CN104531844B - 一种基于ssr基因型的果树品种区分及特征指纹展示方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学的分子标记领域，公开了一种基于SSR基因型的果树品种区分及特征指纹展示方法。该方法通过选择多态性高的SSR引物，对果树品种进行PCR扩增，经电泳检测后，统计各品种在SSR位点的基因型，利用WPS或Excel等数据处理软件整合处理，查找各品种的特征基因型，并标示，最终形成一张包含完整SSR位点信息和各品种基因型数据的，能直观反映各品种间图谱关系的果树品种SSR特征指纹数据表。该方法对没有指纹数据的果树品种进行SSR标记区分时，仅需对前一对SSR引物不能区分开的品种继续进行SSR扩增和排序，操作简便，检测结果准确可靠、稳定高效，更重要的是品种特征指纹表的内容还可由其他研究者进行不断地充实，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学的分子标记领域，具体涉及一种基于SSR基因型的果树品种区分及特征指纹展示方法。
背景技术
近些年来，随着我国人民生活水平提高，土地流转加速，资本下乡日渐活跃，果树产业获得了快速发展，大量优良的果树品种被应用于生产。建立一套简便、快速、可靠的果树品种鉴定技术体系应用于果树品种鉴定，进行品种权利保护，对于维护育种者和生产者的利益，保障果树产业健康发展，具有重要而现实的意义。
传统的形态学品种鉴定方法无法有效鉴别大量的品种，分子标记技术的兴起与应用，为植物品种鉴定提供了准确、可靠的技术手段。常见的分子标记有RAPD(RandomAmplified Polymorphic DNA)、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)、ISSR(Inter-simple sequence repeat)、AFLP(Amplified Fragment LengthPolymorphism)和SSR(Simple Sequence Repeat)。
SSR也称微卫星、短串联重复(STR)，是由长度为1—6个碱基的基元，串联重复而成的，广泛分布于基因组中。SSR是基因组中变异最为迅速的序列，其串联重复数的突变率很高，从而产生了很多等位基因，形成了SSR的高度多态性。SSR标记是基于PCR扩增的分子标记，较之基于分子杂交的RFLP标记和基于酶切位点的AFLP标记要简单、方便地多。与RAPD和AFLP的随机引物标记不同的是，SSR标记呈共显性，引物由待检物种的基因组序列开发而来，物种特异性强，不易受内生及外源微生物基因组的影响，结果准确可靠，较少的引物组合可达到较高的检测精度。正是基于这些优点，国际植物品种权保护组织(UPOV)于2007年将SSR与最新发展的SNP标记一起确定为构建DNA指纹数据库的标记方法。
目前利用DNA标记进行果树品种鉴定的方法基本是聚类生成聚类图和指纹图谱，也有在此基础上生成果树品种分子身份证的，但是不管哪种方法最终展示的内容都不含具体的指纹数据信息，其他研究者通常无法加以利用，更无法在此基础上进行内容上的充实，致使许多物种至今没有可应用于实践的果树品种鉴定技术体系。因此，开发一种简便、快速、可靠的果树品种鉴定新方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于开发一种利用SSR分子标记技术进行果树品种快速区分、鉴定和特征指纹展示的方法。该方法较之常规的聚类图、指纹图谱和标准模式图，更为简便、直观、真实，可方便地应用于果树品种区分、鉴定、查对和果树种质资源交换、管理、利用。更重要的是品种特征指纹表的内容还可由其他研究者进行不断地充实，其开放性更利于同行间的交流和共享，从而能够群策群力整合尽可能多的资源，形成完善、实用的果树品种鉴定技术体系。
本发明提供一种基于SSR基因型的果树品种区分及特征指纹展示方法，包括如下步骤：
以等位基因数量多，多态性高，稳定性好为标准，筛选用于果树品种鉴定的SSR引物。
果树品种经PCR扩增，PCR产物经电泳检测后，按照“小分子量/大分子量”的格式，统计果树品种在各SSR位点的基因型。
将统计的基因型数据按照“品种名”和“SSR位点”录入数据处理软件整合处理，形成果树品种SSR特征指纹数据表。
