CN1944649A - 一种菜用大豆dna指纹图谱及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菜用大豆品种的DNA指纹图谱及其构建方法和应用。该指纹图谱是以28个菜用大豆品种/系为供试材料，通过DNA的提取、PCR扩增、PCR产物的鉴定、数据分析，最终构建DNA指纹图谱。该指纹图谱可用于菜用大豆品种/系和纯度的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种植物DNA指纹图谱及其构建方法和用于植物品种鉴定的应用。
背景技术
菜用大豆是近年发展起来的深受国际市场欢迎的重要特色蔬菜之一，尤其是我国南方居民喜食的传统特色蔬菜，年栽培面积达500万亩以上，并有不断扩大的趋势。
菜用大豆新品种的选育一直是日本和我国台湾省大豆育种家的主攻目标。我国台湾省育种家自上个世纪50年代就开始菜用大豆的育种研究，先后推出了台290、台292、台75-1、9308、KVS844和KVS862等多个优良品种，其中台292和台75-1以其大荚、大粒、灰白毛和优良的口感品质等特征成为我国南方地区出口生产上的主打品种。
中国菜用大豆的育种始于20世纪80年代后期，相继育成的品种有萧垦8901、泉豆8473、安豆三号、淮哈豆1号、华春18号和地神21号等，但这些品种均系粒用品种的系选或有性杂交而成，鲜豆粒吃口硬，风味差，不适合速冻加工，且成熟期偏晚。近几年，上海市农业科学院相继育成推出了青酥系列早熟、优质菜用大豆新品种，填补了我国南方春播型菜用大豆品种的市场空白，栽培面积迅速扩大。
由于菜用大豆属严格自花授粉作物，留种较为容易，育成新品种一投放于市场，就很快被不法种子商们冠以新的名称，纷纷自行扩繁推广，致使种子市场菜用大豆的品种极为混乱，既损坏了品种育成单位和种子经营单位的利益，也不利于国家有关菜用大豆品种推广中种子质量的控制，以及菜用大豆杂交育种中亲本的选择与可持续利用。
生物指纹图谱是能够鉴别生物个体之间差异的电泳图谱。这种电泳图谱多态性丰富，且具有高度的个体特异性和环境稳定性，就像人的指纹一样，因而被称为“指纹图谱”。指纹图谱技术极其适合于品种的鉴定和登记。
作物品种指纹图谱目前主要有两种类型：一类是较早研究开发的蛋白质电泳指纹图谱，另一类是90年代之后发展起来的DNA分子标记指纹图谱，即“DNA指纹图谱”，该词可以泛指一切具有某一种质特异性的谱带，借助DNA指纹图谱，可以区分不同的品种，是鉴定品种、品系的有力工具。
目前广泛应用于DNA指纹图谱绘制的分子标记主要包括以下5种：
RFLP技术：即限制性内切酶片断长度多态性(RFLP)，是近年发展起来的以生物基因组DNA序列变异为基础，研究不同基因组差异的一项新技术。RFLP技术不受显隐型关系、环境条件和发育阶段的影响；在数量上不受限制，检测方便；具有稳定遗传和特异性；而且用于检测RFLP的克隆探针可随意选择，可以是核糖体DNA、叶绿体DNA或总DNA，这样就可以产生大量的多态性，为研究植物的类群，特别是属间、种间甚至品种间的亲缘关系、系统发育与演化提供有力的依据。但因RFLP技术复杂，研究所需DNA量大，所研究对象需要有一定的遗传背景，目前已逐渐被其它分子标记技术所代替。
RAPD技术：即随机扩增DNA多态性(RAPD)，是J.Williams和J.Welsh两个研究小组在1990年发展起来的一种新型遗传标记，它是以人工合成的随机引物对基因组DNA进行扩增而产生能显示多态性的DNA指纹图谱，RAPD技术是一种基于序列的多态性，其可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下对某一物种进行指纹图谱的构建、遗传多样性的研究，相对于RFLP技术来说比较经济简便，DNA用量也少(ng级)；而且避免了使用放射性同位素，近年来在品种资源研究方面得到了广泛的应用。但目前RAPD技术尚存在以下两个问题：(1)重复性和稳定性差，有许多因素会影响RAPD的扩增结果，在进行RAPD分析之前，要反复进行RAPD分析条件的优化实验。(2)过于灵敏，使遗传分析变得复杂化，因为有的RAPD标记不依照预期的遗传样式。
