CN117757979A - 一种用于鉴定大豆品种的引物组、试剂盒及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种用于鉴定大豆品种的引物组、试剂盒及鉴定方法。引物组包括：第1引物对至第507引物对，每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第507引物对的正向引物和第507引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：1014所示。利用该引物组可通过多重PCR扩增和高通量测序获得待测样本的DNA指纹数据，再通过比较待测样本间的DNA指纹数据得到品种鉴定结论，且准确率和数字化程度高，可通过序列分析软件一次性比对成百上千个待测样本，快速获得品种鉴定结论，能显著提高大豆品种鉴定的准确率和效率。
Description
技术领域
本公开涉及分子鉴定技术领域，特别涉及一种用于鉴定大豆品种的引物组、试剂盒及鉴定方法。
背景技术
大豆是我国重要的粮食作物，其种子富含蛋白质和油脂，可用于食品、饲料、工业和能源生产等多个领域，对食品安全保障、可持续农业发展和推动可再生能源发展以及环境保护等方面具有重要作用。大豆拥有丰富的遗传资源，而且品种众多，因此精准高效鉴定大豆品种，对挖掘大豆的遗传资和品种具有重要意义。
目前，大豆的品种鉴定主要基于SSR(Simple Sequence Repeats，简单重复序列标记)，SSR标记法因受检测技术的限制，一次PCR扩增只能检测一个位点，因此在应用中只能鉴定少量的标记位点，使得其检测通量低，且DNA聚合酶反应时容易产生滑脱基因型，检测中难以区分滑脱基因型与样本的主基因型，易产生错误的判定结论。
公开内容
为了解决现有技术的问题，本公开实施例提供了一种用于鉴定大豆品种的引物组、试剂盒及鉴定方法。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种用于鉴定大豆品种的引物组，所述引物组包括：第1引物对至第507引物对，每个所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第1引物对的正向引物、所述第1引物对的反向引物至所述第507引物对的正向引物和第507引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：1014所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于鉴定大豆品种的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
又一方面，本发明实施例提供了一种鉴定大豆品种的方法，所述方法包括：将上述引物组用于鉴定大豆品种。
具体地，所述方法包括：
利用所述引物组对待测样本的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
纯化多重PCR扩增产物；
利用纯化后的多重PCR扩增产物构建高通量测序文库，获得待测样本的高通量文库；
纯化待测样本的高通量文库；
对待测样本的高通量文库进行测序，得到测序数据；
分析测序数据，获得DNA指纹数据；
将DNA指纹数据与对照样本进行比较，获得遗传相似系数；
根据遗传相似系数，获得所述待测样本与对照品种间的品种鉴定结论。
具体地，根据遗传相似系数，获得所述待测样本与对照品种间的品种鉴定结论包括：当所述遗传相似系数大于或等于96％时，判定所述待测样本与对照样本为疑同品种。
本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种用于鉴定大豆品种的引物组、试剂盒及鉴定方法，该引物组用于大豆品种鉴定种，在大豆品种鉴定和DNA指纹数据库构建等方面均具有良好的应用价值，为我国大豆品种的知识产权保护提供技术支撑，可促进产业健康发展。该鉴定方法一次PCR检测507个标记位点，一次测序可检测成百上千个样品，再通过生物信息分析软件一次快速分析获得成百上千个待测样本间的标记差异信息，从而快速获得品种鉴定结论，并且该鉴定方法获得的每个标记位点分型准确率达99.98％，从而实现了大豆品种鉴定的精准高效。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本公开实施例提供的待测样本的MNP标记检出位点数分布图，其中横坐标为待测样本，纵坐标为MNP标记位点检出率；
图2是本公开实施例提供的待测样本间MNP标记位点的差异比例分布图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。
本发明实施例提供了一种用于鉴定大豆品种的引物组，该引物组包括：第1引物对至第507引物对，每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第507引物对的正向引物和第507引物对的反向引物依次如序列表中SEQID NO：1至SEQ ID NO：1014所示，具体如表1所示。
表1为507对引物对的序列
上述引物组中的引物对之间不干扰，保证每个引物对均能够在同一个扩增反应中正常反应，并特异扩增目标基因序列。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于鉴定大豆品种的试剂盒，该试剂盒采用上述引物组。
又一方面，本发明实施例提供了一种采用上述引物组鉴定大豆品种的方法，该方法包括：
利用上述引物组对待测样本的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
纯化多重PCR扩增产物；
利用纯化后的多重PCR扩增产物构建高通量测序文库，获得待测样本的高通量文库；
纯化待测样本的高通量文库；
对待测样本的高通量文库进行测序，得到测序数据；
分析测序数据，获得DNA指纹数据；
将DNA指纹数据与对照样本进行比较，获得遗传相似系数；
根据遗传相似系数，获得待测样本与对照品种间的品种鉴定结论。
具体地，根据遗传相似系数，获得待测样本与待测样本的品种鉴定结论包括：当遗传相似系数大于或等于96％时，判定待测样本与对照样本为疑同品种。
实施例一
本实施例中待测样本为江汉大学收集的120份大豆样本。
提取待测样本的DNA：采用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒(货号：DP320)提取上述120份大豆样本叶片的DNA，得到120个待测样本的DNA，操作步骤详细见该试剂盒的说明书。然后分别取1μL待测样本的DNA用Qubit荧光定量仪测定待测样本的DNA浓度，在本实施例中，测得待测样本的DNA浓度均在20ng/μL～50ng/μL之间。
