CN1482257A - 一种莲藕dna指纹图谱构建的分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莲藕DNA指纹图谱构建的分子标记方法，其步骤是：首先是DNA提取，剪取莲藕幼嫩叶片，提取总DNA；其次是PCR扩增，对引物进行筛选，对莲藕品种的基因组进行扩增；第三是PCR产物鉴定，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，EB染色后用扫描仪扫描记录；第四是数据分析，根据照片上各材料各引物扩增情况作记录，计算莲藕品种间的相似系数，进行聚类分析；第五是DNA指纹图谱的构建，根据照片上引物扩增情况，绘制莲藕的DNA指纹图谱。本发明过程简便，操作方便、安全，结果准确、有效，该方法适用于莲藕品种登记和鉴定。

Description

一种莲藕DNA指纹图谱构建的分子标记方法

技术领域：

本发明涉及莲藕的分子标记与DNA指纹图谱构建，更具体涉及一种莲藕DNA指纹图谱构建的分子标记方法，适用于莲藕品种资源的鉴定。

背景技术：

莲藕是我国重要的水生经济植物，栽培历史悠久。我国种植较多，尤其是近十多年来，在我国的种植面积增长很快，其次是日本和印度，其它东南亚国家和美国、俄罗斯有少量种植。

从莲藕品种资源看，八十年代初期，国内外广泛征集的品种只有125份，而经过近二十年的选育与应用，已衍生出几百个品种，据不完全统计，目前莲藕品种数量已达近500份。由于涉及多家研究单位，研究工作的不规范，导致品种来源系谱不清、同种材料不同记名等，此结果显然不利于莲藕杂交育种的亲本选择与可持续利用。因此，开展莲藕遗传资源研究、鉴定，建立核心种质资源库已成为当务之急。

生物指纹图谱是能够鉴别生物个体之间差异的电泳图谱。这种电泳图谱多态性丰富，且具有高度的个体特异性和环境稳定性，就像人的指纹一样，因而被称为“指纹图谱”。指纹图谱技术极其适合于品种的鉴定工作。

作物品种指纹图谱目前主要有两种类型：一类是较早开始研究的蛋白质电泳指纹图谱，另一类是90年代之后发展起来的DNA分子标记指纹图谱。“DNA指纹图谱”一词可以泛指一切具有某一种质特异性的谱带，借助指纹图谱，可以区分不同的种质资源。指纹图谱是鉴别品种、品系的有力工具。

目前，广泛应用于DNA指纹图谱绘制的分子标记主要包括以下5种：

RFLP分析：限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)，是近年来发展起来的以生物基因组DNA序列变异为基础研究不同基因组差异的一项新技术。RFLP不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响；在数量上不受限制，检测方便；具有稳定遗传和特异性；而且用于检测RFLP的克隆探针可随意选择，可以是核糖体DNA、叶绿体DNA或总DNA，这样就可以产生大量的多态性，为研究植物类群特别是属间、种间甚至品种间的亲缘关系、系统发育与演化提供有力的依据。由于RFLP技术复杂，所需DNA量大，对所研究对象需要有一定的遗传背景知识，目前已逐渐被其它分子标记所代替。

RAPD分析：随机扩增DNA多态性(RAPD)是J.Williams和J.Welsh两个研究小组在1990年发展起来的一种新型遗传标记，它是以人工合成的随机引物对基因组DNA进行扩增而产生能显示多态性的DNA指纹图谱，RAPD是一种基于序列的多态性，由于可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下对某一物种进行指纹图谱的构建、遗传多样性的研究；相对于RFLP来说比较经济简便，DNA用量也少(ng级)；而且避免了使用放射性同位素，因而近年来在品种资源鉴定方面得到了广泛的应用。但是，RAPD在目前主要存在以下两个问题：①重复性和稳定性较差，有许多因素均会影响RAPD的扩增结果，在进行RAPD分析之前，要反复进行RAPD反应条件优化实验，以得到令人信服和可靠的结果。②RAPD过于灵敏，而且一般为显性标记，有时会使遗传分析变得复杂化。因为有的RAPD标记不依照预期的遗传样式，在研究中运用RAPD标记时应当非常谨慎。

