CN108486275A - 一种ssr指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建秋海棠SSR指纹图谱来鉴别秋海棠品种的方法，首先抽提秋海棠品种的DNA，PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测初步筛选SSR标记，然后使用6对核心序列SSR荧光标记引物进行PCR扩增，产物经荧光毛细管电泳检测构建秋海棠品种的SSR指纹通图谱。本发明可以在实验室根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增、凝胶电泳和毛细管电泳技术鉴定秋海棠品种，在时间上充分提高了试验效率，具有操作方便、快速、检测准确、低成本等优势，并且鉴定结果不受环境、取样时间等影响，从DNA水平为评价秋海棠种质资源和解决其品种产权纠纷提供科学、有效的参考依据。

Description

一种SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法及其应用
技术领域
本发明属于植物品种分子鉴定技术领域，涉及一种秋海棠SSR指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术
秋海棠(Begonia grandis)为秋海棠科秋海棠属的观赏植物，可观叶、观花，在我国已有多年盆花栽培史。近年来，随着秋海棠的需求量日益增加，种植面积逐年扩大。但是由于秋海棠品种众多和区域间引种利用，地方品种遗传相似性高，传统的形态学和细胞学的鉴定结果易受环境因素的影响，导致判定结果不一致的问题，同时田间测定周期长，不能及时、快捷地为新品种侵权、盗窃等案件提供鉴定依据。
DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定品种间的差异或遗传相似性。而微卫星(又称简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。
随着国际上对植物新品种保护制度不断的完善，越来越多的育种者对新品种权保护的意识增强，积极申请新品种保护。为了有效地保护我国秋海棠的品种知识产权和育种者的权利，急需开发有效的技术措施对秋海棠品种进行精确鉴定，从DNA水平上给予秋海棠品种独特的指纹身份。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的高效、准确、低成本的利用SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法，并提供该方法的应用。本发明利用SSR指纹图谱技术对秋海棠品种进行鉴定，从而达到保护秋海棠品种的目的。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法，首先抽提秋海棠品种的DNA，PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测初步筛选SSR标记，然后使用6对核心序列SSR荧光标记引物进行PCR扩增，产物经荧光毛细管电泳检测构建秋海棠品种的SSR指纹通图谱。
根据所述的一种SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法，该方法包括下述步骤：
(1)提取待鉴别样品的DNA：
采用天根试剂盒从秋海棠叶片中提取待鉴定样品秋海棠基因组DNA，从0.1g秋海棠幼嫩叶片中提取基因组DNA，最后将DNA稀释至50ng/ul，置于-20度冰箱中保存备用；
(2)SSR标记的初步筛选：
选取50个秋海棠SSR标记引物序列，利用待鉴定秋海棠品种对这些引物进行筛选，PCR反应总体积12.5ul，包括6.75ul的2x EasyTaq PAGE Buffer、4.75μL ddH2O、10pmol正向和反向引物各0.5μL，0.5μl的DNA；
PCR反应程序使用touchdown程序，退火温度在60-55度，每个循环退火温度下降0.5度，95度预变性5min；94度变性30s，60度退火30s，72度延伸30s，每个循环退火温度降0.5度，共10个循环；94度变性30s，55度退火30s，72度延伸30s，共30个循环；最后72度延伸5min，PCR扩增反应结束后，在扩增产物中加入3μL的上样缓冲液，取5μL在12％非变性聚丙烯胺凝胶中恒压电泳分离，硝酸银染色显影检测，扩增频率高、条带单一的SSR位点为筛选位点，获得了6个标记，这6个标记为BI7165、BI4804、BI3301、BI4279、BI2961和BC332；
(3)全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果筛选出核心引物：
