CN107523637A - 基于coi与sry序列建立鉴别梅花鹿、马鹿或其杂交鹿的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于COI与SRY序列建立鉴别梅花鹿、马鹿或其杂交鹿的方法。本发明提供了提供了检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸的物质在制备检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿产品中的应用本发明利用Y染色体的SRY基因作为父本的鉴别标记，结合母本标记基因COI，分别基于COI与SRY基因序列建立了2个多重PCR体系，用于鉴别鹿茸样品的父母本来源，初步建立了杂交鹿茸的鉴定方法，能有效进行杂交鹿的父母本鉴定。本发明的方法对杂交鹿茸鉴别具有实际应用价值，也为后续进行杂交鹿茸的品质评价时提供有效的鉴别方法。

Description

基于COI与SRY序列建立鉴别梅花鹿、马鹿或其杂交鹿的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于COI与SRY序列建立鉴别梅花鹿、马鹿或其杂交鹿的方法。

背景技术

鹿茸是我国传统名药之一,始载于《神农本草经》,鹿茸具有促进生长发育、强壮身体、抗炎、免疫调节、抗衰老、促进创伤愈合等功能。《中国药典》规定鹿茸基原为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿C.elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，作为名贵中药材品种，鹿茸在市场上供不应求且价格昂贵。

杂交有利于提高畜牧产量，我国的茸鹿种间和亚种间的杂种优势利用一直处于国际领先水平，早在1958年吉林省吉林市龙潭山鹿场即用本交的方法开展家养马鹿(♀)与梅花鹿(♂)杂交(简称马·花杂交)试验研究，随后茸鹿的杂交育种技术得到推广与应用。其中，马·花杂交被认为经济性状最佳杂交组合之一。导致中药市场中除了出现驯鹿、白唇鹿、水鹿等常见动物的茸片等混伪品，还常出现马·花杂交鹿茸或花·马杂交鹿茸。而这些鹿茸品质特征并不一致，如赵磊等对梅花鹿茸、马鹿茸、花马杂交鹿茸等5种鹿茸的常规成分、无机元素和氨基酸含量进行了测定，结果表明梅花鹿茸与花马杂交鹿茸无机元素等营养成分存在差异。另一方面，也缺乏准确可靠的杂交鹿茸鉴别方法，依据外部形态、显微特征、理化性状的传统鉴定方法对马鹿与梅花鹿的杂交鹿茸鉴定存在很大困难。因此，对鹿茸药材进行正本清源,特别是对杂交鹿茸的鉴别，对保障药材质量具有重要的意义。

目前，对杂交鹿茸药性药效是否与亲本一致仍无完善评价方法，且缺乏准确区分杂交与非杂交品的方法。目前市场流通的鹿茸样品随机选样进行鉴别分析，在24个马鹿鹿茸的待测样品就发现有3个是马·花杂交鹿茸，可见市场流通的杂交鹿茸比例较高。据报道，马·花杂交F1生长速度显著高于花·马杂交F1，呈母本显性遗传，成年时体重和体型与母本鹿(马鹿)的相近，且茸生长快,其生长天数短,而茸质嫩，再生茸大、嫩又成型。而其茸型和肉质又多能呈父本显性遗传,不仅是最佳的茸肉兼用型鹿，还是茸血兼用鹿，具有较高的经济效益，这可能是市场流通中的具有较高比例的马·花杂交鹿茸的原因。而马·花杂交鹿茸的药用价值还有待进一步研究分析。

分子标记方法具有灵敏性高、准确性好、客观性较强等优势,目前在鹿茸等贵重药材及其原动物的分子鉴定方面有不少文献报道，比如基于COI或Cyt b片段的鹿茸类药材分子鉴定的相关文献报道。而以COI基因是线粒体DNA,属于细胞质遗传，这种以线粒体序列建立的鹿茸分子鉴别方法，只能作为鉴别其母本的证据，无法对杂交鹿进行直接鉴别。

目前，SRY基因在分子进化领域得到了广泛应用，如蔡欣等利用SRY基因多态性对牦牛与其他家牛属动物及其父系进化关系分析；周盼伊等利用SRY基因进行家养梅花鹿品种Y染色体遗传多样性和父系遗传结构分析；苏莹等利用Y染色体SRY基因对马鹿的遗传多样性进行研究，以上研究均表明SRY基因多态性可进行哺乳动物父本的溯源分析。

