CN117887895A - 南瓜果实长度性状的kasp分子标记及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一个南瓜果实长度性状的KASP分子标记及其用途，本发明设计开发的与南瓜果实长度性状紧密连锁的KASP分子标记，可以进行南瓜早期（种子）果实长度品种的初步筛选，以达到分子标记辅助育种的目的。另外，将短果材料MBF和长果材料KG1进行杂交，然后回交、自交结合分子标记辅助选择，选择分离群体中适宜果实长度的单株用于育种改良，可以定向选择和改良南瓜果实长度和产量，加速果实长度目标性状的分子育种进程。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜品质性状分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，涉及南瓜果实长度快速筛选和分子标记辅助育种，具体涉及一种南瓜果实长度性状的KASP分子标记及其用途。
背景技术
南瓜(Cucurbita moschata Duch)是一种重要的园艺作物。果实长度是南瓜重要的商品性状，不仅直接影响果实的大小与形状，也影响果实的商品品质和产量。由于不同的消费者对果实形状、大小的偏好不同，培育不同果型的南瓜新品种对育种工作来说具有重大意义。因此，阐明南瓜果实长度和形态建成的遗传规律、定位南瓜果实长度相关功能基因是提高南瓜产量和商品品质的重要基础。
果实长度和形状的变化受到多种因素的影响，是一个有多个数量性状遗传位点、激素和环境因子共同调控的复杂过程（Liu JP, Van Eck J, Cong B, Tanksley SD(2002) A new class of regulatory genes underlying the cause of pear-shapedtomato fruit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 99:13302-13306）。许多调控果实长度的重要基因和QTLs已经在一些园艺作物中被报道。在番茄中，OVATE 和 SUN被报道调控果实伸长。在辣椒、茄子、黄瓜、西瓜等园艺作物中，也定位到了这两个基因的直系同源基因或同基因家族成员，影响相关物种的果实长度。然而，到目前为止，关于果实长度的遗传分析与基因定位研究多集中在番茄、黄瓜等模式植物上，而调控南瓜果实长度的基因仍不清楚，从而导致在应用上缺乏与南瓜果实长度性状紧密连锁且操作性较强的分子标记来辅助南瓜品质育种的工作。因此，在南瓜分子标记辅助果实长度及品种育种方面，仍需进一步确定调控南瓜果实长度的目标基因，并开发稳定高通量的分子标记。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一个南瓜果实长度性状的KASP分子标记及其用途；所述KASP分子标记CmoFL (Fruit length)与南瓜果实长度性状紧密连锁，该分子标记能用于鉴定筛选不同南瓜果实长度材料及其后代的辅助选择育种。
本发明的第一方面，提供了一种基于BSA混池测序定位的南瓜果实长度性状基因设计的用于鉴定不同南瓜果实长度的KASP分子标记；
所述KASP分子标记为SNP标记，位于南瓜14号染色体的815954 bp处；分子标记对应的扩增序列如SEQ ID NO.1所示：
AACCCACATTAACCCTTTCATTTCATATAAATATTTGAGAATTTAGCTCTnGAAAAAGAAAAAGATTTAATTTAACATTT
其中下划线对应的n是SNP位点，n的基因型是T/G，T基因型对应的表型为长果，G基因型对应的表型为短果。
本发明的第二方面，还提供了用于检测南瓜果实长度性状的KASP分子标记CmoFL的引物组合，引物组合包括：
正向引物F1：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAATGTTAAATTAAATCTTTTTCTTTTTCA-3’
正向引物F2：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAATGTTAAATTAAATCTTTTTCTTTTTCC-3’
反向引物R：
5’- AACCCACATTAACCCTTTCA-3’。
本发明的第三方面，还同时提供了上述分子标记的用途，用于鉴定南瓜果实长度，辅助不同南瓜果实长度材料或其后代的选择育种。
在一个具体的实施案例中，具体为：
（1）提取待测南瓜样本的基因组DNA；
（2）利用引物组合对获得的基因组 DNA 进行 PCR 扩增；
（3）检测PCR扩增结果的荧光信号判断待测南瓜的果实长度。其中，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F1的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合TT基因型，表型为长果；若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F2的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合GG基因型，表型为短果。
本发明的第四方面，还提供了南瓜中果实长度性状连锁的单核苷酸多态性鉴定方法，包括以下步骤：
(1) 以长果南瓜材料KG1和短果南瓜材料MBF为亲本进行杂交，然后自交，构建遗传分离群体F2，从而获得不同果实长度分离的F2单株；
(2) 用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取南瓜亲本幼苗及杂交后代F2群体幼苗基因组DNA；
(3) 采用BSA(分离群体分析，Bulked Segregant analysis)定位与南瓜果实长度性状相关的区域或基因。
(4) 鉴定与南瓜果实长度性状紧密连锁的单核苷酸多态性序列。
本发明的第五方面，还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：
(1) 以长果南瓜材料KG1和短果南瓜材料MBF为亲本进行杂交，然后自交，从而获得不同果实长度分离的F2群体；
