CN112210611A - 用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记、鉴别方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记、鉴别方法及应用，可对梅花鹿北海道亚种的进行精准鉴别。本发明的4个SNP位点S‑1～S‑4在梅花鹿北海道亚种中分别为G、G、A、C；在非梅花鹿北海道亚种中分别为A、A、G、T。本发明还提供了用于鉴别梅花鹿北海道亚种的方法：用引物对1‑4中的任意一对或多对进行PCR扩增、测序，根据SNP标记位点碱基即可鉴别待测样品是否为梅花鹿北海道亚种。本发明的这4个SNP位点，位于4个基因片段上，具有特异性强、稳定性好的特点。鉴定检测准确率100％。本发明为梅花鹿资源的亚种鉴别提供了稳定、可靠的分子检测方法。对梅花鹿的DNA指纹图谱绘制和野生亚种保护管理等方面具有重要理论与应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记、鉴别方法及应用，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
梅花鹿(Cervus nippon)属于哺乳纲(Mammalia)、偶蹄目(Artiodactyla)、鹿科(Cervidae)、鹿属(Cervus)，是东亚季风区标志性动物，从乌苏里江到越南均有分布。由于生态环境的破坏和栖息地不断缩小，野生梅花鹿在我国数量十分稀少，目前是我国的Ⅰ类保护动物，也被列入《世界自然保护联盟》(IUCN)濒危物种红色名录。目前梅花鹿的亚种划分主要根据地理分布和形态特征，存在很大争议，分类混乱，中国梅花鹿有6个种、6个或9个亚种之说，日本梅花鹿有6个或7个亚种之说，世界梅花鹿有13个、14个或15个亚种之说。
目前比较公认的说法是将梅花鹿分为13个亚种，日本现存6个亚种。北海道亚种(Cervus nippon yesoensis)分布于北海道岛，体型大，夏毛黄红色，曾经面临灭绝的危险，由于日本政府采取了保护措施，再加上日本狼的灭绝，数量增加非常快，目前已经达到了70多万头。本州亚种(Cervus nippon centralis)分布于本州岛和对马岛。本州岛是日本群岛中面积最大的岛屿，故本州亚种分布最为广泛。此外，对马岛梅花鹿在亚种分类上存在争议，1970年，有学者把对马岛梅花鹿列为独立的亚种(Cervus nippon pulchellus)，因其具有颧骨明显狭窄、鼻前端有凹陷等更原始的形态特点，但也有学者提出，偶蹄类的形态学差异不能一直作为分类的依据，因为形态特点会因环境不同而异。指名亚种(Cervus nipponnippon)分布于九州岛和四国岛。屋久岛亚种(Cervus nippon yakushimae)分布于屋久岛及其周围小岛。马毛岛亚种(Cervus nippon mageshimae)分布于马毛岛和冲绳岛，体型较小。琉球亚种(Cervus nippon keramae)分布于琉球岛及其周围小岛，与其他亚种存在形态上的差异，关于琉球亚种的起源的分类也存在争议，据史料记载，琉球亚种是琉球王子在1628年至1640年之间从九州岛引入形成。
目前，梅花鹿的亚种划分主要依据形态学差异和地理分布，但也有学者提出，偶蹄类的形态学差异不能一直作为分类的依据，因为形态特点会因环境不同而异。所以，当前梅花鹿亚种间存在着遗传资源分类混乱的难题。分子鉴别方法是目前研究的热点，SNP标记具有准确性高、变异丰富、操作简单等优点，且分子标记不受环境因素影响，能直接反应动物基因水平的差异，因而被广泛应用于动物个体鉴别和种源鉴定。但是，尚无可用于鉴别梅花鹿亚种的分子标记及其鉴别方法。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明对梅花鹿分子标记进行了深入研究，得到了可用于鉴别梅花鹿北海道亚种的SNP分子标记及检测引物。本发明还提供了一种鉴别梅花鹿北海道亚种的方法，实现了梅花鹿亚种的精准鉴别，对梅花鹿资源的保护和管理方面具有重要理论和应用价值。
本发明，第一个方面，提供一种用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记，所述分子标记包括4个SNP标记位点：S-1、S-2、S-3、S-4；位点信息如表1所示：
表1本发明用于鉴别梅花鹿北海道亚种的SNP标记位点
| 标记 | 梅花鹿mtDNA基因组 | 位点 | 碱基 |
| S-1 | ND1基因500bp片段 | 第290bp | G/A |
| S-2 | ATP6基因500bp片段 | 第190bp | G/A |
| S-3 | ND4基因500bp片段 | 第52bp | A/G |
| S-4 | ND6基因500bp片段 | 第180bp | C/T |
本发明提供的4个SNP位点S-1～S-4在梅花鹿北海道亚种中分别为G、G、A、C；在非梅花鹿北海道亚种中分别为A、A、G、T。所述非梅花鹿北海道亚种包括梅花鹿东北亚种、四川亚种、华南亚种、台湾亚种、本州亚种、指名亚种、屋久岛亚种。
本发明，另一方面提供用于鉴别梅花鹿北海道亚种的引物，所述引物为下列引物对的一对或多对：序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对1；序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对2；序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对3；序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对4。