发明内容

本发明一个目的是提供检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸的物质的用途。

本发明提供了检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸的物质在制备检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿产品中的应用：

所述COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸如下：

所述COI基因的核苷酸为序列3，且目标位点为第391位，该位点的目标核苷酸为C；

所述COI基因的位点为核苷酸序列1，且目标位点为第106位，该位点的目标核苷酸为C；

所述SRY基因的位点为核苷酸序列4，且目标位点为第69位，该位点的目标核苷酸为C；

所述SRY基因的位点为核苷酸序列2，且目标位点为第446位，该位点的目标核苷酸为G。

上述应用中，所述物质为如下1)-3)中任一种：

1)检测COI基因位点的引物组和检测SRY基因位点的引物组；

所述检测COI基因位点的引物组由序列5所示的引物、序列6所示的引物和序列7所示的引物组成；

所述检测SRY基因位点的引物组由序列8所示的引物、序列9所示的引物和序列10所示的引物组成；

2)含有所述检测COI基因位点的引物组的PCR试剂和含有所述检测SRY基因位点的引物组的PCR试剂；

3)含有1)或2)的试剂盒。

本发明另一个目的是提供用于检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的产品。

本发明提供的产品，为检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸的物质。

上述产品中，所述检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸的物质为如下1)-3)中任一种：

1)用于检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的成套引物，包括所述检测COI基因位点的引物组和所述检测SRY基因位点的引物组。；

2)用于检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的试剂，包括含有所述检测COI基因位点的引物组的PCR试剂和含有所述检测SRY基因位点的引物组的PCR试剂；

3)含有1)或2)的试剂盒。

上述产品中，所述成套引物还包括用于扩增COI基因的特异引物组和用于扩增SRY基因的特异引物组；

所述用于扩增COI基因的特异引物组由序列13所示的引物和序列14所示的引物组成；

所述用于扩增SRY基因的特异引物组由序列11所示的引物和序列12所示的引物组成。

上述产品中，每个所述引物组中的各条引物均为等摩尔混合。

上述产品中，所述含有检测COI基因位点的引物组的PCR试剂包括所述检测COI基因位点的引物组DNA聚合酶和反应缓冲液；

所述含有检测SRY基因位点的引物组的PCR试剂包括所述检测COI基因位点的引物组DNA聚合酶和反应缓冲液。

所述引物组中各条引物在其对于的PCR试剂中的浓度为2μmoL/L；

所述试剂还包括含有用于扩增COI基因的特异引物和用于扩增SRY基因的特异引物的PCR试剂。

本发明第3个目的是提供一种检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用上述成套引物中的所述用于扩增COI基因的特异引物和用于扩增SRY基因的特异引物分别扩增待测样本，得到COI基因的特异片段和SRY基因的特异片段；

2)用上述成套引物中的所述检测COI基因位点的引物组和所述检测SRY基因位点的引物组分别对所述COI基因的特异片段和SRY基因的特异片段进行多重PCR扩增，得到扩增COI的多重PCR体系的扩增产物和扩增SRY的多重PCR体系的扩增产物；

检测扩增COI的多重PCR体系的扩增产物和扩增SRY的多重PCR体系的扩增产物：

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到222-242bp的扩增产物，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到793-813bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于梅花鹿；

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到508-528bp的扩增产物，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到415-435bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于马鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于马鹿；

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到222-242bp的特异片段，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到415-435b bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为梅花鹿，父本为马鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于母本为梅花鹿父本为马鹿的杂交鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到508-528bp的扩增产物，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到793-813bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为马鹿，父本为梅花鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于母本为马父本为梅花鹿的杂交鹿。

上述方法中，

所述检测扩增COI的多重PCR体系的扩增产物和扩增SRY的多重PCR体系的扩增产物：

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到232bp的扩增产物，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于梅花鹿；

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的扩增产物，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到425bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于马鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于马鹿；

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到232bp的特异片段，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到425bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为梅花鹿，父本为马鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于母本为梅花鹿父本为马鹿的杂交鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的扩增产物，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为马鹿，父本为梅花鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于母本为马父本为梅花鹿的杂交鹿。

本发明第4个目的是提供一种检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中是否含有目标位点及该位点的目标核苷酸：