(2) 用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取南瓜亲本幼苗及杂交后代F2群体幼苗基因组DNA；
(3) 挑选F2群体中极端果实长度材料构建长果、短果混池，采用BSA(分离群体分析，Bulked Segregant analysis)定位与南瓜果实长度性状相关的区域。
(4) 鉴定与南瓜果实长度性状紧密连锁的SNP变异和InDel插入缺失变异。
(5) 基于连锁的变异，采用KASP (竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，Kompetitive Allele Specific Polymerase Chain Reaction)方法进行南瓜果实长度性状分子标记的筛选；
(6) 开发出一个与南瓜果实长度性状紧密连锁的KASP分子标记CmoFL，KASP分子标记引物组合由正向引物F1、F2和反向引物R组成。引物组合可委托上海生工生物工程股份有限公司合成，在ABI Step One PCR仪上进行扩增。
本发明的第五方面，还提供一种鉴定南瓜果实长度的方法，具体是：
（1）提取待测南瓜样本的基因组DNA；
（2）利用所述的引物组合对获得的基因组DNA进行PCR扩增；
（3）检测PCR扩增结果的荧光信号判断待测南瓜的果实长度。其中，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F1的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合TT基因型，表型为长果；若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F2的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合GG基因型，表型为短果。
进一步地，步骤（2）中，扩增结束后，检测荧光信号并分析基因分型情况。若分型不充分，则可以继续扩增。94℃，20秒（变性）；55℃，退火60s秒，3个循环。30℃，1分钟（读取荧光信号）。每增加3个循环读取荧光信号查看分型情况，直至完全分型。
进一步地，步骤（2）中，PCR反应体系为：20-50 ng/μl南瓜基因组DNA 5.0 μl，KASPMaster Mix 5.0 μl，KASP Assay Mix(F1：F2：R＝2:2:5的体积比，三种引物浓度均为10ng/μl)0.14 μl，总体积为10.14 μl；
PCR反应程序为：30℃，1分钟（读取荧光信号）；94℃，15分钟（预变性）；94℃，20秒（变性）；61℃（-0.6℃/循环）退火60秒，10个循环；94℃，20秒（变性）；55℃，退火60s秒，35个循环。30℃，1分钟（读取荧光信号）。
本发明的有益效果是：
本发明设计开发的与南瓜果实长度性状紧密连锁的KASP分子标记，可以进行南瓜早期（种子）果实长度品种的初步筛选，以达到分子标记辅助育种的目的。另外，将短果材料MBF和长果材料KG1进行杂交，然后回交、自交结合分子标记辅助选择，选择分离群体中适宜果实长度的单株用于育种改良，可以定向选择和改良南瓜果实长度和产量，加速果实长度目标性状的分子育种进程。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是基于BSA的调控南瓜果实长度的基因在染色体上的定位。
图2是亲本材料KG1和MBF及其F1代的CmoFL分子标记的分型图；
其中KG1的基因型是TT，表现为蓝色；MBF的基因型是GG，表现为红色；F1的基因型是T/G，表现为绿色。
图3是不同基因型南瓜F2代群体的CmoFL分子标记的分型图；
其中蓝色表示与长果材料KG1一致的TT基因型；红色表示与短果材料MBF一致的GG基因型；绿色表示与F1一致的T/G基因型。
图4是不同基因型南瓜F2分离群体的果实长度的分布统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、南瓜果实长度性状主效QTL定位
从中国作物种质资源信息库中选择亲本材料。KG1为长果类型南瓜材料，平均果实长度为107.13 cm；MBF为短果类型南瓜材料，平均果实长度为12.25 cm。利用上述亲本杂交后自交，构建遗传分离群体F2，获得不同果实长度分离的单株。
用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取南瓜亲本材料幼苗及杂交后代F2群体幼苗基因组DNA；挑选子代极端表型材料构建BSA混池，进行基因组重测序，通过△All-index方法进行关联分析，选取95%置信区间，定位到一个位于14号染色体718001-1711000的区间，如图1所示。
实施例2、南瓜果实长度性状KASP分子标记开发
根据实施例1的基因定位结果，对亲本材料在14号染色体区间内的SNP和InDel进行提取分析，并利用KASP技术开发出相关的分子标记，用于精细定位。具体如下：
经过分子标记的筛选，最终获得与南瓜果实长度性状紧密连锁的KASP分子标记CmoFL。所述分子标记为SNP标记，其中，SNP标记位于南瓜14号染色体的815954 bp处；分子标记对应的扩增序列如SEQ ID NO.1所示：
AACCCACATTAACCCTTTCATTTCATATAAATATTTGAGAATTTAGCTCTnGAAAAAGAAAAAGATTTAATTTAACATTT
其中下划线对应的n是SNP位点，n的基因型是T/G，T基因型对应的表型为长果，G基因型对应的表型为短果。
根据分子标记设计引物组合序列如下：
正向引物F1（SEQ ID NO.2）：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAATGTTAAATTAAATCTTTTTCTTTTTCA-3’
正向引物F2（SEQ ID NO.3）：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAATGTTAAATTAAATCTTTTTCTTTTTCC-3’
反向引物R（SEQ ID NO.4）：