所述引物对1用于扩增ND1基因500bp片段；所述引物对2用于扩增ATP6基因500bp片段；所述引物对3用于扩增ND4基因500bp片段；所述引物对4用于扩增ND6基因500bp片段。
本发明还提供用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记或用于鉴别梅花鹿北海道亚种的引物在鉴别梅花鹿北海道亚种中的应用；及在制备试剂盒或在检测方法中的应用，所述试剂盒或检测方法的用途为鉴别梅花鹿北海道亚种。
本发明还提供一种鉴别梅花鹿北海道亚种的方法，所述方法是：提取待测样本DNA，用上述引物对1-4中的任意一对或多对进行PCR扩增；对PCR产物进行测序，根据SNP标记位点碱基即可鉴别待测样品是否为梅花鹿北海道亚种。
若引物对1-4扩增测序结果的序列分别如SEQ ID NO.9(第290bp处碱基为G)、SEQID NO.11(第190bp处碱基为G)、SEQ ID NO.13(第52bp处碱基为A)、SEQ ID NO.15(第180bp处碱基为C)所示，则可判定待测样品为梅花鹿北海道亚种。若测序结果分别如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16所示，即相应位点处碱基分别为A、A、G、T则可判断待测样品为非梅花鹿北海道亚种。
本发明有益效果：
(1)本发明研究得到4个用于鉴别梅花鹿北海道亚种特异性的SNP位点，这4个SNP位点，位于4个基因片段上，具有特异性强、稳定性好的特点。为梅花鹿资源的亚种鉴别提供了稳定、可靠的分子检测方法。对梅花鹿的DNA指纹图谱绘制和野生亚种保护管理等方面具有重要理论与应用价值。
(2)本发明设计了4对可用于鉴别梅花鹿北海道亚种的SNP标记引物，并建立了准确可靠的检测方法。建立了鉴别梅花鹿北海道亚种特异SNP的方法，弥补了本领域目前尚无鉴别梅花鹿亚种的分子标记检测技术的不足，实现对梅花鹿种质资源的精准鉴别。
(3)本发明鉴定方法准确率极高。用本发明方法检测了来自中国和日本的100个梅花鹿样品。结果表明：100个样品中12个样品为北海道亚种，其余样品非北海道亚种。检测准确率100％。
(4)成本低，更实用。由于本发明的SNP位点稳定可靠，在实际鉴定中可仅采用一对引物，因为当其中1个SNP分子鉴定的标记与梅花鹿北海道亚种特异SNP位点的碱基相同时，即可判定为梅花鹿北海道亚种。这样就极大节约了时间，降低了成本。并且，不需要掌握待测梅花鹿的形态特点，采集到其DNA样本即可实现鉴别。
附图说明
图1为本发明的梅花鹿北海道亚种与其他亚种mtDNA序列差异性SNP位点。图中：Cervus nippon hortulorum:东北亚种；Cervus nippon sichuanicus:四川亚种；Cervusnippon kopschi:华南亚种；Cervus nippon taiouanus:台湾亚种；Cervus nipponyesoensis:北海道亚种；Cervus nippon centralis:本州亚种；Cervus nippon nippon:指名亚种；Cervus nippon yakushimae:屋久岛亚种。
图2为实施例2的PCR结果图。图中，M：DNAMaker1000；1-4泳道分别是引物对1-4扩增得到的条带。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不限于此。本发明中所涉及的方法，如无特殊说明均为本领域常用方法，所涉及的试剂，如无特殊说明均可以从商业途径获得。
实施例1、用于鉴别梅花鹿北海道亚种的特异SNP标记的获得
1、梅花鹿北海道亚种特异SNP位点筛选
结合测得梅花鹿东北亚种、四川亚种、华南亚种、台湾亚种、北海道亚种、本州亚种、指名亚种和屋久岛亚种等不同亚种样品的mtDNA序列，利用Mega6.0比对分析，主要针对同一亚种共有且特异于其他亚种的位点进行筛选，筛选差异SNP位点4个，如图1所示。用Mega6.0截取ND1基因片段、ATP6基因片段、ND4基因片段和ND6基因片段，序列长度为500bp左右，用于设计鉴别引物。
2、引物设计
根据截取的目的基因片段，结合Primer5.0与Oligo7.0设计鉴别引物。
用于扩增ND1基因片段的引物对1：
1F：5'CTTAGCCGTGGCATTCCTCA3'(SEQ ID NO.1)；
1R：5'CGGTGAGATCAAATGGGGCT3'(SEQ ID NO.2)。
用于扩增ATP6基因片段的引物对2：
2F：5'GCCAAAGGACAAACATGGACA3'(SEQ ID NO.3)；
2R：5'TGGCTACTGCAAACTCAAGGA3'(SEQ ID NO.4)。
用于扩增ND4基因片段的引物对3：
3F：5'ACTCATACCTCTGACCTGACT3'(SEQ ID NO.5)；
3R：5'GGCGTTCTGTTTGGTTTCCC3'(SEQ ID NO.6)。
用于扩增ND6基因片段的引物对4：
4F：5'TCAACAGACCAGTAACAAATGCC3'(SEQ ID NO.7)；
4R：5'GGGAGGTCAATGAATGCGT3'(SEQ ID NO.8)。
引物设计好后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例2、鉴别梅花鹿北海道亚种的方法的建立
根据上述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示引物对，进行PCR实验，以建立鉴别梅花鹿北海道亚种和其他亚种的方法，PCR扩增条件如表2。
表2 PCR扩增条件
PCR反应体系如表3。
表3 PCR体系