所述COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸如下：

所述COI基因的核苷酸为序列3，且目标位点为第391位，该位点的目标核苷酸为C；

所述COI基因的位点为核苷酸序列1，且目标位点为第106位，该位点的目标核苷酸为C；

所述SRY基因的位点为核苷酸序列4，且目标位点为第69位，该位点的目标核苷酸为C；

所述SRY基因的位点为核苷酸序列2，且目标位点为第446位，该位点的目标核苷酸为G；

若所述待测样本基因组中的COI基因的核苷酸序列为序列3且第391位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列4且第69位的核苷酸为C，则该待测样本为梅花鹿；反之，则该待测样本不为梅花鹿；

若所述待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列1且第106位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列2且第446位的核苷酸为G，则该待测样本为马鹿；反之，则该待测样本不为马鹿；

若所述待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列3且第391位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列2且第446位的核苷酸为G，则该待测样本为杂交鹿，且母本为梅花鹿，父本为马鹿；反之，则该待测样本不为母本为梅花鹿父本为马鹿的杂交鹿；

若所述待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列1且第106位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列4且第69位的核苷酸为C，则该待测样本为杂交鹿，且母本为马鹿，父本为梅花鹿；反之，则该待测样本不为母本为马鹿父本为梅花鹿的杂交鹿。

上述待测样本为鹿茸或鹿角。

上述检测待测样本基因组中的COI基因的核苷酸序列为序列3且第391位的核苷酸为C对应的扩增引物对为CCnF和CCR；

上述检测待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列1且第106位的核苷酸为C对应的扩增引物对为CCeF和CCR；

上述检测待测样本基因组中的SRY基因核苷酸序列为序列4且第69位的核苷酸为C对应的扩增引物对为SCnF和SCR；

上述检测待测样本基因组中的SRY基因核苷酸序列为序列2且第446位的核苷酸为G对应的扩增引物对为SCeF和SCR。

本发明的实验证明，本发明利用Y染色体的SRY基因作为父本的鉴别标记，结合母本标记基因COI，分别基于COI与SRY基因序列建立了2个多重PCR体系，用于鉴别鹿茸样品的父母本来源，初步建立了杂交鹿茸的鉴定方法，能有效进行杂交鹿的父母本鉴定。本发明的方法对杂交鹿茸鉴别具有实际应用价值，也为后续进行杂交鹿茸的品质评价时提供有效的鉴别方法。

附图说明

图1为梅花鹿与马鹿鉴别引物设计示意图。

图2为特异性PCR鉴别梅花鹿、马鹿及其杂交鹿样品凝胶电泳。

图3为特异性PCR鉴别梅花鹿、马鹿及其杂交鹿样品凝胶电泳。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的仪器如下：微量分光光度计(Nanodrop 2000,ThermoScientific公司)；PCR仪:Veriti PCR仪(Applied Biosystems)，5810R型低温冷冻离心(Eppendorf公司)，ND-100型核酸蛋白分析仪(Gene公司)，DDZ-11型电池式电动骨钻(上海医疗器械集团)。

下述实施例中所用的材料如下：TIANDZ柱式骨骼DNAout购自北京天恩泽公司；DL2000plus DNA Marker购自Takara公司；多重PCR 5×Master Mix购自NEB公司，FastTaqDNA聚合酶购自TransGen公司。三氯甲烷购自北京化工厂，均为国产分析纯。鹿茸药材包括马鹿、梅花鹿及其混伪品，共计48个样品，分别购自湖南、重庆、昆明、成都、玉林、亳州、新疆，样品由经鉴定，药材标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。

表1 材料信息

实施例1、用于鉴别梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的SNP位点及用于扩增其的引物

SRY基因作为哺乳动物的性别决定基因，在不同物种间SRY基因的位置、大小、结构等均不相同。因此，利用COI和SRY基因建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的分子鉴别成为一个新的研究方向。

一、用于鉴别梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的SNP位点的发现及应用

根据测序所获得的受试样品的COI与SRY基因序列，并从NCBI数据库中下载梅花鹿、马鹿、驯鹿、水鹿等物种的COI与SRY基因序列，利用ClustulX 2.1软件进行同源对齐，校对后分析其特异性SNP位点，并从特异性SNP位点中筛选合适的鉴别位点。

经过比对，COI基因(序列3)第391位为C或T，COI基因(序列1)第106位为C或T，SRY基因(序列4)第69位为C或T，SRY基因(序列2)第446位为G或T。