对没有指纹数据的果树品种进行SSR标记区分时，仅需对前一对SSR引物不能区分开的品种继续进行SSR扩增和排序即可。
进行相应果树品种鉴别时，只需按顺序考察比对SSR特征指纹数据表中相应SSR位点的基因型数据即可。
所述电泳检测为荧光毛细管电泳检测或PAGE胶检测。
所述SSR位点的基因型为纯合基因型时，按照“分子量/分子量”的格式统计。
所述数据处理软件为WPS或Excel表格。
所述数据处理软件整合处理包括：
新增一条“基因型数目”的记录，统计各SSR位点在果树品种中的基因型数目。
利用表格的“数据→排序”功能，根据“基因型数目”由多到少以降序形式调整SSR位点字段的排列位置，使基因型数目多的SSR位点排前面，少的排后面。
将果树品种以某SSR位点为关键字排序，并标示SSR位点中唯一的基因型作为品种区分，直至所有果树品种均被标示区分为止。
若所有SSR位点均已排序仍存在不能区分的果树品种，整合处理终止，指示返回增加SSR引物以进行区分，直至所有果树品种均被标示区分为止。
将冗余SSR位点剪切到所有SSR位点之后，并去除标示。
在最后两个标示位点区分的品种中对所有未标示的SSR位点进行重复项查找，将未找到重复项的SSR位点剪切到这两个SSR位点之前，取代相应两个SSR位点，并标示。
去除被取代的SSR位点的标示。
重复上述步骤用以优化，以达到用尽可能少的SSR引物位点区分果树品种。
所述SSR引物位点在果树品种中基因型数目的统计方法可利用表格中的函数公式“＝SUMPRODUCT(1/COUNTIF(某SSR位点基因型数据区域，某SSR位点基因型数据区域))”进行不重复统计或者利用表格中“数据→自动筛选”功能，在“内容筛选”栏统计所列的该SSR位点不重复基因型数目。
所述以某SSR位点为关键字进行排序，应按照各位点基因型数目权重，逐个SSR位点或以3个SSR位点为单位分批进行，上一批位点排序后未区分的品种进入下一批位点排序，直至所有品种都能被区分。软件版本许可时也可一次性完成排序，直至所有品种都能被区分，具体步骤如下：
利用表格的“数据→排序”功能，将所有果树品种以第一个SSR位点为关键字，按升序排序。
根据排序结果，将第一个SSR位点中唯一的基因型数据标示背景颜色或者字体加粗显示，表明相应果树品种被区分出来。
将第一个SSR位点基因型相同而不能区分的果树品种，再以第二个SSR位点为关键字，按升序排序。
根据排序结果，将第二个SSR位点中参与排序部分唯一的基因型数据连同相应品种在前面SSR位点的基因型数据标示背景颜色或者字体加粗显示，表明相应果树品种被区分出来。
按以上步骤依次排序，直到所有果树品种均被标示背景颜色或者字体加粗显示区分出来为止。
所述冗余SSR位点为标示背景颜色或者字体加粗显示的基因型均为非唯一基因型的SSR位点。
所述重复项查找是限制在最后2个标示背景颜色或者字体加粗显示的SSR位点区分的品种间进行，通过表格的“数据→重复项→高亮显示重复项”功能，对标示背景颜色或者字体加粗显示的倒数第三个SSR位点具有相同基因型的品种对应的所有未标示背景颜色或者字体加粗显示的SSR位点进行重复项查找。
所述标示背景颜色或者字体加粗显示的基因型数据即为区分相应品种的特征指纹数据，在表格所涉及的品种范围内仅用特征指纹数据即可区分和鉴定相应品种。
所述对没有指纹数据的果树品种进行SSR标记区分时，无需执行依据基因型数目调整SSR位点的排列位置。
所述标示的SSR引物位点可作为一套用于相应果树品种鉴定的SSR核心引物。
所述标示的SSR指纹数据为相应果树品种的SSR特征指纹数据，所有品种的SSR特征指纹数据的集合组成果树品种SSR特征指纹数据表。
本发明的有益效果在于，操作简便，检测结果准确可靠、稳定高效，为果树品种区分、鉴定及种质资源交换、管理和利用提供了可靠、实用的技术手段。更重要的是品种特征指纹表的内容还可由其他研究者进行不断地充实，其开放性更利于同行间的交流和共享，从而能够群策群力整合尽可能多的资源，形成完善、实用的果树品种鉴定技术体系，应用前景广阔。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1所示为本发明以梨树品种为例录入数据图。
图2所示为本发明以梨树品种为例统计基因型数量图。
图3所示为本发明以梨树品种为例调整SSR位点字段位置图。