小卫星DNA(VNTR)技术：1980～1984年，人类遗传学家相继在人体基因组中发现了一些串联重复序列，这些序列由长度为11～60bp的核心序列串联重复而成，后来称之为小卫星DNA。由于重复单位的数目不同和重复拷贝数的等位性不同，使其表现出高度多态性。不同生物、同一生物的不同品种，甚至同一品种的不同个体，其所含小卫星各异，杂交产生的图谱各不相同，谱带遵循孟德尔遗传方式遗传，并具有体细胞稳定性。这些特点使之成为较先进的遗传标记系统，而广泛应用在许多作物的品种鉴定和遗传多样性研究中。
SSR(微卫星)技术：SSR是一类由几个核苷酸(一般为15个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。植物体内的二核苷酸(AT)n远比哺乳动物丰富，植物基因组中平均每隔2Kb就有一个三核苷酸或四核苷酸重复，且每种类型的SSR在每种物种中出现的频率不同。SSR多态性的信息量非常丰富，具有所有RFLP的遗传学优点，又比RAPD重复性能和可信度高，因而是目前遗传标记中的热点。但由于SSR必须针对每个染色体座位的微卫星，发现其两端的单拷贝序列以设计引物，因而给SSR标记的利用带来了一定困难，然而一旦开发出某种生物的SSR标记，就显现出该标记的利用价值。SSR目前已广泛应用于多种农作物的鉴定和标记中。
AFLP技术：AFLP技术是1993年由荷兰生物技术公司KEYGENE的Zabeau和Vos等人发明的，已申请了专利。AFLP技术是RFLP和PCR相结合的一种方法。与RAPD一样，AFLP可以用于没有任何分子生物学研究基础的物种，其引物在不同物种间是通用的，被称为一种“半随机”的扩增。一个0.5mg的DNA样品，可作4000个AFLP反应，获得8万个标记，600万条带纹。可见AFLP的多态性非常高。利用放射性标记或银染方法在变性的聚丙烯酰胺凝胶上通常可以检测到50～100个扩增产物，而且重复性强，因而非常适合于品种指纹图谱的绘制、遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究等。多数作物上的研究结果都表明其产生的多态性远远超过了RFLP、RAPD等，目前被认为是DNA指纹图谱技术中多态性最为丰富的一项技术。实际上，AFLP最适的应用范围，也是Zabeau和Vos申请的专利的关键，就是利用AFLP技术鉴定品种的指纹，检测品种的质量和纯度。由于AFLP已申请专利，因而它在生产及商业上的应用受到限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种菜用大豆DNA指纹图谱及其构建方法和应用，以解决现有技术的缺陷。
本发明首先提供了一种菜用大豆DNA指纹图谱，首先本发明选用如表1所示的28个菜用大豆品种/系为供试材料，选材以生产上广泛应用的早、中熟优质菜用大豆品种为主，包括一些高代自交系和育种材料，具有较好的代表性。
表1 28个菜用大豆品种/系的来源和特性
| 编号 | 品种名称 | 来源 | 主要特性 |
| 1 | 沪选一号 | 新品系 | 优质、早熟、耐弱光 |
| 2 | 青酥四号 | 自育品种 | 早中熟、优质、丰产 |
| 3 | 改良95-1 | 新品系 | 早熟、优质、耐热性好 |
| 4 | 23-10 | 有性杂交 | 育种材料 |
| 5 | 23-21 | 有性杂交 | 育种材料 |
| 6 | 白狮子 | 日本引进 | 早中熟、优质、较耐低温 |
| 7 | 23-2 | 有性杂交 | 育种材料 |
| 8 | VS-11 | 系选 | 育种材料 |
| 9 | AVR-1 | 亚蔬引进 | 特早熟、优质、耐低温 |
| 10 | 沪宁95-1 | 自育品种 | 特早熟、优质、耐低温、耐弱光 |
| 11 | 早生白毛 | 日本引进 | 早熟、优质、对光温不敏感 |
| 12 | 25-1 | 有性杂交 | 育种材料 |
| 13 | 25-2 | 有性杂交 | 育种材料 |
| 14 | 25-41 | 有性杂交 | 育种材料 |
| 15 | 沪23-9 | 新品系 | 早中熟、优质、丰产、耐高温 |
| 16 | AVR-3 | 亚蔬引进 | 中早熟、优质、丰产、耐瘠薄 |
| 17 | 青酥二号 | 自育品种 | 早熟、优质、丰产、对光温不敏感 |
| 18 | 台292 | 台湾引进 | 中熟、优质、丰产 |
| 19 | 美引大粒王 | 美国引进 | 中熟、丰产、大粒 |
| 20 | 百鸟王 | 日本引进 | 中熟、优质、大粒、棕毛 |