选择COI基因(序列1)第106位为C，且SRY基因(序列2)第446位为G，为马鹿特异性SNP位点；

选择COI基因(序列3)第391位为C，且SRY基因第69位为C(序列4)，为梅花鹿特异性SNP位点。

用上述SNP位点鉴别待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿，具体如下：

若所述待测样本基因组中的COI基因的核苷酸序列为序列3且第391位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列4且第69位的核苷酸为C，则该待测样本为梅花鹿；反之，则该待测样本不为梅花鹿；

若所述待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列1且第106位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列2且第446位的核苷酸为G，则该待测样本为马鹿；反之，则该待测样本不为马鹿；

若所述待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列3且第391位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列2且第446位的核苷酸为G，则该待测样本为杂交鹿，且母本为梅花鹿，父本为马鹿；反之，则该待测样本不为母本为梅花鹿父本为马鹿的杂交鹿；

若所述待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列1且第106位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列4且第69位的核苷酸为C，则该待测样本为杂交鹿，且母本为马鹿，父本为梅花鹿；反之，则该待测样本不为母本为马鹿父本为梅花鹿的杂交鹿。

二、用于鉴别梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸样本的引物的设计合成

根据上述SNP位点设计相应的引物，并且对引物进行优化，具体如下：

以梅花鹿COI序列JF700150.1为参照，选择COI序列序列3第391位的梅花鹿特异性SNP位点C作为鉴别位点，为提高鉴别能力，把第389位点的碱基由A替换为T，设计特异识别梅花鹿的引物CCnF；而以COI基因序列1第106位的马鹿特异性SNP位点C作为鉴别位点，并把第104位点的碱基由G替换为C，设计特异识别马鹿的引物CCeF；并设计共同的反向引物CCR，则可通过PCR扩增获得232bp的梅花鹿特异片段，PCR扩增获得518bp的马鹿特异片段。

以梅花鹿SRY序列AB915321.1为参照，选择SRY序列4第69位的梅花鹿特异性SNP位点C作为鉴别位点，而把第67位点的碱基由T替换为A，设计特异识别梅花鹿的引物SCnF；而以序列2第446位的马鹿特异性SNP位点G作为鉴别位点，而把第444位点的碱基由T替换为A，设计特异识别马鹿的引物SCeF；并设计共同的反向引物SCR。则可通过PCR扩增获得803bp的梅花鹿特异片段，而PCR扩增获得425bp的马鹿特异片段。(图1和表2)。

表2 所用引物

三、用于鉴定梅花鹿或马鹿的试剂盒的组装

将步骤二设计合成的引物CCeF、CCnF、CCR、SCnF、SCeF和SCR分别单独包装后，与分别单独包装的Taq DNA聚合酶，PCR扩增缓冲液等包装于同一个试剂盒内，即得到本发明用于鉴定梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的试剂盒。

实施例2、梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸样本的分子鉴别方法的建立

1、待检测片段的获得

1)基因组DNA的提取和纯化

取鹿茸药材样品，经过75％乙醇表面消毒后，利用骨钻钻取20mg样品粉末,饮片则直接粉碎，采用TIANDZ柱式骨骼DNAout提取鹿茸总DNA，作为模板用于鹿茸DNA鉴别研究。

2)通用引物扩增COI基因待检测片段与SRY基因待检测片段

以上述1)得到的总DNA为模板，用通用引物CO-F与CO-R(见表2)扩增COI基因序列，PCR反应程序为：95℃，5min；95℃，30s，45℃，1.5min，72℃，1.5min，5个循环；95℃，1min，50℃，1.5min，72℃，1min，35个循环；72℃，7min。

获得709bp的PCR产物，即为COI基因待检测片段。

以上述1)得到的总DNA为模板，用用通用引物SR-F与SR-R(见表2)扩增SRY基因序列，PCR反应程序为：95℃预变性23min后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环后72℃延伸7min。

获得1000bp的PCR产物，即为SRY基因待检测片段。

2、多重PCR鉴别受试梅花鹿、马鹿与其杂交鹿样品

分别基于COI与SRY基因序列，利用梅花鹿及马鹿的特异鉴别引物与通用反向引物分别构建如下多重PCR体系：

扩增COI的多重PCR体系总体积20μL，其中包括Taq DNA聚合酶(#M0284S NEB公司)1U，5×Master Mix(NEB公司)4μL，2μmoL/L CCeF、CCnF特异鉴别引物各1μL(终浓度均为100pmol/L)，2μmoL/L CCR(终浓度为200pmol/L)2μL，灭菌蒸馏水补足20μL。

