASP引物组对模板进行PCR扩增，根据扩增结果进行基因型分型鉴定；

若鉴定的基因型为CC，则所述待测南瓜为瓜把长的品种，若鉴定的基因型为GG，则所述待测南瓜为瓜把短或无瓜把的品种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板10-100ng，2×PARMS Master mix 5μL，上游引物F10.15μL，上游引物F20.15μL，下游引物R0.4μL，H₂O补足至10μL；

所述PCR扩增的反应程序为：94℃热启动激活15min；94℃变性20s，65-57℃梯度复性/延伸60s，每个循环降0.8℃，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸60s，32个循环。

8.权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂或检测试剂盒在筛选或预测南瓜瓜把长短的品种中的应用。

9.权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂或检测试剂盒在改良南瓜种质资源中的应用。

10.权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂或检测试剂盒在分子标记辅助选育南瓜瓜把长度不同的品种中的应用。