利用本发明实施例提供的引物组对待测样本的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物。
具体地，每个待测样本的扩增反应中均包括：4μL本发明实施例提供的引物组、4μL待测样本的DNA、10μL GenoPlexs 3×T Master Mix(生产商：石家庄博瑞迪生物技术有限公司)和12μL水，振荡混匀，得到混合物，将该混合物作为多重PCR扩增体系用于多重PCR扩增。多重PCR扩增程序：95℃3min；(95℃20sec，60℃4min)×17个循环；72℃4min，得到多重PCR扩增产物。
纯化多重PCR扩增产物。
具体地，然后使用DNA纯化磁珠(生产商：南京诺唯赞生物科技股份有限公司)对得到的多重PCR扩增产物进行纯化，操作步骤详细见该产品的说明书。
利用纯化后的多重PCR扩增产物构建高通量测序文库，获得待测样本的高通量文库。
具体地，向纯化后的多重PCR扩增产物中加入10μL GenoPlexs 3×T Master Mix、2μL浓度为5μM的华大测序仪接头引物(博瑞迪生物技术有限公司生产)和16μL水，并按如下程序进行PCR扩增反应：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，70℃30s)×8个循环；72℃最后延伸5min，于16℃结束反应。反应结束后，获得待测样本的高通量测序文库。
纯化高通量测序文库。具体地，使用DNA纯化磁珠对高通量测序文库进行纯化，得到纯化后的高通量测序文库，具体纯化方法参照该DNA纯化磁珠产品的说明书。
对高通量测序文库进行测序，得到测序数据。具体地，采用华大基因测序仪对高通量测序文库进行测序，得到测序数据，测序详细步骤参见该测序仪的使用说明书。
分析测序数据，获得DNA指纹数据。具体地，利用数据比对软件Bowtie2(版本号2.1.0)将测序数据比对到大豆参考基因组上，获得每个待测样本的MNP标记的DNA序列。
MNP标记的检出率
按照本发明实施例提供的引物组进行多重PCR扩增及测序文库的构建，对这120份待测样本的DNA进行了多重PCR扩增、二代高通量测序与数据分析，平均每个待测样本可检出490.3个MNP标记，平均检出率达96.72％，待测样本的MNP标记检出位点数分布如图1所示。
准确率分析
为了检验引物对的准确率，对其中12个大豆样本进行重现性实验(包括在不同人员、不同批次试剂和不同仪器下所做的两次独立实验)，比较分析每个待测样本的2次实验数据，按准确率＝1-(1-精确度)/2的公式计算分型的准确率。其中，精确度是指两次实验的分型结果一致的MNP标记位点占所有MNP标记位点的比例。统计结果见表2。
表2为12个大豆样本的重现性实验统计结果
由表2可知，总共比较了5896个MNP标记，不重现的位点数有2个，分型准确率为99.98％。标记准确率高则说明由结果不受不同人员、不同批次试剂和不同仪器影响，这为DNA指纹数据的共享提供技术保障。
MNP标记品种的区分度：将上述120份待测样本所有检出的MNP标记基因型，进行两两比较，根据不同品种中，同一MNP标记位点的等位基因型上的差异至少1个SNP被判为有差异的原则，统计这120个待测样本两两比较的差异MNP标记数目，共得到7140对比较结果，平均每对待测样本的差异为214个标记位点，平均差异比例达44.92％，差异比例分布如图2所示。由图2可知，所筛选的MNP标记多态性高，能显著区分任一大豆品种。
实施例二大豆品种鉴定
将DNA指纹数据与对照样本进行比较，获得遗传相似系数；根据遗传相似系数，鉴定待测样本的品种。根据遗传相似系数，鉴定待测样本的品种具体包括：当遗传相似系数大于或等于96％时，则判定待测样本与对照样本为疑同品种。
对收集的大豆品种DD231204013重新提取DNA，命名为DD231206001，按照实施例一提供的实验流程进行检测，然后与实施例一提供的120份待测样本中的10份待测样本的DNA指纹数据进行比较，获得遗传相似系数，结果见表3。将遗传相似系数值作为品种鉴定时结论判定的依据，当GS大于或等于96％时，判定待测样品与对照样品为“疑同品种”。
表3为大豆品种鉴定结论
由表3可知，大豆品种DD231206001与大豆品种DD231204013的差异位点数目为1，GS值达到99.80％，判定为“疑同品种”；而与其它大豆样品间差异位点数显著(大于等于89个位点)，GS值小于或等于81.80％，判定为不同品种；结果说明通过本发明提供的引物组和鉴定方法可将采集的待测样品的DNA指纹与已有数据进行比较分析，准确鉴别大豆品种。
按照本实施例提供的引物组和鉴定方法，可对其它大豆品种进行多重PCR扩增和测序以获得DNA指纹数据，然后与同批次的测序数据或已有的测序数据进行比较，分析品种间标记差异比例，获得品种鉴定结论。
以上所述仅为本公开的可选实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种用于鉴定大豆品种的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第1引物对至第507引物对，每个所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第1引物对的正向引物、所述第1引物对的反向引物至所述第507引物对的正向引物和第507引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：1014所示。
2.一种用于鉴定大豆品种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。
3.一种鉴定大豆品种的方法，其特征在于，所述方法包括：将如根据权利要求1所述的引物组用于鉴定大豆品种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用所述引物组对待测样本的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
纯化多重PCR扩增产物；
利用纯化后的多重PCR扩增产物构建高通量测序文库，获得待测样本的高通量文库；
纯化待测样本的高通量文库；
对待测样本的高通量文库进行测序，得到测序数据；
分析测序数据，获得DNA指纹数据；
将DNA指纹数据与对照样本进行比较，获得遗传相似系数；
根据遗传相似系数，获得所述待测样本与所述对照品种间的品种鉴定结论。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，根据遗传相似系数，获得所述待测样本与所述对照品种间的品种鉴定结论包括：当所述遗传相似系数大于或等于96％时，判定所述待测样本与对照样本为疑同品种。
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