扩增SRY的多重PCR体系总体积20μL，其中包括Taq DNA聚合酶(#M0284S NEB公司)1U，5×Master Mix 4μL，2μmoL/L SCnF、SCeF特异鉴别引物各1μL(终浓度均为100pmol/L)，2μmoL/L SCR(终浓度为200pmol/L)2μL，灭菌蒸馏水补足20μL。

上述PCR程序如下：

PCR反应程序为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环后72℃延伸7min。

受试样本为8个梅花鹿鹿角样品，7个马鹿鹿角样品及5个马·花杂交的鹿角样品。

用扩增COI的多重PCR体系和扩增SRY的多重PCR体系分别对上述受试样本进行多重PCR检测。

结果如图2所示，上图为SRY体系，下图为COI体系；1～8:梅花鹿样品；9～15:马鹿样品；16～20:杂交鹿；20～21:驯鹿；22～24:水鹿；M:Marker，

泳道1-8的所有梅花鹿样本，扩增SRY的多重PCR体系获得803bp的条带，扩增COI的多重PCR体系获得232bp条带；

泳道9～15的所有马鹿样本，扩增SRY的多重PCR体系获得425bp条带，扩增COI的多重PCR体系获得518bp条带；

泳道16-20的所有杂交鹿样本(杂交鹿的母本为梅花鹿，父本为马鹿)，扩增SRY的多重PCR体系获得803bp的条带，扩增COI的多重PCR体系获得518bp条带。

泳道20～21的驯鹿样本和泳道22～24的水鹿样本，则扩增不到任何上述大小条带。

上述结果表明，本发明的引物和方法具有特异性，可以直接鉴别梅花鹿、马鹿与其杂交鹿的鹿茸样品，具体鉴别如下：

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到232bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的特异片段则待测鹿茸样本来源于或候选来源于梅花鹿，反之，则待测鹿茸样本不来源或候选不来源于梅花鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到425bp的特异片段，则待测样本来源于或候选来源于马鹿，反之，则待测鹿茸样本不来源或候选不来源于马鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到232bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到425bp的特异片段，则待测鹿茸样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为梅花鹿，父本为马鹿，反之，则待测鹿茸样本不来源或候选不来源于母本为梅花鹿父本为马鹿的杂交鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的特异片段，则待测鹿茸样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为马鹿，父本为梅花鹿，反之，则待测鹿茸样本不来源或候选不来源于母本为马父本为梅花鹿的杂交鹿。

实施例3、多重PCR鉴别受试梅花鹿、马鹿与其杂交鹿样品

受试样本为重流通市场中收集的8批已知梅花鹿鹿茸样品、16批已知马鹿鹿茸样品和3批马·花杂交的鹿茸样品。

分别用实施例2的方法对受试样本进行多重PCR检测。

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到232bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的特异片段则待测鹿茸样本来源于或候选来源于梅花鹿，反之，则待测鹿茸样本不来源或候选不来源于梅花鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到425bp的特异片段，则待测样本来源于或候选来源于马鹿，反之，则待测鹿茸样本不来源或候选不来源于马鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到232bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到425bp的特异片段，则待测鹿茸样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为梅花鹿，父本为马鹿，反之，则待测鹿茸样本不来源或候选不来源于母本为梅花鹿父本为马鹿的杂交鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的特异片段，则待测鹿茸样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为马鹿，父本为梅花鹿，反之，则待测鹿茸样本不来源或候选不来源于母本为马父本为梅花鹿的杂交鹿。

结果如图3所示，上图为SRY体系，下图为COI体系；

受试8批梅花鹿鹿茸样品扩增COI的多重PCR体系扩增得到232bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的特异片段；表明其父母本均为梅花鹿。

13批马鹿鹿茸样品中13个样品扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到425bp的特异片段，表明其父母本为梅花鹿；

3批待测杂交样品扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的特异片段，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的特异片段，表明其父本为梅花鹿，木本为马鹿，该样本为马·花杂交的鹿茸样品(见星号标注)。

序列表

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120>基于COI与SRY序列建立鉴别梅花鹿、马鹿或其杂交鹿的方法

