CN109735646A - 一种鉴定水稻品种的caps分子标记和方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定水稻品种的CAPS分子标记和方法及其应用。所述CAPS分子标记在粳稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了一种用于检测上述CAPS分子标记的引物组，其序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示。本发明所提供的CAPS分子标记特异性高，能方便准确的地将水稻栽培品种进行籼稻和粳稻的种质资源区分。本发明提供的CAPS分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，成本低、通量高、特异性高，适用于生产实践。

Description

一种鉴定水稻品种的CAPS分子标记和方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种鉴定水稻品种的CAPS分子标记和方法及其应用。

背景技术

水稻种植品种主要为亚洲栽培稻，又根据一系列表型差异分为籼稻(Oryzasativa subsp Indica)和粳稻(Oryza sativa subsp Japanica)，我国根据不同地域种植条件和生产需求，发展培育了上千种籼稻和粳稻品种。要保证高产稳产，水稻品种的种子纯度是最关键的因素之一。传统上鉴定水稻品种纯度，在幼苗期、抽穗期、腊熟期等不同生育期进行。鉴定的性状主要有三个方面，即植株性状、穗部性状与谷粒性状，但在实际生产应用上受鉴定者的经验影响极大。而且随着现代育种发展，部分品种的表型性状与经典的籼稻粳稻差异较大，例如部分粳稻的谷粒不是阔而短，较厚，呈椭圆形或卵圆形而是偏向于谷粒狭长等。因此，在生产实践中，有必要寻找快速精确鉴定籼稻、粳稻差异的方法。针对水稻遗传信息DNA序列在籼稻和粳稻间的遗传差异进行分子标记鉴定是高效准确的方法。SNP(single nucleotide polymorphism)标记以及根据SNP标记发展出的CAPS分子标记(cleaved amplified polymorphic sequence)技术能够获得其它分子标记技术不能显示的更加丰富的多态性(Rafalski A.Applications of single nucleotide polymorphismsin cropgenetics.Curr Opin Plant Biol，2002，5(2)94～100)。因此，有必要寻找一种新的CAPS分子标记用于鉴定不同水稻品种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服传统水稻籼稻和粳稻品种鉴别技术存在的缺陷和不足，提供一种能快速、准确鉴定水稻是否为籼稻或者粳稻品种的CAPS分子标记，本发明提供的CAPS分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，成本低、通量高、特异性高，适用于生产实践中。

本发明的目的在于提供一种水稻MAIF1基因的特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1。

本发明的另一目的在于提供上述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测上述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1的引物组。

本发明的另一目的在于提供上述引物组在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法。

本发明的另一目的在于提供上述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述方法在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种水稻MAIF1基因的特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1，其在粳稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明克隆了众多水稻品种的MAIF1-SNP1，通过对克隆的DNA序列进行ClustalW分析发现，粳稻品种和普通野生稻序列克隆的序列全部相同，籼稻品种和Nivara野生稻序列克隆的序列全部相同。而籼稻和粳稻序列相比，存在一个T←→C的SNP位点差异。粳稻在该位点旁邻序列具有限制性内切酶BsrF I酶切识别位点：GCCGGC，而籼稻在该酶切识别位点的SNP突变GTCGGY造成无法被限制性内切酶BsrF I酶切识别，因此在BsrF I 酶切识别以上PCR克隆片段后，粳稻片段被酶切为199bp大小的DNA片段，而籼稻仍保持394bp大小的DNA片段。以上结果表明，可利用特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1 来鉴别水稻品种。

因此，上述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用亦在本发明保护范围内。

本发明还提供了一种用于检测上述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1的引物组，所述引物组的序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示。

上游引物：5’-CCGGGAGGACGTACGGCG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物：5’-CCGGTGGAGGCGTCGATC-3’(SEQ ID NO：4)。

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物可作为CAPS分子标记引物，用于鉴定水稻品种。因此，所述引物组在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用亦在本发明保护范围内。

本发明还提供了一种鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法，包括如下步骤：

S1.提取水稻样本基因组DNA；

S2.以权利要求3所述引物组对步骤S1基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将步骤S2的PCR产物经BsrF I酶切后电泳，得到CAPS分子标记；