5’-AACCCACATTAACCCTTTCA-3’。
正向引物F1和F2前分别设置了各自的荧光接头（在分型图上显示为不同颜色，本实施例中TT基因型为蓝色、GG基因型为红色、T/G基因型为绿色）。如果检测的材料是纯合基因型，则在扩增时只会选择其中对应的一个引物进行扩增（例如，纯合TT基因型只能与F1发生反应）。最后根据荧光差异，分辨出所测材料是纯合TT基因型还是GG基因型。如果检测的材料是杂合基因型的，那么两个引物均会发生扩增，则产生的荧光信号不同于纯合基因型的材料，从而实现杂合基因型的区分。
实施例3、南瓜果实长度性状KASP分子标记在南瓜亲本材料及后代F1群体中的验证
一、DNA提取
用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取南瓜亲本材料幼苗及杂交后代F1群体幼苗基因组DNA。
二、PCR扩增
直接在ABI Step One PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为：20-50 ng/μl南瓜基因组DNA 5.0 μl，KASP Master Mix 5.0 μl，KASP Assay Mix(F1：F2：R＝2:2:5的体积比，三种实施例2设计的引物浓度均为10 ng/μl)0.14 μl，总体积为10.14 μl；
PCR反应程序为：30℃，1分钟（读取荧光信号）；94℃，15分钟（预变性）；94℃，20秒（变性）；61℃（-0.6℃/循环）退火60秒，10个循环；94℃，20秒（变性）；55℃，60s秒（退火），35个循环。30℃，1分钟（读取荧光信号）。
仪器检测荧光信号后可直接获得基因分型情况，所得结果如图2所示，该分子标记能在不同果实长度的亲本材料中有明显的分型，可以根据荧光信号的不同来判断基因型。其中长果南瓜材料KG1为纯合基因型TT，在图中表现为蓝色；短果南瓜材料MBF为纯合基因型GG，在图中表现为红色；KG1和MBF杂交F1代表现为杂合的T/G基因型，在图中表现为绿色。由此表明，KASP分子标记CmoFL能用于长果南瓜材料KG1和短果南瓜材料MBF及其后代群体的基因型鉴定。
实施例4、南瓜果实长度性状KASP分子标记在后代F2分离群体中的验证
一、DNA提取
用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取南瓜亲本材料幼苗及杂交后自交F2群体幼苗基因组DNA。
二、PCR扩增
直接在IntelliQube高通量基因分型平台上进行PCR扩增，PCR扩增PCR反应体系为：10-50 ng/μl南瓜基因组DNA 0.8 μl，KASP Master Mix 0.8 μl，KASP Assay Mix(F1：F2：R＝2:2:5的体积比，三种实施例2设计的引物浓度均为100 ng/μl)0.02 μl，总体积为1.62 μl；
PCR反应程序为：30℃，1分钟（读取荧光信号）；94℃，15分钟（预变性）；94℃，20秒（变性）；61℃（-0.6℃/循环）退火60秒，10个循环；94℃，20秒（变性）；55℃，60s秒（退火），35个循环。30℃，1分钟（读取荧光信号）。
仪器检测荧光信号后可直接获得基因分型情况，所得结果如图3所示。利用CmoFL分子标记在后代F2分离群体中进行分型，F2单株均能实现充分分型。根据荧光信号来判定F2单株的基因型，则与长果亲本KG1同为蓝色对应单株的基因型为TT，与短果亲本MBF同为红色对应单株的基因型为GG，与F1代同为绿色对应单株的基因型为T/G。根据图4所示，结合F2单株的果实长度表型进行分析，在F2分离群体中，TT基因型单株的果实长度显著高于GG基因型单株的果实长度。由此说明，KASP分子标记CmoFL与南瓜果实长度性状紧密连锁，可以用于不同南瓜果实长度材料的基因型鉴定。
另外，将短果材料MBF和长果材料KG1进行杂交，然后回交、自交结合分子标记辅助选择，选择分离群体中适宜果实长度的单株用于育种改良，可以定向选择和改良南瓜果实长度和产量。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一个南瓜果实长度性状的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记为SNP标记，位于南瓜14号染色体的815954 bp处；KASP分子标记对应的扩增序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种检测南瓜果实长度性状的KASP分子标记的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：
正向引物F1：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAATGTTAAATTAAATCTTTTTCTTTTTCA-3’
正向引物F2：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAATGTTAAATTAAATCTTTTTCTTTTTCC-3’
反向引物R：
5’- AACCCACATTAACCCTTTCA-3’。
3.一种权利要求1所述南瓜果实长度性状的KASP分子标记或权利要求2所述检测南瓜果实长度性状的KASP分子标记的引物组合在鉴定南瓜果实长度中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，具体为：
（1）提取待测南瓜样本的基因组DNA；
（2）利用引物组合对获得的基因组 DNA 进行 PCR 扩增；
（3）检测PCR扩增结果的荧光信号判断待测南瓜的果实长度；其中，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F1的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合TT基因型，表型为长果；若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F2的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合GG基因型，表型为短果。