所述PCR扩增的过程为：94℃预变性5min；94℃变性30sec、59℃退火30sec、72℃延伸30sec，共进行30个循环；72℃再延伸5min，4℃保存。
PCR结果如图2，引物对1、引物对2、引物对3和引物对4的PCR结果电泳条带单一明亮，实验结果表明本发明成功建立了有效鉴别梅花鹿北海道亚种和其他亚种的方法。
实施例3.本发明鉴别梅花鹿北海道亚种和其他亚种的方法的具体应用
选取采自中国和日本的样品共100个，分别提取基因组DNA，由实验者A将这些样品随机混合，重新编号，实验者B采用本发明设计的引物对这些样品进行PCR扩增，扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。通过Bioedit7.0查看测序峰图，测序结果图谱波峰波谷分离、无重叠、无误读，表明测序结果可信。用Mega6.0比对序列，以梅花鹿北海道亚种特异SNP位点的碱基作为判定依据。
根据本发明确定的mtDNA特异性SNP分子标记来判定。鉴别结果见表4,结果以是/否分别表示北海道亚种/其他亚种。
表4梅花鹿样品检测结果
结果表示，在100个梅花鹿样品中，C73-C84这12个样品的S-1、S-2、S-3、S-4位点分别为G、G、A、C，C1-C72和C85-C100这88个样品的S-1、S-2、S-3、S-4位点分别为A、A、G、T，经与实验者A核对，C73-C84这12个样品确为北海道亚种，准确率为100％；C1-C72和C85-C100这88个样品为非北海道亚种，准确率为100％。
综上所述，说明用本发明提出的4个SNP位点用于鉴别梅花鹿北海道亚种和其他亚种时准确率高且稳定性好，考虑到成本问题，可以采用引物对1-4的任意一对或两至三对，因为当其中1个SNP分子鉴定的标记与梅花鹿北海道亚种特异SNP位点的碱基相同时，即可判定为梅花鹿北海道亚种。优选地，只用引物对1-4的任意一对。
序列表
<110> 中国农业科学院特产研究所
<120> 用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记、鉴别方法及应用
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ctaacagcca atattactgc aggacaccta ctgattcacc taattggagg agctgcactt 300
gcactaataa gtatcagtac tacaatagct ctcatcacat tcattattct agtcctactc 360
acaatccttg agtttgcagt agccaa 386
<210> 13
<211> 343
<212> DNA
<213> 梅花鹿(Cervus nippon)
<400> 13
cccatagcct gttaattagc ctcacaagcc ttctcctcat aaatcaattc aatgacaaca 60
gcctcaactt ctcgttaata ttcttttccg actccctatc aacaccacta ttaattttaa 120
ccatatgact tcttccctta atattaatag ctagccaaca ccacctatca aaggaaaatc 180
ttacccgaaa aaaactatat attaccatat taattctact tcaactattc ttaatcatga 240
cttttactgc tatagaacta atctttttct atattctatt tgaagcaaca ctagtcccaa 300
cactcattat tattacccga tggggaaacc aaacagaacg cca 343
<210> 14
<211> 343
<212> DNA
<213> 梅花鹿(Cervus nippon)
<400> 14
cccatagcct gttaattagc ctcacaagcc ttctcctcat aaatcaattc agtgacaaca 60
gcctcaactt ctcgttaata ttcttttccg actccctatc aacaccacta ttaattttaa 120
ccatatgact tcttccctta atattaatag ctagccaaca ccacctatca aaggaaaatc 180
ttacccgaaa aaaactatat attaccatat taattctact tcaactattc ttaatcatga 240
cttttactgc tatagaacta atctttttct atattctatt tgaagcaaca ctagtcccaa 300
cactcattat tattacccga tggggaaacc aaacagaacg cca 343
<210> 15
<211> 376
<212> DNA
<213> 梅花鹿(Cervus nippon)
<400> 15
tactgctccg tagctattgc cgttgtataa ccaaaaacca ccatcattcc tcccaaataa 60
attaagaata ccattaaacc cagaaaggac ccaccaaaat ttaacacaat accacaacca 120
actccaccac tcacaattaa tcccaacccc ccataaatag gcgaaggttt cgaagaaaac 180
cctacaaaac caagcacaaa aataatactt aagataaata caatgtatgt tatcattatt 240
ctcacatgga atctaaccat gactaatgat atgaaaaatc atcgttgtca ttcaactaca 300
