CN104988147B - 一种果蔗芽变的分子鉴定方法及其专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种果蔗芽变的分子鉴定方法及其专用引物，所述果蔗芽变的分子鉴定的专用引物为序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列的引物；所述果蔗芽变的分子鉴定方法包括以下步骤：提取果蔗亲本拔地拉及对应的疑似芽变果蔗品种的基因组DNA，采用所述专用引物分别对基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以区分芽变，果蔗亲本拔地拉及对应的疑似芽变果蔗品种的电泳条带模式在625bp处有强度的差异，疑似芽变果蔗品种为真实芽变品种。采用本发明的技术方案能有效地、快速地从果蔗自然突变株中鉴定出芽变品种，为有效选择变异奠定了技术基础，操作简便、用途广泛，节约了大量的人力和物力，便于推广。

Description

一种果蔗芽变的分子鉴定方法及其专用引物

技术领域

本发明属于生物学分子标记领域，涉及一种果蔗芽变的分子鉴定方法及其专用引物。

背景技术

芽变，是植物体细胞内遗传物质发生改变，这种改变往往发生在芽的分生组织细胞中，当芽萌发成新植株时，即表现出新个体与原类型在性状上有所不同。所以，芽变为植物新品种选育提供了一条重要途径。

果蔗在我国具有悠久的种植历史，分布范围也较广。目前我国生产上使用的果蔗品种可分为二大类，一是果蔗专用型品种，二是果糖兼用型品种。其中拔地拉栽培面积最大，以我国果蔗栽培面积最大的广西为列，拔地拉种植面积占果蔗种植总面积的90％以上，地方果蔗品种如青皮蔗、白皮蔗、黄皮果蔗、福建蜡蔗等的种植面积占不到总面积的10％。拔地拉原产热带地区，对水温肥等条件要求较高，在生长过程中对环境条件比较敏感，其主要表现是常因水肥管理偏差导致生长受抑制而出现短节现象，严重影响其商品性。为克服此问题，目前在栽培管理过程中，蔗农通过施用大量水肥及植物生长调节剂，使得果蔗节间长度达到一定长度，从而提高拔地拉的商品性。

目前果蔗新品种选育主要是利用糖蔗品种作为亲本进行常规杂交选育，并育成了一批果糖兼用品种，但品质低于拔地拉。发明人经研究发现，将新型SCoT(Start codontargeted polymorphism)标记技术应用到果蔗拔地拉及其芽变类型的分子鉴定中，虽然PCR扩增效果非常好，但所用引物难以检测到遗传差异，不能对果蔗拔地拉及其芽变类型进行分子鉴定，如图1所示。

因此，鉴于中国果蔗品种现状及存在问题，从果蔗自然突变株中系统选育果蔗新品种，以期育成高产、稳产、优质、抗病、适应性广、应用前景好的果蔗新品种，是果蔗生产的当务之急。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种果蔗芽变的分子鉴定方法及其专用引物，以便从果蔗拔地拉自然突变株中有效、快速的鉴定出果蔗芽变品种。

对此，本发明的技术方案为：

一种果蔗芽变的分子鉴定的专用引物，所述专用引物为序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列的引物，所述专用引物为URP(Universal Rice Primer)标记单引物。

所述专用引物的核苷酸序列为：

URP38F：AAGAGGCATTCTACCACCAC。

所述专用引物以下统称为URP38F。

一种果蔗芽变的分子鉴定方法，包括以下步骤：提取果蔗亲本拔地拉及对应的疑似芽变果蔗品种的基因组DNA，用所述专用引物即URP38F分别对基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以区分亲本拔地拉及其对应的疑似芽变果蔗品种，果蔗亲本拔地拉与其对应的疑似芽变果蔗之间的电泳条带模式在625bp处有强度差异，疑似芽变果蔗品种为真实芽变品种。

作为本发明的进一步地改进，所述PCR扩增的程序是：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，其中，变性、退火、延伸三个步骤循环35次；72℃最后一步延伸10min，10℃保存。

作为本发明的进一步地改进，所述PCR扩增体系为20ul，包括：10×PCR含Mg²⁺的Buffer 2.0ul，2.5mM的dNTP 0.5ul，10pmol/ul的URP38F 1ul，2.5U/ul的Taq酶0.5ul，50ng/ul的DNA模板1.0ul，ddH₂O补足。

