CN101386858A - 水稻株型相关基因rl10及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种水稻株型相关基因RL10及其应用。所说的水稻基因RL10，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。它编码F－box蛋白，控制水稻叶片的极性发育和穗部的形态建成。利用该基因能改良现有品种的株型、穗型，提高产量，在水稻高产育种中具有广阔的应用前景。

Description

水稻株型相关基因RL10及其应用

技术领域

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种水稻株型相关基因RL10及其应用。

背景技术

水稻优异基因资源的发掘是超高产育种的物质基础，研明控制水稻株型和产量相关基因的功能对水稻育种具有重要的推动作用。本研究在自己创建的突变体库中筛选到一个株型和产量性状发生突变的材料(rl10)，采用图位克隆策略，克隆了Rl10基因，获得了该基因的编码序列。该基因的克隆和功能分析在水稻中是首次报道，不仅在水稻发育中具有重要作用，而且在水稻高产育种具有重要的利用价值。

F-box蛋白含有F-box基序(motif)，是SCF复合体的一个亚基，它决定底物识别的特异性。SCF复合体是一种非常重要的E3泛素连接酶，SCF名称来源于3个亚基：Skp1、Cul1和F-box蛋白，因此，F-box蛋白质介导的泛素化蛋白质降解途径可能与植物基因表达调控有重要联系。目前，从各种植物中已鉴定出大量的F-box蛋白质，它们参与了植物激素(乙烯，生长素，GA，JA)的信号传导、自交不亲和和花器官发育等生物学过程以及植物的胁迫反应。在拟南芥中一个F-box蛋白TIR1是生长素的受体，它介导一系列生长素反应。但至今没有关于F-box蛋白具有调控叶片极性发育的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一个水稻新基因RL10，它既能提高产量又能控制优良株型。

所说的水稻基因RL10，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。

粳稻品种中花11通过辐照获得卷叶突变体rl10(rolling leaf 10)，本发明利用该突变体与籼稻品种Dular杂交配置F₂群体，采用图位克隆的方法分离了RL10基因，并通过互补和RNA干涉试验验证了候选基因，最终证实RL10基因编码F-box蛋白，控制水稻叶片的极性发育和穗部的形态建成。

本发明所克隆的RL10基因功能丧失后，植株整体株型紧凑，长势稳健，茎杆更加粗壮，叶片表现半卷，剑叶挺举(图1)，光合作用效率提高，同时一次枝梗数、二次枝梗数以及每穗粒数显著增多(图2)，单株产量相比对照提高了10～20％。

该基因在水稻高产育种中具有广阔的应用前景。利用途径有二：第一，直接通过回交方法，将本发明中的rl10突变体所携带的rl10基因导入高产品种中，改良现有品种的株型、穗型等；第二：采用RNA干涉途径，将现有高产品种中的RL10基因沉默，获得rl10突变体的表型。

附图说明

图1是水稻中花11及其突变体rl10的植株形态

图2是水稻中花11及其突变体rl10的穗部形态

图3.RL10基因的图位克隆及rl10-1和rl10-2的突变位点

A)RL10在第2染色体的连锁图谱。竖线表示分子标记的位置，遗传距离(厘摩，cM)标在图谱下方相邻的标记之间，图谱右侧的数字表示定位用的群体大小；

B)RL10的精细定位。物理图谱下方的数字表示所用标记在F₂或F₃群体中检测到的交换个体数。覆盖RL10的物理图谱以10个PAC构建，注册号分别为：BAC1：AP004875；BAC2：AP006844；BAC3：AP004801；BAC4：AP005803；BAC5：AP006160；BAC6：AP005777；BAC7：AP005631；BAC8：AP005924；BAC9：AP004683；BAC10：AP005428。

利用F₃群体中的66株隐性个体，将RL10定位在f70和f87之间38-kb的区段上，与f66和f85共分离；

C)在38-kb的定位区间内有5个基因(TIGR网站的基因预测结果)；

D)RL10在AP006160上的位置及两突变体的突变位点。RL10基因不含内含子。rl10-1和rl10-2突变序列标示在底部，rl10-1发生了1个单核苷酸替换(T→C)，rl10-2在终止子前缺失了两个碱基。

具体实施方式

中花11：(Plant Molecular Biology，2008，68：239-250)，来自中国农科院。

籼稻品种Dular：(遗传学报，2000，27(5)：409～417)

pCAMBIA1301-ubi：购自Takara公司

农杆菌EHA105：购自Takara公司

pCAMBIA1300：购自Takara公司

实施例1：

0.材料的获得

1999年，利用同位素⁶⁰Co辐射中花11成熟种子，在M1代中筛选得到卷叶突变体2个，分别命名为rl10-1和rl10-2。该突变体与野生型(WT)品种中花11相比，叶片变卷，每穗粒数增多，茎杆更加粗壮，剑叶挺举(图1)。。