小卫星DNA(VNTR)：1980～1984年，人类遗传学家相继在人体基因组中发现了一些串联重复序列，这些序列由长度为11～60bp的核心序列串联重复而成，后来称之为小卫星DNA。由于重复单位的数目不同和重复拷贝数的等位性不同，使其表现出高度多态性。不同生物、同一生物的不同品种，甚至同一品种的不同个体，其所含小卫星各异，杂交产生的图谱各不相同，谱带遵循孟德尔遗传方式遗传并具有体细胞稳定性。这些特点使之成为目前较先进的遗传标记系统而广泛应用在许多作物的品种鉴定和遗传多样性研究中。

SSR(微卫星)技术：SSR是一类由几个核苷酸(一般为15个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。植物体内的二核苷酸重复(AT)n远比哺乳动物丰富，植物基因组中平均每隔2Kb就有一个三核苷酸或四核苷酸重复，且每种类型的SSR在不同的物种中出现的频率不同。SSR多态性的信息量非常丰富，具有所有RFLP的遗传学优点，又比RAPD重复性能和可信度高，因而是目前遗传标记中的热点。但是由于SSR必须针对每个染色体座位的微卫星，发现其两端的单拷贝序列以设计引物，因而给SSR标记的利用带来了一定困难，然而一旦开发出某种生物的SSR标记，就又显现出该标记的利用价值。SSR目前已广泛应用于许多农作物中。

AFLP技术：AFLP技术是1993年由荷兰生物技术公司KEYGENE的Zabeau和Vos等人发明的，已申请了专利。AFLP实际上是RFLP和PCR相结合的一种方法。与RAPD一样，AFLP可以用于没有任何分子生物学研究基础的物种，其引物在不同物种间是通用的，被称为一种“半随机”的扩增。一个05mg的DNA样品，可做4000个AFLP反应，获得8万个标记，650万条带纹。可见AFLP的多态性非常高。利用放射性标记或银染方法在变性的聚丙烯酰胺凝胶上通常可检测到50～100个扩增产物，而且重复性强，因而非常适合于品种指纹图谱的绘制、遗传连锁图的构建及遗传多样性研究等。多数作物上的研究结果都表明其产生的多态性远远超过了RFLP、RAPD等，目前被认为是DNA指纹图谱技术中多态性最为丰富的一项技术。实际上，AFLP最适的应用范围，也是Zabeau和Vos申请专利的关键，就是利用AFLP技术鉴定品种的指纹，检测品种的质量和纯度。由于AFLP已申请专利，因而它在生产及商业上的应用受到限制。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种莲藕DNA指纹图谱构建的分子标记方法，实验过程简便，操作方便、安全，实验结果准确、有效。该方法能够用于莲藕新品种登记和品种鉴定、莲藕品种纯度和真实性检验、莲藕品种的亲缘关系和分类分析、以及用于莲藕基因组作图。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明提出的方法有如下步骤：

1、DNA提取。每个莲藕品种剪取幼嫩叶片2～5g，每份材料按高盐低PH法提取总DNA。

2、PCR扩增。对10-mer引物进行筛选，并使用PCR热循环仪分别对所研究的莲藕品种的基因组DNA进行扩增。温度控制在32-37℃，在PCR热循环仪上循环42-47周期。

3、PCR产物鉴定。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，EB染色后用扫描仪扫描记录或照像。

4、数据分析。根据照片上各材料各引物扩增情况作记录，有带记为1，无带记为0。按根井正利(Nei)的方法计算莲藕品种间的相似系数(GS)，进而按平均距离法(UPGMA法)进行聚类分析。

5、DNA指纹图谱的构建。根据照片上各材料各引物扩增情况，挑取具有代表性(稳定性和重复性良好的)的RAPD(随机扩增DNA多态性)多态性带，绘制莲藕的DNA指纹图谱。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

