CN104928395B - 马铃薯的一种dna指纹图谱及其获取方法与其专用引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了马铃薯的一种DNA指纹图谱及其获取方法与其专用引物。所述获取马铃薯DNA指纹图谱的专用引物，由序列表的序列SEQ ID NO:1~7组成。本发明提供的方法包括如下步骤：提取马铃薯的基因组DNA；以基因组DNA为模板，利用所述专用引物进行PCR扩增；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，用EB染色显示马铃薯的DNA指纹图谱。本发明获得的马铃薯DNA指纹图谱多态性高、指纹丰富，为提高马铃薯选择育种的准确性和效率，缩短育种周期，及马铃薯的分子标记辅助育种奠定了技术基础。

Description

马铃薯的一种DNA指纹图谱及其获取方法与其专用引物
技术领域
本发明涉及马铃薯的一种DNA指纹图谱及其获取方法与其专用引物。
背景技术
马铃薯属茄科多年生草本植物，块茎可供食用，是世界第四大重要的粮食作物。我国是全球马铃薯生产第一大国，我国马铃薯育种以品种间或种间杂交为主。据不完全统计，自20世纪40年代到2000年间，中国共育成马铃薯品种170多个。近年来，随着我国马铃薯育种进程加快，育成的品种数量迅速增加，2000-2007年省级以上共审定品种近110个。但由于早期对马铃薯品种缺乏系统完善的鉴定方法，致使出现同种多名和同名多种等现象，品种混乱问题给马铃薯生产造成很大损失。以往马铃薯品种鉴定一直是基于传统的形态学特征，这些性状易受环境条件影响。此外，我国育成马铃薯品种的亲本基本上是五、六十年代引自欧洲的四倍体栽培品种，亲缘关系近，后代的遗传变异停留在近交水平，因此对其进行形态学鉴定及分类相当困难。因此，如何快速准确鉴别马铃薯品种种质资源，已成为当前马铃薯生产及科研中急需解决的问题。
与形态标记相比，分子标记是建立在基因组DNA基础之上，其能对各发育时期的生物个体、组织、器官甚至细胞进行检测，不受基因表达的影响，具有操作简便、数量丰富、及多态性高等特点(Kumer，1999)。实践证明，分子标记可对种质资源进行准确、科学的鉴定和评价，为育种工作者提供直接、可靠的依据(邸宏等，2006)。
为了充分有效地利用马铃薯丰富的种质资源，需要建立高效的马铃薯DNA分子标记技术体系并利用其对马铃薯种质资源进行鉴定和评价。
发明内容
针对以上技术问题，本发明的目的在于提供马铃薯的一种DNA指纹图谱及其获取方法与其专用引物，更充分地、有效地利用马铃薯丰富的种质资源。
本发明提供的一种获取马铃薯DNA指纹图谱的专用引物，由序列表的序列SEQ IDNO:1～7组成。
本发明还提供了一种获取马铃薯DNA指纹图谱的方法，包括如下步骤：
步骤A：提取马铃薯的基因组DNA；
步骤B：以步骤A的马铃薯的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的专用引物进行PCR扩增；
步骤C：对步骤B中得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，用EB(溴化乙锭)染色显示马铃薯的DNA指纹图谱。
作为本发明的进一步改进，步骤B中，所述PCR扩增的程序是：94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，其中，变性、退火和延伸三个步骤循环35次，72℃最后一步延伸10min，10℃保存。
作为本发明的进一步改进，所述PCR扩增的体系为20ul，包括：10×PCR含Mg2+的Buffer 2.0ul，2.5mM的dNTP 0.5ul，10pmol/ul每条专用引物1ul，2.5U/ul的Taq酶0.4ul，50ng/ul的DNA模板1.0ul，ddH2O补足。
作为本发明的进一步改进，所述马铃薯的基因组DNA来自马铃薯植株的幼嫩叶片。
利用所述的方法得到的马铃薯DNA指纹图谱也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了所述的专用引物在获取马铃薯DNA指纹图谱中的应用。
本发明还提供了一种获取马铃薯DNA指纹图谱的试剂盒，所述试剂盒还有如上所述的SEQ ID NO:1～7专用引物。
采用本发明的专用引物和本发明的方法获得的马铃薯DNA指纹图谱多态性高、指纹丰富、重复性好，在提高马铃薯选择育种的准确性和效率，缩短育种周期，以及马铃薯的分子标记辅助育种中发挥重要作用。
附图说明
图1为本发明应用所述专用引物P1获得的马铃薯的DNA指纹图谱。