5.一种鉴定南瓜果实长度的方法，其特征在于，包括：
（1）提取待测南瓜样本的基因组DNA；
（2）利用如权利要求2所述的引物组合对获得的基因组DNA进行PCR扩增；
（3）检测PCR扩增结果的荧光信号判断待测南瓜的果实长度；其中，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F1的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合TT基因型，表型为长果；若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F2的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合GG基因型，表型为短果。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增采用的PCR反应体系为：20-50 ng/μl南瓜基因组DNA 5.0 μl，KASP Master Mix 5.0 μl，KASP AssayMix0.14 μl，总体积为10.14 μl；所述KASP Master Mix 5.0 μl，KASP Assay Mix中，正向引物F1：正向引物F2：反向引物R的体积比为2:2:5，三种引物浓度均为10 ng/μl；
PCR反应程序为：30℃，1分钟，读取荧光信号；94℃，15分钟预变性；94℃，20秒变性；61℃、-0.6℃/循环，退火60秒，10个循环；94℃，20秒变性；55℃，退火60s秒，35个循环；30℃，1分钟，读取荧光信号。
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| CN202410291840.1A Pending CN117887895A (zh) | 2024-03-14 | 2024-03-14 | 南瓜果实长度性状的kasp分子标记及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117887895A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030024013A1 (en) * | 2000-07-05 | 2003-01-30 | Tanksley Steven D. | Gene controlling fruit size and cell division in plants |
| KR20180077873A (ko) * | 2016-12-29 | 2018-07-09 | 부산대학교 산학협력단 | 수박 분자마커이용여교잡 선발용 snp 마커 |
| CN116162721A (zh) * | 2022-07-21 | 2023-05-26 | 扬州大学 | 一种区分南瓜果实大小的分子标记及鉴定方法和应用 |
| CN116411118A (zh) * | 2023-03-09 | 2023-07-11 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 与南瓜蔗糖含量主效qtl连锁的kasp分子标记及其应用 |
| CN116574828A (zh) * | 2023-03-14 | 2023-08-11 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 与南瓜可溶性固形物含量主效qtl连锁的kasp分子标记及其应用 |
-
2024
- 2024-03-14 CN CN202410291840.1A patent/CN117887895A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030024013A1 (en) * | 2000-07-05 | 2003-01-30 | Tanksley Steven D. | Gene controlling fruit size and cell division in plants |
| KR20180077873A (ko) * | 2016-12-29 | 2018-07-09 | 부산대학교 산학협력단 | 수박 분자마커이용여교잡 선발용 snp 마커 |
| CN116162721A (zh) * | 2022-07-21 | 2023-05-26 | 扬州大学 | 一种区分南瓜果实大小的分子标记及鉴定方法和应用 |
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| CN116574828A (zh) * | 2023-03-14 | 2023-08-11 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 与南瓜可溶性固形物含量主效qtl连锁的kasp分子标记及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YU-JUAN ZHONG 等: "A high-density linkage map and QTL mapping of fruit-related traits in pumpkin (Cucurbita moschata Duch.)", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 7, no. 1, 6 October 2017 (2017-10-06), pages 1 - 12 * |
| 谢元恒: "中国南瓜Bin图谱构建和果实相关性状QTL定位", 中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑, no. 07, 15 July 2021 (2021-07-15), pages 048 - 37 * |
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