品种鉴定和种子纯度检测在生产上相当重要，而检测方法对种子准确鉴定具有重要的意义。田间形态观察的方法在上世纪70年代以前是主要的检测方法，在品种鉴定和纯度分析上起过很重要的作用，但随着育种亲本的利用集中化，品种鉴定愈来愈困难，传统的形态学方法愈来愈不适应品种鉴定和纯度分析。DNA分子标记的出现，有利于品种鉴定和纯度分析，目前DNA分子标记技术鉴定品种和纯度分析已在重要农作物生产上广泛应用。但该方法在莲藕种质资源研究与莲藕生产上还未见到报道，至今，莲藕品种的鉴定与区分仍然采用最原始的田间形态观察方法，这对莲藕的研究与产业化发展极为不利。考虑到RFLP分析的复杂性、AFLP已被发明人申请专利、以及小卫星DNA(VNTR)与SSR(微卫星)技术需要了解实验材料的遗传背景等，本发明以RAPD分析技术为基础，针对莲藕的基因组特点，研究了一种莲藕分子标记方法。其一，该方法填补了莲藕品种资源研究尤其是莲藕遗传资源DNA指纹图谱的空白；其二，该方法比目前在莲藕品种鉴定中所采用的田间形态观察法更准确、更有效，而且本专业领域的专业人员均能使用；其三，绘制的莲藕品种DNA指纹图谱简明、直观，适于计算机管理。

附图说明：

图1为以一种莲藕DNA指纹图谱构建的分子标记方法所绘制的DNA指纹图谱的模式图。

具体实施方式：

DNA提取：每个莲藕品种剪取新鲜幼叶2.5g，每份材料按高盐低pH法提取总DNA。去RNA后用24∶1的氯仿异戊醇抽提一次，最后溶于0.1×TE中。经调整浓度后用于PCR扩增。

PCR扩增：用红花莲作模板对150个OPERON公司的10-mer引物进行筛选，从中选出20个扩增稳定、多态性丰富的引物，再分别对研究材料进行扩增。10μL反应体系中含5ng DNA模板，0.5U Taq DNA聚合酶。退火温度为35℃。在PCR热循环仪上循环45周期。

PCR产物的鉴定：用1.5％琼脂糖电泳(TBE系统)、EB染色鉴定扩增产物。在Fotodye紫外透射仪上观察，光敏纸成像或照相。DNA分子量标准为100bp Ladder(LKB公司)。

数据资料的分析：统计8个能产生多态位点的引物在41个莲藕品种的DNA样品中扩增的电泳带总数与多态性带的数目。在电泳图谱上同一RAPD位点上有电泳带记录为1，无电泳带记录为0。作0，1矩阵图输入计算机。按根井正利(Nei)的方法计算莲藕品种间的相似系数(GS)，从而得遗传差异GD＝1-GS。利用GD按平均距离法(UPGMA法)进行遗传分类。

DNA指纹图谱的构建：按照上述照片上各材料各引物扩增情况，挑取具有代表性的(稳定性和重复性良好的)RAPD多态性带，绘制(15个生产上栽培的)莲藕品种的DNA指纹图谱。在这一DNA指纹图谱中，每个莲藕品种均有其特异的DNA指纹，可以把这15个品种彼此区分开(图1)。

Claims (1)

1、一种莲藕DNA指纹图谱构建的分子标记方法，其步骤：

A、DNA提取，对莲藕品种剪取幼嫩叶片，按高盐低PH法提取总DNA；

B、PCR扩增，对10-mer引物进行筛选，并使用PCR热循环仪分别对莲藕品种的基因组DNA进行扩增，温度控制在32-37℃，在PCR热循环仪上循环42-47周期；

C、PCR产物鉴定，扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，EB染色后用扫描仪扫描记录；

D、数据分析，根据照片上各材料各引物扩增情况作记录，有带记为1，无带记为0，按Nei的方法计算莲藕品种间的相似系数，再按平均距离法进行聚类分析；

E、DNA指纹图谱的构建，根据照片上引物扩增情况，挑取具有代表性的RAPD多态性带，绘制莲藕品种的DNA指纹图谱。