作为本发明的进一步地改进，所述果蔗的基因组DNA从果蔗植株的嫩叶中提取。

作为本发明的进一步地改进，所述提取果蔗基因组DNA的方法，包括以下步骤：

步骤A：取新鲜果蔗嫩叶，放入研钵中并在研钵中加入PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，加入液氮，将叶片充分研磨成粉末状样品；

步骤B：将所述粉末状样品转移到装有预热的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液的离心管中，并加入β-巯基乙醇，于65℃水浴锅中温浴60min，混匀；

步骤C：将步骤B的离心管置于4℃冷冻离心机中，12000rpm离心10min后，吸取上清液，并在上清液中加入RNaseA(核糖核酸酶A)，混匀，静置5min；

步骤D：加入与步骤C所述的上清液等体积的氯仿，抽提，混匀，静置5min，冷冻离心机中12000rpm离心10min；

步骤E：再次吸取上清液，并再次加入等体积的氯仿抽提，于冷冻离心机中12000rpm离心10min；

步骤F：吸取上清液，并加入等体积的-40℃的无水乙醇，于-40℃冰箱中沉淀30min，将沉淀物取出放入到新的离心管中，用75％乙醇洗涤；

步骤G：晾至无乙醇味后，用200ul DEPC水或TE缓冲液溶解沉淀物。

作为本发明的进一步地改进，所述步骤F中，采用白色小枪头或牙签将沉淀物取出。

进一步优化的，所述果蔗植株基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

1)取新鲜果蔗嫩叶0.3-0.5g，用经高压灭菌后的干净剪刀剪碎，放入研钵中并在研钵中加入1g的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，分多次倒入足量的液氮，将叶片样品充分研磨成粉末状；

2)将全部粉末样品转移到事先加入了1.0mlCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液且经过65℃预热的2ml离心管中，再加入20μlβ-巯基乙醇，于65℃水浴锅中温浴60min，期间上下颠倒混匀，以便DNA充分析出；

3)将离心管置于4℃冷冻离心机中，12000rpm离心10min后除去底部残渣，吸取上清液到新的干净的离心管中，并在上清液中加入0.5ul的RNaseA(核糖核酸酶A)，上下充分颠倒混匀，静置5min；

4)加入与上清液等体积的氯仿抽提，上下充分颠倒混匀，静置5min，4℃冷冻离心机中12000rpm离心10min；

5)吸取上清液，并再次加入与上清液等体积的氯仿抽提，4℃冷冻离心机中12000rpm离心10min；

6)吸取上清液并加入与上清液等体积且事先在-40℃预冷的无水乙醇于-40℃冰箱中沉淀30min，用白色小枪头或牙签将沉淀挑出来到新的干净的1.5ml离心管中，用75％vol乙醇洗涤沉淀二遍；

7)5min左右晾干后，用200μl DEPC(焦碳酸二乙酯)水或TE缓冲溶液溶解沉淀。

本发明还提供了一种用于果蔗芽变分子鉴定的试剂盒，所述试剂盒含有URP38F引物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

采用本发明的技术方案，可以有效地、快速地从果蔗拔地拉自然突变株中鉴定出芽变品种，为进一步育成高产、稳产、优质、抗病、适应性广、应用前景好的果蔗新品种奠定了基础；且本发明的鉴定方法具有较强的通用性，为有效选择变异奠定了理论基础和提供了技术支撑，操作简便、用途广泛，节约了大量的人力和物力，便于推广。

附图说明

图1是本发明现有技术的果蔗亲本拔地拉及其对应的4个芽变品种的SCoT标记技术鉴定的1.5％琼脂糖凝胶电泳图，图中所用单引物分别为SCoT6、SCoT9和SCoT12，编号1-5分别对应拔地拉、芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号；

图2是本发明一种实施例果蔗亲本拔地拉及其对应的4个芽变品种的URP标记技术鉴定的1.5％琼脂糖凝胶电泳图，图中所用单引物分别为URP2F、URP9F、URP38F和URP4R，编号1-5分别对应拔地拉、芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号；

图3是本发明一种实施例果蔗亲本拔地拉及其对应的4个芽变品种的URP标记技术重复鉴定的1.5％琼脂糖凝胶电泳图，图中所用单引物为URP38F，编号1-5分别对应拔地拉、芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号。