S4.电泳结果判断：若得到394bp的电泳条带，则该水稻样本为籼稻；若得到199bp的电泳条带，则该水稻品种为粳稻。

优选地，所述PCR反应体系为10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶5U，基因组DNA模板0.2μg，10×PCR Buffer 10μL，去离子水补充至 100μL。

优选地，所述PCR反应条件为95℃预变性2min；95℃15sec，52℃20sec，72℃30sec，共30个循环；72℃延伸5min。

优选地，步骤S3中BsrF I酶的酶切位点为水稻MAIF1-SNP1的基因片段序列第199bp 处。

上述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1还可以用来检测鉴定水稻亲本纯合度，因此，所述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用亦在本发明保护范围内。

同时，上述鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用亦在本发明保护范围内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的CAPS分子标记特异性高，能方便准确的地将水稻栽培品种进行籼稻和粳稻的种质资源区分。同时，本发明提供的CAPS分子标记在实际应用中，只需PCR 结合酶切，成本低、通量高、特异性高，适用于生产实践。

附图说明

图1为CAPS分子标记引物PCR扩增和BsrF I酶切结果电泳图。其中，籼稻品种1～ 7分别为93-11，矮脚南特，广陆矮4号，珍汕97，明恢63，黄丝占，黄华占；粳稻品种 1～7分别为日本晴，台中65，中花11，农垦58，云粳23号，鄂晚3号，晋稻1号。对以上不同品种的PCR扩增产物进行BsrF I酶切，结果为籼稻和Nivara野生稻片段不能被酶切，而粳稻品种和普通野生稻片段被酶切为199bp的DNA片段。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1鉴别水稻的CAPS分子标记MAIF1-SNP1及检测引物

本发明人前期研究发现，水稻中存在着一种分子标记MAIF1-SNP1，其在粳稻中的序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示，均为394bp，且存在一个T←→C的SNP位点差异，推测可利用上述分子标记去鉴定水稻籼稻和粳稻品种。分析发现，由于粳稻在该SNP位点旁邻序列具有限制性内切酶BsrF I酶切识别位点： GCCGGC，而籼稻在该酶切识别位点的SNP突变GTCGGY造成无法被限制性内切酶BsrF I酶切识别，因此可通过CAPS分子标记方法去检测鉴定水稻籼稻和粳稻品种，当用BsrF I酶切识分子标记MAIF1-SNP1后，粳稻品种会被酶切为199bp大小的DNA片段，而籼稻仍保持394bp大小的DNA片段，由此来鉴定水稻的籼稻和粳稻品种。

同时，通过比对CAPS分子标记MAIF1-SNP1在粳稻和籼稻中的序列，设计了如下PCR扩增引物组作为CAPS标记引物：

上游引物：5’-CCGGGAGGACGTACGGCG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物：5’-CCGGTGGAGGCGTCGATC-3’(SEQ ID NO：4)。

PCR反应体系为10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶5U，基因组DNA模板0.2μg，10×PCR Buffer 10μL，去离子水补充至100μL。

PCR反应条件为95℃预变性2min；95℃15sec，52℃20sec，72℃30sec，共30个循环；72℃延伸5min。

实施例2鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法

本发明用于鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法的实验材料包括普通野生稻和Nivara野生稻；籼稻品种分别为93-11，矮脚南特，广陆矮4号，珍汕97，明恢63，黄丝占，黄华占；粳稻品种分别为日本晴，台中65，中花11，农垦58，云粳23号，鄂晚3号，晋稻1 号。具体步骤如下：

1、水稻样本基因组DNA提取

(1)取水稻叶片约0.5g，把叶片剪碎，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉末后，放入2mL离心管中，加入800μL 2×CTAB抽提缓冲液，混匀，65℃水浴30min；

(2)加入等体积的氯仿，异戊醇和无水乙醇(76：4：20)，振荡10min，充分混匀；

(3)在12000转/分的条件下离心12min，将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入其0.6倍体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，混匀，12000转/分离心2min，去上清，用 0.5mL70％的乙醇漂洗两次，风干，溶于100～200μL 0.5×TE缓冲液中；