利用荧光标记的核心SSR引物进行PCR扩增，20μL的PCR体系包括1μL的浓度约50ng/μL的DNA模板、2μL的10x Buffer、10pmol的正向、反向引物各0.4μL、1.6μL的25mMMgCl2、1.6μL的2.5mM dNTP、0.15μL的5unit/μL Taq DNA聚合酶和12.85μL的ddH2O，正向引物为FAM、HEX或TAMRA荧光标记的引物；
PCR扩增片段在ABI3730XL仪器上进行分析，采用500LIZ分子量内标检测片段大小。将1ul PCR产物加入到DNA分析仪专用深孔板空中，板中各孔分别加入0.1uL的500LIZ分子量内标和9.9uL去离子甲酰胺，将样品在PCR仪上95度变性5min取出，立即置于冰上，冷却10min，短暂离心后放到DNA分析仪上，GENEMARKER v4.0软件收集SSR等位基因大小；
(4)鉴别待测的秋海棠品种，根据6个SSR位点扩增序列，依据BI7165位点区分10个品种，加入BI4804位点完全区分不同的秋海棠品种。
本发明同时还提供了所述的SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法在鉴定秋海棠品种中的应用：根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增、凝胶电泳和毛细管电泳技术鉴定秋海棠品种。
根据所述的应用，所述的鉴定秋海棠的应用包括下述步骤：
(1)提取待鉴别样品的DNA：
采用天根试剂盒从秋海棠叶片中提取待鉴定样品秋海棠基因组DNA，从0.1g秋海棠幼嫩叶片中提取基因组DNA，最后将DNA稀释至50ng/ul，置于-20度冰箱中保存备用；
(2)SSR标记的初步筛选：
选取50个秋海棠SSR标记引物序列，利用待鉴定秋海棠品种对这些引物进行筛选，PCR反应总体积12.5ul，包括6.75ul的2x EasyTaq PAGE Buffer、4.75μL ddH2O、10pmol正向和反向引物各0.5μL，0.5μl的DNA；
PCR反应程序使用touchdown程序，退火温度在60-55度，每个循环退火温度下降0.5度，95度预变性5min；94度变性30s，60度退火30s，72度延伸30s，每个循环退火温度降0.5度，共10个循环；94度变性30s，55度退火30s，72度延伸30s，共30个循环；最后72度延伸5min，PCR扩增反应结束后，在扩增产物中加入3μL的上样缓冲液，取5μL在12％非变性聚丙烯胺凝胶中恒压电泳分离，硝酸银染色显影检测，扩增频率高、条带单一的SSR位点为筛选位点，获得了6个标记，这6个标记为BI7165、BI4804、BI3301、BI4279、BI2961和BC332；
(3)全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果筛选出核心引物：
利用荧光标记的核心SSR引物进行PCR扩增，20μL的PCR体系包括1μL的浓度约50ng/μL的DNA模板、2μL的10x Buffer、10pmol的正向、反向引物各0.4μL、1.6μL的25mMMgCl2、1.6μL的2.5mM dNTP、0.15μL的5unit/μL Taq DNA聚合酶和12.85μL的ddH2O，正向引物为FAM、HEX或TAMRA荧光标记的引物；
PCR扩增片段在ABI3730XL仪器上进行分析，采用500LIZ分子量内标检测片段大小。将1ul PCR产物加入到DNA分析仪专用深孔板空中，板中各孔分别加入0.1uL的500LIZ分子量内标和9.9uL去离子甲酰胺，将样品在PCR仪上95度变性5min取出，立即置于冰上，冷却10min，短暂离心后放到DNA分析仪上，GENEMARKER v4.0软件收集SSR等位基因大小；
(4)鉴别待测的秋海棠品种，根据6个SSR位点扩增序列，依据BI7165位点区分10个品种，加入BI4804位点完全区分不同的秋海棠品种。
与现有技术相比，本发明的优益性在于：
本发明以18份秋海棠品种基因组DNA为模板，根据秋海棠SSR位点，合成SSR引物。经过筛选，分别有6对SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别18份秋海棠品种的差异。本发明可以在实验室根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增、凝胶电泳和毛细管电泳技术鉴定秋海棠品种，在时间上充分提高了试验效率，具有操作方便、快速、检测准确、低成本等优势，能对秋海棠品种进行精确鉴定，从DNA水平上给予秋海棠品种独特的指纹身份。并且鉴定结果不受环境、取样时间等影响，从DNA水平为评价秋海棠种质资源和解决其品种产权纠纷提供科学、有效的参考依据。
具体实施方式
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1
(1)提取待鉴别样品的DNA：