图2为本发明应用所述专用引物P2获得的马铃薯的DNA指纹图谱。
图3为本发明应用所述专用引物P3获得的马铃薯的DNA指纹图谱。
图4为本发明应用所述专用引物P4获得的马铃薯的DNA指纹图谱。
图5为本发明应用所述专用引物P5获得的马铃薯的DNA指纹图谱。
图6为本发明应用所述专用引物P6获得的马铃薯的DNA指纹图谱。
图7为本发明应用所述专用引物P7获得的马铃薯的DNA指纹图谱。
图8为本发明实施例2的9份马铃薯品种的聚类树状图。
图中，M代表DNA Marker DL2000，从上到下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；编号1-9分别对应中薯11号、中薯7号、中薯14号、费乌瑞它、中薯8号、冀张薯8号、中薯13号、中薯6号、中薯17号。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
以下实施例中所用的9个马铃薯品种如下：
1.中薯11号、2.中薯7号、3.中薯14号、4.费乌瑞它、5.中薯8号、6.冀张薯8号、7.中薯13号、8.中薯6号、9.中薯17号。
以下实施例中所用到的马铃薯样品均源自于广西壮族自治区农业科学院经济作物研究所。
实施例1利用专用引物获取马铃薯的DNA指纹图谱
操作流程：提取马铃薯基因组DNA→PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳→EB染色→获得清晰DNA指纹图谱→统计分析结果。
具体方法和过程如下：
1、DNA提取
采用改良具体CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取马铃薯样本的DNA。
包括以下分步骤：
(1)取新鲜马铃薯嫩叶，每个品种取0.3-0.5g，用剪刀剪碎，放入研钵中并在研钵中加入1g的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，分多次倒入足量的液氮，将叶片样品充分研磨成粉末状。
(2)将全部粉末样品转移到事先加入了1.0mlCTAB提取液且经过65℃预热的2ml离心管中，再加入20μlβ-巯基乙醇，于65℃水浴锅中温浴60min，期间上下充分颠倒混匀，以便DNA充分析出。
(3)在4℃冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min后除去底部残渣，吸取上清液到另外一支2ml干净的离心管，并在上清液中加入0.5μl的RNaseA(核糖核酸酶A)，上下充分颠倒混匀，静置5min。
(4)加入与上清液等体积的氯仿抽提，上下充分颠倒混匀，静置5min，然后在冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min。
(5)吸取上清液并加入与上清液等体积且事先在-40℃预冷的无水乙醇于-40℃冰箱中沉淀30min，用白色小枪头或牙签将沉淀挑出来到新的干净的1.5ml离心管中，用75％vol乙醇洗涤沉淀二遍，再用600μl DEPC水充分溶解沉淀。
(6)加入600μl Tris平衡酚充分混匀抽提，静置5min，4℃冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min。
(7)取上清液并在上清液中加入与上清液等体积的事先预冷的无水乙醇于-40℃冰箱中沉淀30min，再次用白色小枪头或牙签将白色沉淀挑出来到新的干净的1.5ml离心管中，用75％vol乙醇洗涤沉淀二遍，短时间(5min左右)晾干后，用200μl DEPC水或TE溶解沉淀。
2、PCR扩增
以步骤1中得到的马铃薯样本的基因组DNA为模板，分别采用序列表的专用引物序列进行PCR扩增；
所述专用引物的序列为：
P1：GAATTCCGGCGGCGATC；如SEQ ID No:1所示。
P2：GAATTCCGGCGGCGAAC；如SEQ ID No:2所示。
P3：GAATTCCGGCGGCGTAC；如SEQ ID No:3所示。
P4：GAATTCCGGCGGCGTCG；如SEQ ID No:4所示。
P5：GAATTCCGGCGGCGTGA；如SEQ ID No:5所示。
P6：GAATTCCGCCGCCGATA；如SEQ ID No:6所示。
P7：ATATATCGGCGGCGATC；如SEQ ID No:7所示。
PCR扩增的程序是：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，其中，变性、退火和延伸三个步骤循环35次；72℃最后一步延伸10min，10℃保存。