1 基因的初步定位

用rl10-1×Dular的F₂群体作为初步定位群体。由于在这个F₂群体中出现了一些介于双亲中间类型的个体，因此取样时结合了突变体的另一个标志性状——密穗，即所取单株兼具卷叶和密穗两种表型特征作为指标。rl10-1×Dular的F₂群体共200株，收取其中表型与突变体相似、性状准确的单株27株，由这27株隐性个体组成初步定位群体。

由于rl10-1突变体与rl9-1突变体都来源于中花11背景，因此直接利用rl9-1突变体与Dular筛选出来的多态性标记(Plant Molecular Biology，2008，68：239—250)，分析初定群体中的8个单株，发现第2染色体上的微卫星标记RM424和RM475与RL10表现连锁，进而利用这两个标记对27个单株进行分析，分别检测到5和11个交换株。根据网站(http://www.gramene.org/db/markers/marker_view？action＝view_map_sets)提供的SSR遗传图谱发现，RM424位于短臂，RM475位于着丝点附近的长臂上，因此推测RL10很可能位于第2染色体的短臂一端。

由于在短臂上没有找到其它多态SSR标记，于是我们在短臂上、基因可能存在的区段内每隔1Mb发展一些标记，共设计了32个STS标记用于初步定位，其中有14个在两亲本间有多态，利用这14个多态标记对27个单株进行分析。

用MAPMAKEER3.0软件对这些标记分析的结果进行分析，把RL10基因初步定位在f24和RM424之间，与两标记的遗传距离分别为7.4cM和9.3cM(图3A)。

2 RL10基因的精细定位

我们从rl10-1×Dular F₂自交得到的97个F₃分离株系中收获了近2000株隐性个体，先提取了66株个体的DNA用作基因的精细定位。

在基因初步定位所限定的两个标记f24和RM424之间，密集发展了STS标记进行精细定位。利用在亲本间有多态的标记对66株个体进行检测，很幸运，在AP006160上找到了2个与RL10表现共分离的标记：f66和f85，它们两侧的两个标记f70和f87分别检测到2和1个交换株，这四个标记在AP006160上的顺序是f70-f66-f85-f87，因而将RL10定位在f70和f87之间，它们相距约38kb，以此构建了覆盖卷叶基因RL10的物理图谱(图3B)。

3 两突变基因等位性分子水平的检测

利用精细定位中与rl10-1共分离的标记f66和f85检测组合rl10-2×Dular F₂群体中选得的30株隐性个体，结果表明，这两个标记与rl10-2也表现共分离，因而推测这两个卷叶突变基因可能等位。

4 基因预测及序列测定

根据TIGR网站(http://www.tigr.org/tdb/e2kl/osal/irgsp.shtml)的基因预测结果，在RL10所在的区段上存在五个候选基因(图3C)，基因1和3编码假设蛋白，基因2编码F-box蛋白，基因4和5编码未知蛋白，其中基因2和4有cDNA支持。对这五个基因在两个突变体和野生型品种中的测序结果分析发现，F-box基因在rl10-1和rl10-2中均发生了突变，其它四个基因未发现序列差异。变异表现为：在rl10-1的编码区中发生了一个单碱基替换，T→C，导致一个丝氨酸突变成脯氨酸；rl10-2中在终止密码子前发生了两个碱基的缺失，导致翻译滞后终止(图3D)。测序结果进一步证实了两突变基因等位，因此本研究将该F-box基因确定为RL10的候选基因。

5 RL10基因编码区的验证

虽然RL10的候选基因——F-box基因在数据库中有两条cDNA(注册号：AK073921和AK064350)支持，但是不同网站或软件预测的编码区仍存在差异，在AP006160上，水稻基因组自动注释系统(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)预测的基因编码区位于82839-84056，无内含子，长1218bp，预测编码405个氨基酸，利用Fgenesh软件预测的结果跟它一致；TIGR预测的基因存在两个外显子，分别位于81630-81919和82799-84056，编码区长1548bp，预测编码515个氨基酸。

由于编码区的正确获得在基因功能分析中十分重要，因此有必要验证TIGR网站预测基因的第一个外显子是否存在。为此我们根据其预测的编码区序列设计了两对引物，F72f/F72r和F73f/F73r，产物均含有预测的内含子，分别以野生型品种中花11叶片的总DNA和幼叶的cDNA第一条链为模板，进行PCR扩增，以F68(83089-83621)作cDNA模板扩增的对照，电泳结果发现，F68在cDNA中能扩出预期533bp的条带，证明cDNA可用作PCR模板，F72和F73两个标记在gDNA中都能扩出特异的预期大小的片段，分别为1518bp和1168bp，而在cDNA中无产物(图3.3)，由此表明，TIGR预测的第一个外显子不存在。