| 21 | 绿岭一号 | 日本引进 | 中早熟、优质 |
| 22 | 辽鲜一号 | 辽宁 | 早中熟、优质、货架期长 |
| 23 | 苏鲜三号 | 江苏 | 中熟、丰产、较耐热 |
| 24 | 苏鲜四号 | 江苏 | 中熟、优质、较耐热 |
| 25 | 徐系128 | 江苏徐州 | 中晚熟、丰产 |
| 26 | 通鲜一号 | 江苏南通 | 中晚熟、丰产、较耐热 |
| 27 | 日本晴三号 | 日本引进 | 中熟、优质 |
| 28 | VS-9 | 系选 | 育种材料 |
根据上述28个品种所建立的指纹图谱用数字表示为：
0100010011010，0111110100100，0111111101111，0110111111111，
0110101101000，0001111111110，0111111110111，0110111111100，
1111111111110，0111011110111，0111110111111，0111111111101，
0111101111100，0101111111111，0011111101111，0011110111111，
0111111110111，0011111101100，0110010111000，0100010111010，
1111111111111，1101101111011，1011111111111，0111111110000，
1110111111111，1111010110111，1111010111111，1111111110111。
其中，“1”代表图谱中某个位置上有扩增条带存在，而“0”代表图谱中某个位置上没有扩增条带存在。
而数字表示的指纹图谱用附图的形式表示，即为附图1，其中附图中的“-”相对应的是数字中的“1”，而数字中的“0”在附图中则为空白。
本发明还提供了上述菜用大豆指纹图谱的构建方法，该方法包括如下步骤：菜用大豆DNA的提取；PCR扩增引物的筛选，PCR扩增产物的电泳检测，条带分子量大小的测定及菜用大豆DNA指纹图谱的构建。
具体步骤为：
①、DNA的提取：剪取每个菜用大豆品种的幼嫩叶片(2～5g)，提取其总DNA；
②、PCR扩增：应用表2中的13对引物，使用PCR热循环仪分别对所研究的菜用大豆品种的基因组DNA进行扩增。在PCR热循环仪上循环30个周期，对模板进行扩增；
③、PCR产物的鉴定：扩增产物进行8％丙烯酰胺垂直凝胶电泳，银染后用Bio-Rad凝胶扫描系统扫描照相；
④、数据分析：按照照片上各材料在各引物上的扩增情况作记录，有带的记为1，无带的记为0；按照井正列(Nei)的方法计算菜用大豆品种间的相似系数(Gs)，再按照平均距离法(UPGMA法)进行聚类分析；
⑤、DNA指纹图谱的构建：按照照片上各材料在各引物上的扩增情况，挑取具有代表性(稳定性和重复性良好)的SSR多态性带，绘制菜用大豆品种/系的DNA指纹图谱。
表2 13对引物的序列
| 上游引物序列(5′→3′) | 下游引物序列(5′→3′) | |
| 1 | GCGATAAATGGTTAATGTAGATAA | GCGAAAGGACAGATAGAAAGAGA |
| 2 | TCCGCGAGATAAATTCGTAAAAT | GGCCAGATACCCAAGTTGTACTTGT |
| 3 | GCGAACTGTAGTTTACTAAAAATAAGTG | GCGGACTGAATTAATATTGGTGTTGAATT |
| 4 | TTGCACAGTTGATTTTTGTTT | GCATCGAATTTCTGGATTTAC |
| 5 | CAACACCCTAGCATAGTCA | AGCAGGTATGAAATGAAATT |
| 6 | GAGAAAGAAATGTGTTAGTGTAA | CTTTTCCTTCTTATTGTTTGA |
| 7 | TGGTAAAGGAGGAACTT | AGAATGTGCTGATGACA |
| 8 | GCGTTGCTTGCTAAGTAGTGTTTTTAATCCT | GCGTCTCCCATCATGCAACTTCAATA |
| 9 | CTCCTCCTGCGCAACAACAATA | GGGGGATCTAGGCCATGAC |
| 10 | GCGTAAATCTGATATATGTTACCACTGA | GCGTAATACGCAAAACATAATTAGCCTA |