图4所示为本发明以梨树品种为例以第一个SSR位点为关键字的排序图。
图5所示为本发明以梨树品种为例以第二个SSR位点为关键字的排序图。
图6所示为本发明以梨树品种为例以第三个SSR位点为关键字的排序图。
图7所示为本发明以梨树品种为例重复项查找图。
图8所示为本发明的梨树品种SSR特征指纹数据图表。
具体实施方式
本发明提供一种基于SSR基因型的果树品种区分及特征指纹展示方法，包括如下步骤：
以等位基因数量多，多态性高，稳定性好为标准，筛选用于果树品种鉴定的SSR引物。
果树品种经PCR扩增，PCR产物经电泳检测后，按照“小分子量/大分子量”的格式，统计果树品种在各SSR位点的基因型。
将统计的基因型数据按照“品种名”和“SSR位点”录入数据处理软件整合处理，形成果树品种SSR特征指纹数据表。
对没有指纹数据的果树品种进行SSR标记区分时，仅需对前一对SSR引物不能区分开的品种继续进行SSR扩增和排序即可。
进行相应果树品种鉴别时，只需按顺序考察比对SSR特征指纹数据表中相应SSR位点的基因型数据即可。
所述电泳检测为荧光毛细管电泳检测或PAGE胶检测。
所述SSR位点的基因型为纯合基因型时，按照“分子量/分子量”的格式统计。
所述数据处理软件为WPS或Excel表格。
所述数据处理软件整合处理包括：
新增一条“基因型数目”的记录，统计各SSR位点在果树品种中的基因型数目。
利用表格的“数据→排序”功能，根据“基因型数目”由多到少以降序形式调整SSR位点字段的排列位置，使基因型数目多的SSR位点排前面，少的排后面。
将果树品种以某SSR位点为关键字排序，并标示SSR位点中唯一的基因型作为品种区分，直至所有果树品种均被标示区分为止。
若所有SSR位点均已排序仍存在不能区分的果树品种，整合处理终止，指示返回增加SSR引物以进行区分，直至所有果树品种均被标示区分为止。
将冗余SSR位点剪切到所有SSR位点之后，并去除标示。
在最后两个标示位点区分的品种中对所有未标示的SSR位点进行重复项查找，将未找到重复项的SSR位点剪切到这两个SSR位点之前，取代相应两个SSR位点，并标示。
去除被取代的SSR位点的标示。
重复上述步骤用以优化，以达到用尽可能少的SSR引物位点区分果树品种。
所述SSR引物位点在果树品种中基因型数目的统计方法可利用表格中的函数公式“＝SUMPRODUCT(1/COUNTIF(某SSR位点基因型数据区域，某SSR位点基因型数据区域))”进行不重复统计或者利用表格中“数据→自动筛选”功能，在“内容筛选”栏统计所列的该SSR位点不重复基因型数目。
所述以某SSR位点为关键字进行排序，应按照各位点基因型数目权重，逐个SSR位点或以3个SSR位点为单位分批进行，上一批位点排序后未区分的品种进入下一批位点排序，直至所有品种都能被区分。软件版本许可时也可一次性完成排序，直至所有品种都能被区分，具体步骤如下：
利用表格的“数据→排序”功能，将所有果树品种以第一个SSR位点为关键字，按升序排序。
根据排序结果，将第一个SSR位点中唯一的基因型数据标示背景颜色或者字体加粗显示，表明相应果树品种被区分出来。
将第一个SSR位点基因型相同而不能区分的果树品种，再以第二个SSR位点为关键字，按升序排序。
根据排序结果，将第二个SSR位点中参与排序部分唯一的基因型数据连同相应品种在前面SSR位点的基因型数据标示背景颜色或者字体加粗显示，表明相应果树品种被区分出来。
按以上步骤依次排序，直到所有果树品种均被标示背景颜色或者字体加粗显示区分出来为止。
所述冗余SSR位点为标示背景颜色或者字体加粗显示的基因型均为非唯一基因型的SSR位点。
所述重复项查找是限制在最后2个标示背景颜色或者字体加粗显示的SSR位点区分的品种间进行，通过表格的“数据→重复项→高亮显示重复项”功能，对标示背景颜色或者字体加粗显示的倒数第三个SSR位点具有相同基因型的品种对应的所有未标示背景颜色或者字体加粗显示的SSR位点进行重复项查找。
所述标示背景颜色或者字体加粗显示的基因型数据即为区分相应品种的特征指纹数据，在表格所涉及的品种范围内仅用特征指纹数据即可区分和鉴定相应品种。
所述对没有指纹数据的果树品种进行SSR标记区分时，无需执行依据基因型数目调整SSR位点的排列位置。
所述标示的SSR引物位点可作为一套用于相应果树品种鉴定的SSR核心引物。