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 688

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

tactctgtat ctactatttg gtgcctgagc aggcatagta ggaacagcct taagcctact 60

gattcgtgcc gaactgggcc aacctggtac tctgcttgga gacgaccaaa tttataatgt 120

tatcgtaacc gcacatgcat tcgtaataat tttctttata gttataccaa ttataattgg 180

aggatttggt aattgactag ttcccctaat aattggtgcc ccagacatag cattccctcg 240

aataaacaat ataagctttt gactcctccc tccttctttc ttactacttt tagcatcatc 300

tatagttgaa gctggcgcag gaacaggctg aactgtatac ccccctctag ctggcaactt 360

agctcacgca ggggcttcag tagatctgac tattttttct ttacacttgg caggtgtctc 420

ctcaattcta ggggccatta actttattac aacaattatt aatataaaac cccctgccat 480

atcacaatat caaacccctc tatttgtgtg atccgtatta gtcactgctg tactactact 540

tctctcactc cctgtactag cagctggaat tacaatacta ttaacagacc gaaacttaaa 600

tacaaccttt tttgacccag caggaggcgg agatcccatt ctatatcaac acttgttctg 660

attttttggt cccgggaaaa agttaaaa 688

<210> 2

<211> 926

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

actaatttgg ttcttgtctc tgcatttgcc ccttctgggg actccatgtg aatgtaatct 60

ttcagtatgt ggcctcttgt gtatcttttt ttaacacagg atgatgtttt caaggttcct 120

ccaccttgct gaatgtatta ctttttgtct tttaatttca gctttgaaaa gatatatatt 180

tttctcatta ttaaataatt tctaggttta ttaaatctgc ttttgtatat gagtgccatt 240

taaacattta cttccacagt aagatgcatg tcttaaattg catcaagtaa taatattttc 300

acattttatt tggatcttta acacttaact ttaatggcta ggatgcagtt tacaggattg 360

acacatttga ctgaataaag ttaacctttg aagtttctac tatcattgca tcataaggca 420

ttgcttaaat catgttttat ttttaggcag atcattttta tgaagcacaa gcattattta 480

aattatattt tcttaggaat tttggcatca cttttatgaa atcttggtga gacttatttt 540

tcatatgtta tgtccagtac aatatacagt tgttactcct atttttcaga tatggtttta 600

aaacttgtat aggggaagtc tcctcatatt ttattacatc aaaatactct atgaaaactt 660

ccaagtttgc cttatggatt tatttggaag agggcttcac ttatttcatt ttgtaaaccc 720

ttacttttca attttcccca gagtatgaaa tacaatataa aacaattgat ggctgcaatt 780

tagaaacttg gatttataaa gctttgttct tttagttttg tttagttttt gatcatctgt 840

tatttaaaag tgcagacgag agtgatggat attacatttg cacagcctac gcacctaagg 900

catcactcac ccccagcctt ccactt 926

<210> 3

<211> 658

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tactctgtat ctactatttg gtgcctgagc aggcatagta ggaacagcct taagcctact 60