| 11 | GCGTTTTAATTTATGATATAACCAA | GCGTTTTATCTCTTTTTCCACAAC |
| 12 | TGCGCCATTTATTCTTCA | AAGCGAAATCACCTCCTCT |
| 13 | GCGCATATGAATAGGTAAGTTGCACTAA | GCGTTTTCCTACAATAATATTTCAT |
本发明与现有技术相比，具有如下优势和效果：
品种鉴定和种子纯度分析在农业生产上极其重要，而检测方法的准确性和可靠性对鉴定结果至关重要。上世纪80年代以前，田间形态观察的方法在作物品种鉴定和种子纯度分析上起过极其重要的作用，但随着品种的丰富和育种亲本利用的集中化，品种鉴定愈来愈困难，传统的形态学方法已愈来愈不适应品种鉴定和纯度分析。DNA分子标记方法的出现，使我们能够用分子生物学方法进行品种鉴定和纯度分析。目前，利用DNA分子标记技术进行品种鉴定和种子纯度分析已在重要农作物生产上广泛应用。但该方法在菜用大豆种质资源研究及菜用大豆种子生产上还未见到报道，至今，菜用大豆品种的鉴定与区分仍然采用最原始的田间形态观察方法，这对菜用大豆新品种的选育及良种产业化发展极为不利。考虑到RFLP分析的复杂性、AFLP已被发明人申请专利、以及小卫星DNA(VNTR)与SSR(微卫星)技术需要了解实验材料的遗传背景等，本发明以SSR分析技术为基础，针对菜用大豆的基因组特点，研究建立了一种菜用大豆品种/系DNA指纹图谱及其构建方法和应用，
本发明具有以下优势：
(1)本发明填补了菜用大豆品种资源研究尤其DNA指纹图谱研究的空白；
(2)应用本发明的指纹图谱进行菜用大豆品种坚定比目前用在菜用大豆品种鉴定中所采用的田间形态观察法更准确、简便，本专业领域的专业人员均能使用；
(3)本发明的菜用大豆品种/系DNA指纹图谱简明、直观，适于计算机管理。
附图说明：
图1 28个菜用大豆品种/系的DNA指纹图谱
其中：横坐标为28个菜用大豆品种/系的编号；纵坐标为构建该DNA指纹图谱所用的13对引物的编号。“-”表示扩出了特异带，“ ”表示没有扩增出特异带。
具体实施方式
实施例1构建菜用大豆指纹图谱：
1、DNA的提取
采取各品种/系的新鲜叶片磨样，利用CTAB法提取其DNA，所得的DNA原液利用EB法测其浓度，然后稀释成10ng/ul左右DNA稀释液。
2、PCR扩增
PCR反应在型号为PTC-225的PCR扩增仪上进行。反应体系为10ul，其中包含：
模板基因组DNA溶液 4.5ul(10ng/ul)
10xbuffer(100mmol/l tris-Hclph8.0 1.36ul
500mmol/lkcl0.1％gelatin)
dNTP(10mM) 0.24ul
Taq酶(5u/ul) 0.1ul
Mg2+(25Mm) 0.8ul
引物(1ppm) 3.0ul
附PCR反应程序：
(1)94度预变性3min
(2)95度变性1min
(3)55度退火110s
(4)72度延伸60s
(5)72度保温8min
(6)4度保温
其中从第二步到第五步要重复循环30次
3、PCR扩增产物的电泳检测
PCR扩增产物中加入2ul Loading buffer(二甲苯氰缓冲液)，在8％聚丙烯酰胺胶(PAGE)上20W恒功率电泳1小时左右，然后银染检测。
具体步骤如下：
(1)玻璃板的组装
取干净的玻璃板成对组装并固定到北京六一厂产的型号为DYZ-30的电泳槽上，用0.1％的琼脂糖封住下部狭缝。
(2)灌胶
向装有8％的聚丙烯酰胺溶液的三角瓶中加入适量的10％过硫酸铵和四甲基乙二胺原液，混匀，静止2分钟左右。沿灌胶口将胶轻轻灌入，若胶中有气泡及时用细针将其挑出。插入梳子，等待胶液凝聚。
(3)点样和电泳
向电泳槽加入1XTBE电泳缓冲液，拔出梳子。在PCR扩增产物中加入2ul loading buffer。点样量视点样孔的多少而定。
电泳采用恒定功率，10w/胶板。大约电泳50～70min即可。
(4)卸胶和银染
电泳完毕后，倒出电泳缓冲液，卸胶。将胶放入固定液，在摇床上摇动固定至少15分钟；固定完毕后，将固定液倒出，加入渗透液，渗透10min(渗透时间要严格保证)；然后用纯水漂洗2～3次(30秒/次)，加入显色液进行显色，以能清楚地看到条带为准，停止显色，用清水清洗干净。
4、条带分子量大小的测定