进一步将数据库中的两条cDNA序列进行分析发现，这个F-box基因的真实起始密码子较水稻基因组自动注释系统预测的基因还提前9个核苷酸，即位于82830处，因此RL10基因的最终位置确定为82830-84056(图3.2D)，长1227bp，编码408个氨基酸(图3.4)。

6 RNAi试验

本发明选取RL10基因533bp(从该基因起始密码子开始至下游533bp区域)的编码片段构建干扰载体，该片段避开了F-box基序，且经全基因组比对分析确认该片段在水稻基因组中无其它同源序列。将目的片段连接到载体ihpRNA上形成发夹结构，然后切下该发夹结构连接到改造过的带有Ubi启动子的载体pCAMBIA1301-ubi上，构建成表达载体RL10-Ri。将质粒RL10-Ri通过热击导入农杆菌EHA105，转化野生型品种中花11幼胚。T₀代获得了RNA干扰表型的转基因植株，T₁代发生3：1(正常：突变)分离，所有突变株表型均类似rl10突变体，叶片挺举，株型优良，而且每穗粒数明显增多。

RNA干扰片段引物：

Filf：5′-TGT

AAATGGTGCCTCAGAAGC-3′

Filr：5′-GGTGAGAAGACAATGGCGATG-3′

Fi2f：5′-GT

AAATGGTGCCTCAGAAGC-3′

Fi2r：5′-GAAC

GAAGACAATGGCGATG-3′

Fi1的前后引物5′端分别加BamHI和Spe I接头，Fi2的前后引物5′端分别加Bgl II和Xba I接头，PCR扩增片段大小均为533bp。

7 互补试验

将F-box基因起始密码子上游2.5Kb，终止密码子下游1Kb所覆盖的区段(共计4.7Kb)，利用限制性内切酶从BAC克隆AP006160上切下，连接到表达载体pCAMBIA1300上，通过农杆菌介导转化突变体rl10-1。共获得独立转化子32个。所有转化子都恢复了野生型品种中花11的表型。证实了F-box基因即为RL10的候选基因。

SEQUENCE LISTING

<110>扬州大学

<120>水稻株型相关基因RL10及其应用

<160>1

<210>1

<211>1227

<212>mRNA

<213>水稻(Oryza sativa L)

<400>1

atgctggcaa tggggtcaga ggagtgggag ttgtatccat cttccttcat tggtgctcag        60

gtcatagatt atgggcatgt ttctggagac atggatgatg atcagagtgg agacttggcc       120

gtgtcgatgg acgccgttct ccctgatgat cttttagaaa aggtcctctc cttcttgcct       180

gttgcaagtg tcataagatc tggatctgtt tgcaagagat ggcatgagat tgtgcatgcc       240

cggaggcaga catggagcaa aatggtgcct cagaagcctt ggtacttcat gtttacctgc       300

agcgaggaag cggtctcggg gttcacctat gacccgagcc tgcgtaagtg gtatggattc       360

gacttccctt gcattgagaa gaccacctgg tcgatttcct catcgtccgg gttggtgtgt       420

ctgatggaca gtgaggatag gagccgcatc atcgtgtgca acccaataac taaggactgg       480

aagaggcttg ttgatgctcc tggtggcaag tcggctgatt acagtgctct cgccatttct       540

gtgaccagga cctctcatca gtacatggtg gctgttgcaa ggtgcaacca ggtgccatca       600

gagtattatc aatgggagtt caccatccat ttgtacgagt cagagataaa tacatgggtg       660

tctcccttca ctgaactatt gattggatgg cgaggaggtg atgagtgcgt gatctgtgat       720

ggggtcctct actatctggt gtactcaaca ggagttttgg tgaataacaa cgagcatcgc       780

cattgtcttc tcatgtatga cctatctacc aggcctactc acacttcttt gatgagcatg       840

gctataccag tgccgtgccc tcttacatgt ggccgtttga tgaacctcaa tgagaggctt       900

gtcttggttg ggggcattgg caagcaagat aggcctggta tcatcaaggg aattggcatc       960

tgggagctcc ggaacaagga gtggcatgag gttgctcgaa tgcctcacaa gtttttccaa      1020

ggatttggcg agttcgatga tgtttttgca agctgtgggg cggatgacct tatctatatt      1080

cagagctatg ggtcaccggc cctcctcaca tttgaattaa accagaagct gtggaaatgg      1140

tcactgaaga gccctgtgac gaagaggttt cctctgcagc tgtttactgg tttctctttt      1200

gagcctaggc tggacattgc ttcctag                                          1227

Claims (3)

1、一种水稻基因RL10，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。

2、权利要求1所述的水稻基因RL10编码F-box蛋白，控制水稻叶片的极性发育和穗部的形态建成。

3、权利要求1所述的水稻基因RL10在水稻高产育种中的应用。

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