gattcgtgcc gaactgggcc aacctggtac tctgcttgga gatgatcaaa tttataatgt 120

tatcgtaacc gcacatgcat tcgtaataat tttctttata gttataccaa ttataatcgg 180

aggatttggt aattgactag ttcccctaat aattggtgcc ccagacatag cattccctcg 240

aataaacaat ataagctttt gactcctccc tccttctttc ttactacttt tagcatcatc 300

tatagttgaa gctggcgcag gaacaggctg aactgtatat ccccctctag ctggcaactt 360

agctcacgca ggggcttcag tagacctgac cattttttct ttacacttgg caggtgtctc 420

ctcaattcta ggggccatta actttattac aacaattatc aatataaaac cccctgccat 480

atcacaatat caaacccctc tattcgtgtg atccgtatta gtcactgctg tactactact 540

tctctcactc cctgtactag cagccggaat cacaatacta ttaacagacc gaaacctaaa 600

tacaaccttt tttgacccag caggaggcgg agatcctatt ctatatcaac acttgttc 658

<210> 4

<211> 1677

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

cactaacttg gttcttgtct ctgcatttgc cccttctggg gactccatgt gaatgtaatc 60

tttcagtacg tggcctcttg tgtatctttt tttaacacag gatgatgttt tcaaggttcc 120

tccaccttgc tgaatgtatt actttttgtc ttttaatttc aactttgaaa agatatatat 180

ttttctcatt attaaataat ttctaggttt attaaatctg cttttgtata tgagtgccat 240

ttaaacattt acttccacag taagatgcat gtcttaaatt gcatcaagta ataatatttc 300

acattttatt tggatcttta acacttaact ttaatggcta ggatgcagtt tacaggattg 360

acacatttga ctgaataaag ttaacctttg aagtttctac tatcattgca tcataagaca 420

ttgcttaaat catgttttat ttttatgcag atcattttta tgaagcacaa gcattattta 480

aattatattt tcttaggaat tttggcatca cttttatgaa atcttggtga gacttatttt 540

tcatatgtta tgtccagtac aatatacagt tgttactcct atttttcaga tatggtttta 600

aaacttgtat aggggaagtc tcctcatatt ttattacatc aaaatactct atgaaaactt 660

ccaagtttgc cttatggatt tatttggaag agggcttcac ttatttcatt ttgtaaaccc 720

ttacttttca attttcccca gagtatgaaa tacaatataa aacaattgat ggctgcaatt 780

tagaaatttg gatttataaa gctttgttct tttagttttg tttagttttt gatcatctgt 840

tatttaaaag tgcagacgag agtgatggat attacatctg cacagcctac gcacctaaga 900

catcactcac ccccagcctc ccactttccc tactccccca tcctcaaaac aaaaagacaa 960

aaacccagtc cctttgaagt gttacattaa caccaagaaa ctgattgggt gctaaagtta 1020

tctgtttttt ccttttaatg ggacagtttt tatatctaat tttagttgct tctgagattg 1080

cctattaaat atgtgttagt atatgttagc attctgaaag tcgtcagcac atataataga 1140

attaccagtt attagctact ggaatactta tacagatttt tcagctgtac tttaagccga 1200

agtgaagaag ccgggatagt gattaacatg gatttggtat gtgtatacaa atatataaca 1260

ggatctggct gttttccatc tttttgttta agataacatt ctcttaacat tctcataacc 1320

ataaacaatt tgttaatatg tctgctgcac cttcatcctt tgaagtaaag gtatatgaaa 1380

ataacttcat aatgacaccg tttgtattat taagcaggtg ttagcgcctt cacaaattct 1440

aattagatgt aaacaaagaa gaaaacagag agttgatatc ctgttaagta gcgttttctt 1500

gagaaagagt aggttggtgg gtttgggctg actgccagga ggtattgagg ggaggtattg 1560

ggggcggaga aataaatatt tcactgcaaa ctttgcactg tcagtctctg gtaagaacaa 1620

cttatttaac agcacgataa tttttagaac gtttacatcg cttattactt cctcccc 1677

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

tactctgctt ggagaccac 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

gcttcagtag acctgtcc 18

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

ttgtatttag gtttcggtct gtt 23

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

ggactccatg tgaatgtaat ctttcagaac 30

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

gcattgctta aatcatgttt tattttaag 29

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 10

<400> 10

taacagatga tcaaaaacta aacaaaacta aa 32

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

agcttagcag ttacttccca tgc 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

cggctggact gtaaacatcg 20

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

taaactttca gggtgaccaa aaaatca 27

Claims (10)

1.检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸的物质在制备检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿产品中的应用：

所述COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸如下：

所述COI基因的核苷酸为序列3，且目标位点为第391位，该位点的目标核苷酸为C；

所述COI基因的位点为核苷酸序列1，且目标位点为第106位，该位点的目标核苷酸为C；

所述SRY基因的位点为核苷酸序列4，且目标位点为第69位，该位点的目标核苷酸为C；

所述SRY基因的位点为核苷酸序列2，且目标位点为第446位，该位点的目标核苷酸为G。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为如下：

1)检测COI基因位点的引物组和检测SRY基因位点的引物组；

所述检测COI基因位点的引物组由序列5所示的引物、序列6所示的引物和序列7所示的引物组成；

所述检测SRY基因位点的引物组由序列8所示的引物、序列9所示的引物和序列10所示的引物组成；

2)含有所述检测COI基因位点的引物组的PCR试剂和含有所述检测SRY基因位点的引物组的PCR试剂；

3)含有1)或2)的试剂盒。

3.用于检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的产品，为检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸的物质。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：

所述检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸的物质为如下1)-3)中任一种：

1)用于检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的成套引物，包括权利要求1或2所述检测COI基因位点的引物组和所述检测SRY基因位点的引物组。；

2)用于检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的试剂，包括含有所述检测COI基因位点的引物组的PCR试剂和含有所述检测SRY基因位点的引物组的PCR试剂；