(4)取1μL用于后续的PCR扩增反应。

2、PCR扩增反应

以实施例1的CAPS标记引物对上述水稻样本基因组DNA进行扩增。

所述PCR反应体系为10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶5U，基因组DNA模板0.2μg，10×PCR Buffer 10μL，去离子水补充至100μL。

所述PCR反应条件为95℃预变性2min；95℃15sec，52℃20sec，72℃30sec，共 30个循环；72℃延伸5min；随后于4℃保存备用。

3、酶切

对上述水稻样本的PCR扩增产物用BsrF I酶切，酶切后的PCR扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录。

4、结果与分析

对16个不同水稻材料基因组DNA进行PCR扩增，均能扩增出非常清晰的单一条带，分为2组各8个样品条带大小相同，经3次重复，结果稳定一致(如图1所示)。经过正反序列测定，16个PCR产物长度均为394bp；并且，PCR扩增所用的引物全部在两端被正确测出。其中，粳稻品种和普通野生稻序列见序列均如SEQ ID NO：1所示，籼稻和 Nivara野生稻序列均如SEQ ID NO：2所示。

在BsrF I酶切识别以上PCR片段后，粳稻片段被酶切为199bp大小的DNA片段，而籼稻仍保持394bp大小的DNA片段(如图1所示)，因此本发明的CAPS分子标记方法可用来鉴定水稻籼稻和粳稻品种。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种鉴定水稻品种的CAPS分子标记和方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 394

<212> DNA

<213> 粳稻(Oryza sativa subsp Japanica)

<400> 1

ccgggaggac gtacggcgtc cgtggctacg gcggccgctc ctggctcgtc atgggcggcg 60

cgtgccagga gcacctcgtc accaccgtgg acctctccac gacggcgctg tacaacccgc 120

tcaccgggga gcgcctcgcg ctgccccccg cgccgtaccc gcagtggcgc cacggcgtcg 180

tccacgtcgt ggccgccggc cgccgccgcg gcggcgctcc cctggtggtg aacgcatcca 240

cgaggacggg gcacttcggg tactgccgcc agggggatac caagtggacc ctggtcgacg 300

ggcgccagga catgggccac cgcgcgtacc acggcgggcg gttctacgtc aacacaaacg 360

cgcaggagac gctggtgatc gacgcctcca ccgg 394

<210> 2

<211> 394

<212> DNA

<213> 籼稻(Oryza sativa subsp Indica)

<400> 2

ccgggaggac gtacggcgtc cgtggctacg gcggccgctc ctggctcgtc atgggcggcg 60

cgtgccagga gcacctcgtc accaccgtgg acctctccac gacggcgctg tacaacccgc 120

tcaccgggga gcgcctcgcg ctgccccccg cgccgtaccc gcagtggcgc cacggcgtcg 180

tccacgtcgt ggccgtcggc cgccgccgcg gcggcgctcc cctggtggtg aacgcatcca 240

cgaggacggg gcacttcggg tactgccgcc agggggatac caagtggacc ctggtcgacg 300

ggcgccagga catgggccac cgcgcgtacc acggcgggcg gttctacgtc aacacaaacg 360

cgcaggagac gctggtgatc gacgcctcca ccgg 394

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

ccgggaggac gtacggcg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

ccggtggagg cgtcgatc 18

Claims (9)

1.一种水稻MAIF1基因的特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1，其特征在于，所述MAIF1-SNP1在粳稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用。

3.一种用于检测权利要求1所述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1的引物组，其特征在于，所述引物组的序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示。

4.权利要求3所述引物组在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用。

5.一种鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取水稻样本基因组DNA；

S2.以权利要求3所述引物组对步骤S1基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将步骤S2的PCR产物经BsrF I酶切后电泳，得到CAPS分子标记；

S4.电泳结果判断：若得到394bp的电泳条带，则该水稻样本为籼稻；若得到199bp的电泳条带，则该水稻品种为粳稻。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述PCR反应体系为10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶 5U，基因组DNA 模板0.2μg，10×PCR Buffer10μL，去离子水补充至100μL。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述PCR反应条件为95℃ 预变性2min；95℃15sec，52℃ 20sec，72℃ 30sec，共30个循环；72℃ 延伸5min。

8.权利要求1所述特异性CAPS分子标记MAIF1-SNP1在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用。

9.权利要求5～7任一项所述方法在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用。