秋海棠总DNA提取是采用天根试剂盒从秋海棠叶片中提取基因组DNA。从0.1g秋海棠幼嫩叶片中提取基因组DNA，最后将DNA稀释至50ng/ul，置于-20度冰箱中保存备用。秋海棠品种如表1。
(2)SSR标记的初步筛选：
根据文献中报道的秋海棠SSR标记引物序列，选取50个SSR标记引物序列，利用这18个品种对这些引物进行筛选，PCR反应总体积12.5ul，包括6.75ul的2x EasyTaq PAGEBuffer(北京全式金)、4.75μL ddH2O、10pmol正向和反向引物各0.5μL，0.5μl的DNA。
PCR反应程序使用touchdown程序，退火温度在60-55度。每个循环退火温度下降0.5度。95度预变性5min；94度变性30s，60度退火30s，72度延伸30s，每个循环退火温度降0.5度，共10个循环；94度变性30s，55度退火30s，72度延伸30s，共30个循环；最后72度延伸5min。PCR扩增反应结束后，在扩增产物中加入3μL的上样缓冲液，取5μL在12％非变性聚丙烯胺凝胶中恒压电泳分离，硝酸银染色显影检测。扩增频率高、条带单一的SSR位点为筛选位点，获得了6个标记。这6个标记为BI7165、BI4804、BI3301、BI4279、BI2961和BC332(表2)。
(3)全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果筛选出核心引物。
利用荧光标记的核心SSR引物进行PCR扩增，20μL的PCR体系包括1μL的浓度约50ng/μL的DNA模板、2μL的10x Buffer、10pmol的正向、反向引物各0.4μL、1.6μL的25mMMgCl2、1.6μL的2.5mM dNTP、0.15μL的5unit/μL Taq DNA聚合酶和12.85μL的ddH2O。正向引物为FAM、HEX或TAMRA荧光标记的引物。
PCR扩增片段在ABI3730XL仪器上进行分析，采用500LIZ分子量内标检测片段大小。将1ul PCR产物加入到DNA分析仪专用深孔板空中，板中各孔分别加入0.1uL的500LIZ分子量内标和9.9uL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95度变性5min取出，立即置于冰上，冷却10min。短暂离心后放到DNA分析仪上。GENEMARKER v4.0软件收集SSR等位基因大小，结果如表3。
(4)鉴别18个秋海棠品种。根据6个SSR位点扩增序列，依据BI7165位点可以区分10个品种，加入BI4804位点可以完全区分18个品种。
表1 18个秋海棠品种
样品编号 品种名称 样品编号 品种名称
Beg1 B.‘Baiyunxiu’ Beg10 B.‘Skeezar’
Beg2 B.‘Tiger Kitten’ Beg11 B.‘Sootie’
Beg3 B.‘Lana’ Beg12 B.‘Dritrica’
Beg4 B.‘Sunburst’ Beg13 B.‘Little Brother Montcomery’
Beg5 B.‘Oeympica’ Beg14 B.‘Lospe-tu’
Beg6 B.‘Helen Lewis’ Beg15 B.‘Orange Rubrua’
Beg7 B.‘Paringa’ Beg16 B.‘Febulous Tom’
Beg8 B.‘Kifujin’ Beg17 B.‘Blush’
Beg9 B.‘Silver Jewell’ Beg18 B.‘Curly Sue’
表2 6个SSR位点及其引物信息
表3 6个SSR位点PCR扩增产物

Claims (4)

1.一种SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法，首先抽提秋海棠品种的DNA，PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测初步筛选SSR标记，然后使用6对核心序列SSR荧光标记引物进行PCR扩增，产物经荧光毛细管电泳检测构建秋海棠品种的SSR指纹通图谱。
2.根据权利要求1所述的一种SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
(1)提取待鉴别样品秋海棠的DNA：
采用天根试剂盒从秋海棠叶片中提取待鉴定样品秋海棠基因组DNA，从0.1g秋海棠幼嫩叶片中提取基因组DNA，最后将DNA稀释至50ng/ul，置于-20度冰箱中保存备用；
(2)SSR标记的初步筛选：
选取50个秋海棠SSR标记引物序列，利用待鉴定秋海棠品种对这些引物进行筛选，PCR反应总体积12.5ul，包括6.25ul的2x EasyTaq PAGE Buffer、4.75μL ddH2O、10pmol正向和反向引物各0.5μL，0.5μl的DNA；