图中，M为DNA Marker DL2000，从上到下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

实施例1

材料：

本实施例选取拔地拉、芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号五个品种进行对比分析。其中，拔地拉为果蔗亲本品种，芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号为疑似芽变果蔗品种。

步骤一，提取亲本果蔗拔地拉及疑似芽变果蔗品种的基因组DNA，包括以下步骤：

1)取新鲜果蔗嫩叶0.3-0.5g，用经高压灭菌后的干净剪刀剪碎，放入研钵中并在研钵中加入1g的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，分多次倒入足量的液氮，将叶片样品充分研磨成粉末状；

2)将全部粉末样品转移到事先加入了1.0mlCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液且经过65℃预热的2ml离心管中，再加入20μlβ-巯基乙醇，于65℃水浴锅中温浴60min，期间上下颠倒混匀，以便DNA充分析出；

3)将离心管置于4℃冷冻离心机中，12000rpm离心10min后除去底部残渣，吸取上清液到新的干净的离心管中，并在上清液中加入0.5ul的RNaseA(核糖核酸酶A)，上下充分颠倒混匀，静置5min；

4)加入与上清液等体积的氯仿抽提，上下充分颠倒混匀，静置5min，4℃冷冻离心机中12000rpm离心10min；

5)吸取上清液，并再次加入与上清液等体积的氯仿抽提，4℃冷冻离心机中12000rpm离心10min；

6)吸取上清液并加入与上清液等体积且事先在-40℃预冷的无水乙醇于-40℃冰箱中沉淀30min，用白色小枪头或牙签将沉淀挑出来到新的干净的1.5ml离心管中，用75％vol乙醇洗涤沉淀二遍；

7)5min左右晾干后，用200μl DEPC水或TE溶解沉淀。

亲本果蔗拔地拉及疑似芽变果蔗品种提取均按照此方法提取各自的基因组DNA。

步骤二，利用URP标记引物分别对基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳以区分芽变，亲本果蔗拔地拉及疑似芽变品种之间的电泳条带模式有差异，疑似芽变品种为真实芽变品种，详见图2和图3；

所述的URP标记引物是URP38F，所述URP38F的引物核苷酸序列为：AAGAGGCATTCTACCACCAC；

所述PCR扩增的程序是：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，其中，变性、退火、延伸三个步骤循环35次；72℃最后一步延伸10min，10℃保存；

所述PCR扩增体系为20ul，包括：10×PCR含Mg²⁺的Buffer 2.0ul，各2.5mM的dNTP0.5ul，10pmol/ul的URP38F引物1ul，2.5U/ul的Taq酶0.5ul，50ng/ul的DNA模板1.0ul，ddH₂O补足剩下的15ul。

步骤三，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增结束后，PCR扩增产物中加入4ul电泳上样缓冲液混匀，取6ul扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为1×TAE，EB(溴化乙锭)染色后，胶块在凝胶成像系统的UV下进行显色观察并拍照。

起初，我们对12条URP标记单引物进行了初步筛选，紧接着，我们对扩增效果更好的4条单URP标记引物再次进行了扩增，令人非常兴奋的是，我们观察到单引物URP38F能检测到差异，该差异是由于其中的一条条带亮度的强弱引起的，该条带在大约625bp处(界于500bp和750bp之间)，如图2所示。

为了进一步验证单引物URP38F在第一轮PCR筛选中体现出来的真实性，以判定扩增出的差异条带不是由于样品基因组DNA中的该片段拷贝数差异引起的，我们对样品DNA模板的用量进行了调整，成倍地调大了在大约625bp处条带弱的样品DNA的使用量，并进行了多次PCR重复扩增，结果如图3所示，依然观察到单引物URP38F能检测到在大约625bp处的一条条带亮度的强弱引起的差异，该URP38F引物可用于果蔗亲本拔地拉及其对应的芽变品种的分子鉴定。

实施例2

对实施例1中鉴定出的芽变1号进行培育，于横县云表镇、宾阳古辣镇、武鸣双桥镇、博白三滩镇、田东县祥周镇、龙州上龙乡等多点进行两年的试验种植，与拔地拉相比，农艺性状结果如下表1所示。