所述标示的SSR指纹数据为相应果树品种的SSR特征指纹数据，所有品种的SSR特征指纹数据的集合组成果树品种SSR特征指纹数据表。
下文将结合具体实施例对本发明做进一步描述。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例1以梨树为例进一步阐述本发明。
参试梨树品种如下：1-白皮酥、2-高平大黄、3-汉源大白梨、4-冀蜜、5-金川雪梨、6-金华早、7-晋州大鸭梨、8-彬县老遗生、9-巨鹿小木梨、10-苹果梨、11-胎黄梨、12-天生伏、13-泊头大鸭梨、14-万荣金梨、15-香茌、16-香水、17-孝义伏、18-兴隆麻梨、19-雪花、20-鸭梨、21-赵县大鸭梨、22-郑家梨、23-薄山池梨、24-茌梨、25-崇化大、26-砀山酥、27-利布林、28-日面红、29-身不知、30-绿安久、31-外引红梨、32-八月红、33-花红梨、34-火把、35-龙泉酥、36-鲁南黄皮水、37-马蹄黄、38-苍溪雪梨、39-蒲瓜梨、40-水葫芦、41-巍山红雪梨、42-文山红雪梨、43-袖珍、44-云南黄酸梨、45-大叶雪、46-德胜香梨、47-福安尖把、48-赤穗、49-二十世纪、50-江岛、51-太白、52-晚三吉、53-新世纪、54-新水、55-早生赤、56-红糖梨、57-红霄梨、58-满园香、59-面酸梨、60-南果、61-庶梨、62-酥梅、63-洋红霄、64-窑酸梨、65-海棠酥、66-黄句句梨、67-霍城冬黄梨、68-霍城黄句句、69-库尔勒香梨、70-兰州长把、71-酸称砣、72-兴义海子梨。
本试验中筛选出的12对普通SSR引物均来源于报道的序列(Liebhard et al.，2002；Yamamoto et al.，2002a，2002b；Fan al.，2013)，为节省成本，使用了TP-U19-SSR(即simple sequence repeat with tailed primer U19)技术。
表1U19的序列
表2引物名称及序列
梨树品种经PCR扩增，PCR产物经电泳检测后，按照“小分子量/大分子量”或“分子量/分子量”的格式，统计果树品种在各SSR位点的基因型。
将统计的基因型数据按照“梨树品种名”和“SSR位点”录入数据处理软件，如图1所示。
新增一条“基因型数目”的记录，统计各SSR位点在梨树品种中的基因型数目，如图2所示。
根据“基因型数目”由多到少以降序形式调整SSR位点字段的排列位置，使基因型数目多的SSR位点排前面，少的排后面，如图3所示。
将所有梨树品种以第一个SSR位点为关键字，按升序排序，根据排序结果，将第一个SSR位点中唯一的基因型数据字体加粗显示，表明相应果树品种被区分出来，如图4所示。
将第一个SSR位点基因型相同而不能区分的果树品种，再以第二个SSR位点为关键字，按升序排序，根据排序结果，将第二个SSR位点中参与排序部分唯一的基因型数据连同相应品种在前面SSR位点的基因型数据字体加粗显示，表明相应果树品种被区分出来，如图5所示。
将第一个和第二个SSR位点基因型相同而不能区分的果树品种，再以第三个SSR位点为关键字，按升序排序，根据排序结果，将第三个SSR位点中参与排序部分唯一的基因型数据连同相应品种在前面SSR位点的基因型数据字体加粗显示，表明相应果树品种被区分出来，如图6所示。
查找重复项，重复项用斜体字并加粗标示出来。每一位点都有重复项，说明剩余位点无法替代KA16和NB105a两个位点，本排列已经是最少的SSR位点组合了，故不需要再继续寻找重复项了，如图7所示。
最终梨树品种SSR特征指纹数据图表生成如图8所示，SSR核心引物位点为CH04h02、KA16和NB105a。
对没有指纹数据的果树品种进行SSR标记区分时，仅需对前一对SSR引物不能区分开的品种继续进行SSR扩增和排序即可，无需执行依据基因型数目调整SSR位点的排列位置。
本发明的有益效果在于，操作简便，检测结果准确可靠、稳定高效，为果树品种区分、鉴定及种质资源交换、管理和利用提供了可靠、实用的技术手段。更重要的是品种特征指纹表的内容还可由其他研究者进行不断地充实，其开放性更利于同行间的交流和共享，从而能够群策群力整合尽可能多的资源，形成完善、实用的果树品种鉴定技术体系，应用前景广阔。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