3)含有1)或2)的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述成套引物还包括用于扩增COI基因的特异引物组和用于扩增SRY基因的特异引物组；

所述用于扩增COI基因的特异引物组由序列13所示的引物和序列14所示的引物组成；

所述用于扩增SRY基因的特异引物组由序列11所示的引物和序列12所示的引物组成。

6.根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于：每个所述引物组中的各条引物均为等摩尔混合。

7.根据权利要求4-6中任一所述的产品，其特征在于：

所述含有检测COI基因位点的引物组的PCR试剂包括所述检测COI基因位点的引物组DNA聚合酶和反应缓冲液；

所述含有检测SRY基因位点的引物组的PCR试剂包括所述检测COI基因位点的引物组DNA聚合酶和反应缓冲液。

8.一种检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的方法，包括如下步骤：

1)用权利要求5-7任一中的所述用于扩增COI基因的特异引物和用于扩增SRY基因的特异引物分别扩增待测样本，得到COI基因的特异片段和SRY基因的特异片段；

2)用权利要求4-7任一中的所述检测COI基因位点的引物组和所述检测SRY基因位点的引物组分别对所述COI基因的特异片段和SRY基因的特异片段进行多重PCR扩增，得到扩增COI的多重PCR体系的扩增产物和扩增SRY的多重PCR体系的扩增产物；

检测扩增COI的多重PCR体系的扩增产物和扩增SRY的多重PCR体系的扩增产物：

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到222-242bp的扩增产物，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到793-813bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于梅花鹿；

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到508-528bp的扩增产物，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到415-435bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于马鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于马鹿；

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到222-242bp的特异片段，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到415-435b bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为梅花鹿，父本为马鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于母本为梅花鹿父本为马鹿的杂交鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到508-528bp的扩增产物，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到793-813bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为马鹿，父本为梅花鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于母本为马父本为梅花鹿的杂交鹿。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述检测扩增COI的多重PCR体系的扩增产物和扩增SRY的多重PCR体系的扩增产物：

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到232bp的扩增产物，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于梅花鹿；

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的扩增产物，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到425bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于马鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于马鹿；

若所述扩增COI的多重PCR体系扩增得到232bp的特异片段，且所述扩增SRY的多重PCR体系扩增得到425bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为梅花鹿，父本为马鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于母本为梅花鹿父本为马鹿的杂交鹿；

若扩增COI的多重PCR体系扩增得到518bp的扩增产物，且扩增SRY的多重PCR体系扩增得到803bp的扩增产物，则该待测样本来源于或候选来源于梅花鹿和马鹿杂交鹿，且该杂交鹿的母本为马鹿，父本为梅花鹿，反之，则该待测样本不来源或候选不来源于母本为马父本为梅花鹿的杂交鹿。

10.一种检测待测样本为梅花鹿或马鹿或其杂交鹿的方法，包括如下步骤：

检测待测样本基因组中COI基因和SRY基因对应基因序列中是否含有目标位点及该位点的目标核苷酸：

所述COI基因和SRY基因对应基因序列中的目标位点及该位点的目标核苷酸如下：

所述COI基因的核苷酸为序列3，且目标位点为第391位，该位点的目标核苷酸为C；

所述COI基因的位点为核苷酸序列1，且目标位点为第106位，该位点的目标核苷酸为C；

所述SRY基因的位点为核苷酸序列4，且目标位点为第69位，该位点的目标核苷酸为C；

所述SRY基因的位点为核苷酸序列2，且目标位点为第446位，该位点的目标核苷酸为G；

若所述待测样本基因组中的COI基因的核苷酸序列为序列3且第391位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列4且第69位的核苷酸为C，则该待测样本为梅花鹿；反之，则该待测样本不为梅花鹿；

若所述待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列1且第106位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列2且第446位的核苷酸为G，则该待测样本为马鹿；反之，则该待测样本不为马鹿；

若所述待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列3且第391位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列2且第446位的核苷酸为G，则该待测样本为杂交鹿，且母本为梅花鹿，父本为马鹿；反之，则该待测样本不为母本为梅花鹿父本为马鹿的杂交鹿；

若所述待测样本基因组中的COI基因核苷酸序列为序列1且第106位的核苷酸为C，且SRY基因核苷酸序列为序列4且第69位的核苷酸为C，则该待测样本为杂交鹿，且母本为马鹿，父本为梅花鹿；反之，则该待测样本不为母本为马鹿父本为梅花鹿的杂交鹿。