表1芽变1号大田两年多点试种的农艺性状结果及其与果蔗拔地拉的比较

从表1可见，育成的芽变1号发芽率92.24％，略低于拔地拉的92.96％；株高255.61厘米，比拔地拉的227.95厘米高27.66厘米；茎径3.54厘米，比拔地拉的3.67细0.13厘米；每公顷商品蔗数47834条，比拔地拉的45079条多2755条。说明该品种萌芽率高，商品蔗数多，单茎较重。

芽变1号公顷商品蔗产量120.18吨，比拔地拉的110.94吨增产9.71吨。芽变1号公顷商品蔗最高产量最高可达180吨。另外，在玉州区、邕宁区、隆安、大新、融水、阳朔及广东、湖南、河南等地试种，普遍表现良好，产量及商品蔗质量均优于拔地拉，表现出较好的适应性。

对芽变1号和拔地拉的品质分析进行比较，结果：芽变1号的蔗糖分12.93％、纤维分7.42％、出汁率83.74％、锤度14.86％、蔗渣水分50.88％，与拔地拉对应指标与差别较小，详见下表2。

表2芽变1号和拔地拉的品质分析比较表

对芽变1号和拔地拉的节间长度均匀度进行了比较分析，详见下表3。芽变1号商品性较低的节间数较少，长度≤5.9cm的节间数占总节间数0.67％，拔地拉占5.43％；长度6.0～7.9cm的节间数芽变1号占9.21％，拔地拉占19.12％；商品性较高的节间长度，长度8.0～13.9cm的芽变1号占84.75％，拔地拉占71.34％；商品性稍次的节间长度，长度≥14.0cm的芽变1号占5.28％，拔地拉占4.09％。

表3芽变1号和拔地拉的节间长度分级比较表

(单位：cm)

因此，芽变1号不论节间长度还是茎径大小，其均匀度高于拔地拉，外观质量好，其商品性价比较高。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种果蔗芽变的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：提取果蔗亲本拔地拉及对应的疑似芽变果蔗品种的基因组DNA，采用专用引物分别对基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以区分芽变，果蔗亲本拔地拉与其对应的疑似芽变果蔗品种之间的电泳条带模式在625bp处有强度差异，疑似芽变果蔗品种为真实芽变品种；所述专用引物为URP38F引物；所述专用引物为序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列的引物。

2.根据权利要求1所述的一种果蔗芽变的分子鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增的程序是：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，其中，变性、退火、延伸三个步骤循环35次；72℃最后一步延伸10min，10℃保存。

3.根据权利要求2所述的一种果蔗芽变的分子鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增体系为20ul，包括：10×PCR含Mg²⁺的Buffer 2.0ul，2.5mM的dNTP 0.5ul，10pmol/ul的URP38F引物1.0ul，2.5U/ul的Taq酶0.5ul，50ng/ul的DNA模板1.0ul，ddH₂O补足。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的一种果蔗芽变的分子鉴定方法，其特征在于：所述果蔗的基因组DNA从果蔗植株的嫩叶中提取。

5.根据权利要求4所述的一种果蔗芽变的分子鉴定方法，其特征在于：所述提取果蔗基因组DNA的方法，包括以下步骤：

步骤A：取新鲜果蔗嫩叶，放入研钵中并在研钵中加入PVP，加入液氮，将叶片充分研磨成粉末状样品；

步骤B：将所述粉末状样品转移到装有预热的CTAB提取液的离心管中，并加入ß-巯基乙醇，于65℃水浴锅中温浴60min，混匀；

步骤C：将步骤B的离心管置于冷冻离心机中，12000rpm离心10min后，吸取上清液，并在上清液中加入RNaseA，混匀，静置5min；

步骤D：加入与步骤C所述的上清液等体积的氯仿，抽提，混匀，静置5min，冷冻离心机中12000rpm离心10min；

步骤E：再次吸取上清液，并再次加入与上清液等体积的氯仿抽提，于冷冻离心机中12000rpm离心10min；

步骤F：吸取上清液，并加入与上清液等体积的-40℃的无水乙醇，于-40℃冰箱中沉淀30min，将沉淀物取出放入到新的离心管中，用75%乙醇洗涤；

步骤G：晾至无乙醇味后，用200ul DEPC水或TE缓冲液溶解沉淀物。

6.根据权利要求5所述的一种果蔗芽变的分子鉴定方法，其特征在于：所述步骤F中，采用白色小枪头或牙签将沉淀物取出。