agaacactaa tgactaatat ccgaaaaacc cacccattaa taaaaattgt aaacaacgca 360
ttctttgaac ctcccc 376
<210> 16
<211> 376
<212> DNA
<213> 梅花鹿(Cervus nippon)
<400> 16
tactgctccg tagctattgc cgttgtataa ccaaaaacca ccatcattcc tcccaaataa 60
attaagaata ccattaaacc cagaaaggac ccaccaaaat ttaacacaat accacaacca 120
actccaccac tcacaattaa tcccaacccc ccataaatag gcgaaggttt cgaagaaaat 180
cctacaaaac caagcacaaa aataatactt aagataaata caatgtatgt tatcattatt 240
ctcacatgga atctaaccat gactaatgat atgaaaaatc atcgttgtca ttcaactaca 300
agaacactaa tgaccaatat ccgaaaaacc cacccattaa taaaaattgt aaacaacgca 360
ttcattgaac ctcccc 376
Claims (10)
1.用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记，其特征是，所述分子标记包括4个SNP标记位点：
。
2.如权利要求1所述的用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记，其特征是，所述4个SNP位点S-1～S-4在梅花鹿北海道亚种中分别为G、G、A、C；在非梅花鹿北海道亚种中分别为A、A、G、T。
3.如权利要求2所述的用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记，其特征是，所述非梅花鹿屋久岛亚种包括梅花鹿东北亚种、四川亚种、华南亚种、台湾亚种、本州亚种、指名亚种、屋久岛亚种。
4.用于鉴别梅花鹿北海道亚种的引物，其特征是，所述引物为下列引物对的一对或多对：序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对1；序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对2；序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对3；序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对4。
5.如权利要求4所述的用于鉴别梅花鹿北海道亚种的引物，其特征是，所述引物对1用于扩增ND1基因500bp片段；所述引物对2用于扩增ATP6基因500bp片段；所述引物对3用于扩增ND4基因500bp片段；所述引物对4用于扩增ND6基因500bp片段。
6.权利要求1所述的用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记或权利要求4所述的用于鉴别梅花鹿北海道亚种的引物在鉴别梅花鹿北海道亚种中的应用。
7.权利要求1所述的用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记或权利要求4所述的用于鉴别梅花鹿北海道亚种的引物在制备试剂盒或在检测方法中的应用，其特征在于，所述试剂盒或检测方法的用途为鉴别梅花鹿北海道亚种。
8.一种鉴别梅花鹿北海道亚种的方法，其特征是，所述方法是：提取待测样本DNA，用权利要求4所述的引物进行PCR扩增；对PCR产物进行测序，根据SNP标记位点碱基即可鉴别待测样品是否为梅花鹿北海道亚种。
9.如权利要求8所述鉴别梅花鹿北海道亚种的方法，其特征是，所述引物为引物对1-4对中的任意一对或多对。
10.一种鉴别梅花鹿北海道亚种的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括权利要求4所述的引物中的一对或多对引物。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116083602A (zh) * | 2023-01-10 | 2023-05-09 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 |
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| CN111378767A (zh) * | 2020-05-16 | 2020-07-07 | 中国农业科学院特产研究所 | 用于鉴别中国马鹿和赤鹿的snp标记及检测引物对、试剂盒和应用 |
-
2020
- 2020-11-02 CN CN202011205075.5A patent/CN112210611B/zh active Active
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| CN116083602B (zh) * | 2023-01-10 | 2023-10-24 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 |
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