将已经显色清楚的凝胶利用Bio-Rad的Quantity One软件进行凝胶成像扫描保存图像，并分析分子量大小(分子量大小以50bp ladder Marker为标准)。
5、数据资料的分析
统计13个能产生多态性的引物(引物序列见表2)在28个菜用大豆品种(系)的DNA样品中扩增的电泳带总数与多态性带的数目。在电泳图谱同一个SSR位点上有电泳带记录为1，无电泳带记录为0。作0，1矩阵图输入计算机。根据井正利(Nei)的方法计算菜用大豆品种间的相似系数(GS)，从而得遗传差异GD＝1-GS。利用GD按平均距离法(UPGMA法)计算遗传分类。
6、DNA指纹图谱的构建
按照上述照片上各材料各引物(13个SSR引物)扩增情况，挑取具有代表性的(稳定性和重复性良好的)SSR多态性带，绘制28个菜用大豆品种(系)的DNA指纹图谱。在该DNA指纹图谱中，每个菜用大豆品种(系)均有其特异的DNA指纹，可以把这28个品种(系)彼此区分开(见图1)。28个品种(系)的名称、来源等见表1。
实施例2
将本发明的菜用大豆DNA指纹图谱用于某个菜用大豆品种的真实性检测：
菜用大豆标准DNA指纹图谱建立以后，要对某个品种(系)进行鉴定时，用目前广泛应用的CTAB法提取DNA，用提取的DNA作为模板，用筛选出的13个引物对其进行PCR扩增，并根据各引物(引物序列见表2)在该菜用大豆品种(系)的DNA样品的电泳图谱同一个SSR位点上扩增出特异性条带的有、无，绘制出该批待测种子的DNA指纹图谱，与标准DNA指纹图谱进行对比，就可以知道它是用来构建DNA指纹图谱的28个菜用大豆品种(系)中的哪一个。
实施例3
将本发明的菜用大豆DNA指纹图谱用于某个菜用大豆品种的真实性检测：
如供试材料中的“青酥二号”菜用大豆品种是目前生产上大规模推广应用的优良品种，现有一批种子不能确定是否是真正的“青酥二号”种子，因此，按照本发明的方法建立这批种子的DNA指纹图谱，然后对照标准图谱进行对比鉴定。
鉴定结果：若它的DNA指纹与标准DNA指纹图谱中“青酥二号”的指纹是一致的，这批种子就是真正的“青酥二号”。如果待测样品的DNA指纹与标准DNA指纹图谱中“青酥二号”的指纹不是一致的，那么这批种子就不是真正的“青酥二号”。
Claims (3)
1.一种菜用大豆DNA指纹图谱，其特征在于该指纹图谱用数字表示为：
0100010011010，0111110100100，0111111101111，0110111111111，
0110101101000，0001111111110，0111111110111，0110111111100，
1111111111110，0111011110111，0111110111111，0111111111101，
0111101111100，0101111111111，0011111101111，0011110111111，
0111111110111，0011111101100，0110010111000，0100010111010，
1111111111111，1101101111011，1011111111111，0111111110000，
1110111111111，1111010110111，1111010111111，1111111110111；
其中，“1”代表图谱中某个位置上有扩增条带存在，而“0”代表图谱中某个位置上没有扩增条带存在。
2.一种构建权利要求1所述的指纹图谱的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
①、DNA的提取：剪取每个菜用大豆品种的幼嫩叶片，提取其总DNA；
②、PCR扩增：应用13对引物，对上述DNA进行扩增；
③、PCR产物的鉴定：扩增产物进行8％丙烯酰胺垂直凝胶电泳，银染后用Bio-Rad凝胶扫描系统扫描照相；
④、数据分析：按照照片上各材料在各引物上的扩增情况作记录，有带的记为1，无带的记为0；按照井正列的方法计算菜用大豆品种间的相似系数，再按照平均距离法进行聚类分析；
⑤、DNA指纹图谱的构建：按照照片上各材料在各引物上的扩增情况，挑取具有稳定性和重复性良好的SSR多态性带，绘制菜用大豆品种的DNA指纹图谱。
3.一种权利要求1所述的指纹图谱，可应用于菜用大豆品种/系的鉴定或纯度分析。
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