PCR扩增体系为20ul，包括：10×PCR含Mg2+的Buffer 2.0ul，各2.5mM的dNTP0.5ul，10pmol/ul每条专用引物1ul，2.5U/ul的Taq酶0.4ul，50ng/ul的DNA模板1.0ul，ddH2O补足。
3、电泳
对步骤2中得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离。PCR扩增结束后，PCR扩增产物中加入4ul电泳上样缓冲液(6xLoading buffer)混匀，取6ul混合样品在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为1xTAE，电泳条件为120V的电压下电泳1h。
4、染色显影
将10mg/ml的EB液20ul溶于500ml双蒸水中，溶液的颜色达到微微黄色即可。将电泳后的琼脂糖凝胶放入EB染色液(溴化乙锭)中，染色20min，然后将胶取出，用自来水轻轻冲洗胶块3遍，即可放入凝胶成像系统的UV下进行显色观察并拍照。
5、条带统计及结果分析
对成像的琼脂糖凝胶电泳图谱上的条带进行人工记录和统计，将每一条带视为一个位点，有条带的记为1，无条带的记为0，从而形成0-1数据矩阵。结果表明获得了扩增效果好、多态性高和指纹丰富的马铃薯DNA指纹图谱，这些引物可以把9份马铃薯品种全部区分开来，条带大小分部在250bp-2000bp之间，扩增总条带数81条，多态性条带数69条，多态性85.19％，平均扩增条带数11.57条，部分结果如图1～图7和表1所示。
表1 7条单引物在9份马铃薯上获得的条带数统计表
引物编号 总条带数 多态性条带数 多态性
P1 7 6 85.71％
P2 14 14 100％
P3 15 11 73.33％
P4 12 10 83.33％
P5 14 13 92.86％
P6 8 7 87.50％
P7 11 8 72.72％
平均 11.57 9.86 85.06％
总数 81 69 —
实施例2马铃薯DNA指纹图谱的应用
对实施例1获得的马铃薯DNA指纹图谱进行聚类分析，得到聚类树状图，如图8所示，可以看出，在遗传距离的阈值约为0.55时，可将9份马铃薯品种分成2大组。第一大组包括冀张薯8号、中薯13号、中薯14号、费乌瑞它、中薯6号、中薯8号和中薯17号共7个马铃薯品种；第二大组只包括中薯11号和中薯7号2个品种。在遗传距离的阈值约为0.36时，可将第一大组分成两个小组。在遗传距离的阈值约为0.30时，又可进一步划分。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1. 一种获取马铃薯DNA指纹图谱的专用引物，由序列表的序列SEQ ID NO:1~7组成。
2.一种获取马铃薯DNA指纹图谱的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：提取马铃薯的基因组DNA；
步骤B：以步骤A的马铃薯的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的专用引物进行PCR扩增；
步骤C：对步骤B中得到的PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用EB染色显示马铃薯的DNA指纹图谱。
3.根据权利要求2所述的获取马铃薯DNA指纹图谱的方法，其特征在于：步骤B中，所述PCR扩增的程序是：94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，其中，变性、退火和延伸三个步骤循环35次，72℃最后一步延伸10min，10℃保存。
4. 根据权利要求3所述的获取马铃薯DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述PCR扩增的体系为20ul，包括：10×PCR含Mg2+的Buffer 2.0ul，2.5mM的dNTP 0.5ul，10pmol/ul每条专用引物1ul，2.5U/ul 的Taq酶0.4ul，50ng/ul 的DNA模板 1.0ul，ddH2O补足。
5.根据权利要求2~4任意一项所述的获取马铃薯DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述马铃薯的基因组DNA来自马铃薯植株的幼嫩叶片。
6.权利要求1所述的专用引物在获取马铃薯DNA指纹图谱中的应用。
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