Claims (4)
1.一种基于SSR基因型的梨树品种区分及特征指纹展示方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
梨树品种为：白皮酥、高平大黄、汉源大白梨、冀蜜、金川雪梨、金华早、晋州大鸭梨、彬县老遗生、巨鹿小木梨、苹果梨、胎黄梨、天生伏、泊头大鸭梨、万荣金梨、香茌、香水、孝义伏、兴隆麻梨、雪花、鸭梨、赵县大鸭梨、郑家梨、薄山池梨、茌梨、崇化大、砀山酥、利布林、日面红、身不知、绿安久、外引红梨、八月红、花红梨、火把、龙泉酥、鲁南黄皮水、马蹄黄、苍溪雪梨、蒲瓜梨、水葫芦、巍山红雪梨、文山红雪梨、袖珍、云南黄酸梨、大叶雪、德胜香梨、福安尖把、赤穗、二十世纪、江岛、太白、晚三吉、新世纪、新水、早生赤、红糖梨、红霄梨、满园香、面酸梨、南果、庶梨、酥梅、洋红霄、窑酸梨、海棠酥、黄句句梨、霍城冬黄梨、霍城黄句句、库尔勒香梨、兰州长把、酸秤砣、兴义海子梨；
以等位基因数量多，多态性高，稳定性好为标准，筛选用于梨树品种鉴定的如下12对SSR引物；
梨树品种经PCR扩增，PCR产物经电泳检测后，按照“小分子量/大分子量”的格式，统计梨树品种在各SSR位点的基因型；
将统计的基因型数据按照“品种名”和“SSR位点”录入数据处理软件整合处理，形成梨树品种SSR特征指纹数据表；
对没有指纹数据的梨树品种进行SSR标记区分时，仅需对前一对SSR引物不能区分开的品种继续进行SSR扩增和排序即可；
进行相应梨树品种鉴别时，只需按顺序考察比对SSR特征指纹数据表中相应SSR位点的基因型数据即可，其中，所述SSR特征指纹数据表中，SSR核心引物位点为CH04h02、KA16以及NB105a；
所述数据处理软件整合处理包括：
新增一条“基因型数目”的记录，统计各SSR位点在梨树品种中的基因型数目；
根据“基因型数目”由多到少以降序形式调整SSR位点字段的排列位置，使基因型数目多的SSR位点排前面，少的排后面；
将梨树品种以某SSR位点为关键字排序，并标示SSR位点中唯一的基因型作为品种区分，直至所有梨树品种均被标示区分为止；
若所有SSR位点均已排序仍存在不能区分的梨树品种，整合处理终止，指示返回增加SSR引物以进行区分，直至所有梨树品种均被标示区分为止；
将冗余SSR位点剪切到所有SSR位点之后，并去除标示；
在最后两个标示位点区分的品种中对所有未标示的SSR位点进行重复项查找，将未找到重复项的SSR位点剪切到这两个SSR位点之前，取代相应两个SSR位点，并标示；
去除被取代的SSR位点的标示；
重复上述步骤用以优化，以达到用尽可能少的SSR引物位点区分梨树品种；
其中，所述以某SSR位点为关键字排序时，按照各位点基因型数目权重，逐个SSR位点或以3个SSR位点为单位分批进行，上一批位点排序后未区分的品种进入下一批位点排序，直至所有品种都能被区分。
2.如权利要求1所述的一种基于SSR基因型的梨树品种区分及特征指纹展示方法，其特征在于，所述电泳检测为荧光毛细管电泳检测或PAGE胶检测。
3.如权利要求1所述的一种基于SSR基因型的梨树品种区分及特征指纹展示方法，其特征在于，所述SSR位点的基因型为纯合基因型时，按照“分子量/分子量”的格式统计。
4.如权利要求1至3任一项所述的一种基于SSR基因型的梨树品种区分及特征指纹展示方法，其特征在于，对没有指纹数据的梨树品种进行SSR标记区分，无需执行依据基因型数目调整SSR位点字段的排列位置。
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| Genetic diversity and similarity of pear（Pyrus L.）cultivars native to East Asia revealed by SSR （simple sequence repeat） markers;BAO L等;《Genetic Resources and Crop Evolution》;20071231;第54卷;959-971 * |
| 利用SSR荧光标记构建92个梨品种指纹图谱;高源等;《园艺学报》;20121231;第39卷(第8期);1437-1446 * |
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