PCR反应程序使用touchdown程序，退火温度在60-55度，每个循环退火温度下降0.5度，95度预变性5min；94度变性30s，60度退火30s，72度延伸30s，每个循环退火温度降0.5度，共10个循环；94度变性30s，55度退火30s，72度延伸30s，共30个循环；最后72度延伸5min，PCR扩增反应结束后，在扩增产物中加入3μL的上样缓冲液，取5μL在12％非变性聚丙烯胺凝胶中恒压电泳分离，硝酸银染色显影检测，扩增频率高、条带单一的SSR位点为筛选位点，获得了6个标记，这6个标记为BI7165、BI4804、BI3301、BI4279、BI2961和BC332；
(3)全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果筛选出核心引物：
利用荧光标记的核心SSR引物进行PCR扩增，20μL的PCR体系包括1μL的浓度约50ng/μL的DNA模板、2μL的10x Buffer、10pmol的正向、反向引物各0.4μL、1.6μL的25mM MgCl2、1.6μL的2.5mM dNTP、0.15μL的5unit/μL Taq DNA聚合酶和12.85μL的ddH2O，正向引物为FAM、HEX或TAMRA荧光标记的引物；
PCR扩增片段在ABI3730XL仪器上进行分析，采用500LIZ分子量内标检测片段大小。将1ul PCR产物加入到DNA分析仪专用深孔板空中，板中各孔分别加入0.1uL的500LIZ分子量内标和9.9uL去离子甲酰胺，将样品在PCR仪上95度变性5min取出，立即置于冰上，冷却10min，短暂离心后放到DNA分析仪上，GENEMARKER v4.0软件收集SSR等位基因大小；
(4)鉴别待测的秋海棠品种，根据6个SSR位点扩增序列，依据BI7165位点区分10个品种，加入BI4804位点完全区分不同的秋海棠品种。
3.权利要求1所述的SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法在鉴定秋海棠品种中的应用，其特征在于根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增、凝胶电泳和毛细管电泳技术鉴定秋海棠品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的鉴定秋海棠的应用包括下述步骤：
(1)提取待鉴别样品的DNA：
采用天根试剂盒从秋海棠叶片中提取待鉴定样品秋海棠基因组DNA，从0.1g秋海棠幼嫩叶片中提取基因组DNA，最后将DNA稀释至50ng/ul，置于-20度冰箱中保存备用；
(2)SSR标记的初步筛选：
选取50个秋海棠SSR标记引物序列，利用待鉴定秋海棠品种对这些引物进行筛选，PCR反应总体积12.5ul，包括6.75ul的2x EasyTaq PAGE Buffer、4.75μL ddH2O、10pmol正向和反向引物各0.5μL，0.5μl的DNA；
PCR反应程序使用touchdown程序，退火温度在60-55度，每个循环退火温度下降0.5度，95度预变性5min；94度变性30s，60度退火30s，72 度延伸30s，每个循环退火温度降0.5度，共10个循环；94度变性30s，55度退火30s，72度延伸30s，共30个循环；最后72度延伸5min，PCR扩增反应结束后，在扩增产物中加入3μL的上样缓冲液，取5μL在12％非变性聚丙烯胺凝胶中恒压电泳分离，硝酸银染色显影检测，扩增频率高、条带单一的SSR位点为筛选位点，获得了6个标记，这6个标记为BI7165、BI4804、BI3301、BI4279、BI2961和BC332；
(3)全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果筛选出核心引物：
利用荧光标记的核心SSR引物进行PCR扩增，20μL的PCR体系包括1μL的浓度约50ng/μL的DNA模板、2μL的10x Buffer、10pmol的正向、反向引物各0.4μL、1.6μL的25mM MgCl2、1.6μL的2.5mM dNTP、0.15μL的5unit/μL Taq DNA聚合酶和12.85μL的ddH2O，正向引物为FAM、HEX或TAMRA荧光标记的引物；
PCR扩增片段在ABI3730XL仪器上进行分析，采用500LIZ分子量内标检测片段大小。将1ul PCR产物加入到DNA分析仪专用深孔板空中，板中各孔分别加入0.1uL的500LIZ分子量内标和9.9uL去离子甲酰胺，将样品在PCR仪上95度变性5min取出，立即置于冰上，冷却10min，短暂离心后放到DNA分析仪上，GENEMARKER v4.0软件收集SSR等位基因大小；
(4)鉴别待测的秋海棠品种，根据6个SSR位点扩增序列，依据BI7165位点区分10个品种，加入BI4804位点完全区分不同的秋海棠品种。
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